XVII. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ KONTAKTNÍ TOXICITY PRO VČELU MEDONOSNOU – metoda C.17 podle přílohy směrnice 2001/59/ES

XVII.1 METODA
Tato zkouška akutní toxicity je replikou metody OECD TG 214 (1998).

XVII.1.1 ÚVOD
Tato zkouška toxicity je laboratorní metodou určenou k posouzení akutní kontaktní toxicity přípravků na ochranu rostlin a jiných chemických látek pro dospělou dělnici včely medonosné.
Při posuzování a hodnocení toxických charakteristik látek může být nezbytné stanovení akutní kontaktní toxicity pro včelu medonosnou, např. může-li dojít k expozici včel dané chemické látce. Zkouška akutní kontaktní toxicity se provádí s cílem stanovit vlastní toxicitu pesticidů a jiných chemických látek pro včely. Výsledky této zkoušky by měly být použity pro formulování potřeby dalšího posuzování. Tato metoda může být použita zejména ve stupňovaných programech hodnocení nebezpečnosti pesticidů pro včely založených na postupném přechodu od laboratorních zkoušek k semi-polním experimentům (1). Pesticidy mohou být zkoušeny ve formě účinné látky (ú. l.) nebo ve formě formulovaných přípravků. K ověření citlivosti včel a přesnosti zkušebního postupu se použije referenční látka.

XVII.1.2 DEFINICE
Akutní kontaktní toxicita: je nepříznivý účinek, ke kterému dojde nejpozději do 96 h od lokální aplikace jedné dávky zkoušené látky.
Dávka: je množství aplikované zkoušené látky. Dávka se vyjadřuje v hmotnosti (µg) zkoušené látky na jednoho zkušebního živočicha (µg na včelu).
LD₅₀ (střední letální dávka) kontaktně: je statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, která může po kontaktní aplikaci způsobit úhyn 50 % jedinců. Hodnota LD₅₀ se vyjadřuje v µg zkoušené látky na jednu včelu. U pesticidů muže být zkoušenou látkou buď účinná látka (ú. l) nebo formulovaný přípravek obsahující jednu nebo více účinných látek.
Mortalita: jedinec se považuje za uhynulý, je-li zcela nepohyblivý.

XVII.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Dospělé dělnice včely medonosné (Apis mellifera) se exponují řadě dávek zkoušené látky rozpuštěné ve vhodném nosiči přímou aplikací na hrudník (jako kapičky). Zkouška trvá 48 h. Jestliže mortalita v průběhu 24 a 48 h roste, zatímco kontrolní mortalita zůstává na přijatelné úrovni, tj. ≤ 10 %, je vhodné zkoušku prodloužit na maximálně 96 h. Mortalita se zaznamenává denně a porovnává se s kontrolními hodnotami. Výsledky zkoušky se analyzují s cílem vypočítat LD₅₀ pro 24 h a 48 h a v případě prodloužené studie pro 72 h a 96 h.

XVII.1.4 VALIDITA ZKOUŠKY
Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:
— průměrná mortalita u všech kontrolních skupin nesmí na konci zkoušky překročit 10 %,
— LD₅₀ pro referenční standard odpovídá specifikovanému rozsahu.

XVII.1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

XVII.1.5.1 Výběr včel
Použijí se mladé dospělé včely dělnice z téhož plemena, tj. včely stejného stáří, stejně krmené, stejného druhu atd. Včely by měly být získány z přiměřeně krmeného, zdravého včelstva s matkou, pokud možno bez nemocí a se známou anamnézou a fyziologickým stavem. Měly by být vybrány ráno v den zkoušky nebo by měly být vybrány večer před zkouškou a drženy v podmínkách zkoušky do příštího dne. Vhodné jsou včely z plástů bez plůdků. Včely by neměly být vybírány brzy na jaře nebo pozdě na podzim, neboť se během těchto období fyziologicky mění. Musí-li být zkoušky provedeny brzy na jaře nebo pozdě na podzim, měly by se včely vylíhnout v inkubátoru a měly by být živeny plástovým pylem (pyl sebraný z plástu) a cukrovým roztokem. Včely ošetřované chemickými látkami, jako jsou antibiotika a prostředky proti varoáze, by neměly být použity pro zkoušky toxicity po čtyři týdny od konce posledního ošetření.

XVII.1.5.2 Podmínky chovu a krmení
Použijí se snadno čistitelné a dobře větrané klícky. Lze použít jakýkoli vhodný materiál, např. klícky z korozivzdorné oceli, pletiva, plastu nebo jednorázové dřevěné klícky atd. Velikost zkušebních klícek by měla vyhovovat počtu včel, tj. klícky by měly poskytovat dostatek prostoru. Nasazují se pokud možno skupiny po 10 včelách.
Včely by měly být drženy v temnu v experimentální místnosti při teplotě 25 ± 2 °C. Po dobu zkoušky se zaznamenává relativní vlhkost, která je obvykle 50 – 70 %. Obsluha, včetně exponování a pozorování, může být prováděna za (denního) světla. Jako potrava se používá vodný roztok cukru o konečné koncentraci 500 g∙l^-1 (50% (m/V)) a podává se za použití včelího krmítka po dobu zkoušky podle libosti. Lze použít skleněnou trubičku (přibližně 50 mm dlouhou, s průměrem 10 mm, zúženou na otevřeném konci na průměr asi 2 mm).

XVII.1.5.3 Příprava včel
Shromážděné včely mohou být za účelem aplikace zkušební látky narkotizovány oxidem uhličitým nebo dusíkem. Množství anestetika v době expozice by mělo být minimalizováno. Včely v agónii se před zahájením zkoušky nahradí zdravými včelami.

XVII.1.5.4 Příprava dávek
Zkušební látka se aplikuje jako roztok v nosiči, tj. v organickém rozpouštědle nebo ve vodě se smáčedlem. Jako organické rozpouštědlo se upřednostňuje aceton, mohou však být použity i jiná rozpouštědla s nízkou toxicitou pro včely (např. dimethylformamid, dimethylsulfoxid). U formulovaných přípravků dispergovaných ve vodě a u silně polárních organických látek nerozpustných v organických nosičových rozpouštědlech lze aplikaci usnadnit jejich rozpuštění ve slabém roztoku komerčního smáčedla (např. smáčedla Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween).
Připraví se vhodné kontrolní roztoky, tzn. použijí-li se k rozpuštění zkušební látky rozpouštědlo nebo dispergátor, použijí se dvě samostatné kontrolní skupiny: roztok ve vodě a roztok s rozpouštědlem/nosičem.

XVII.1.6 POSTUP

XVII.1.6.1 Zkušební a kontrolní skupiny
Počet zkoušených dávek a jejich paralelních experimentů by měl splňovat statistické požadavky na stanovení LD₅₀ na hladině spolehlivosti 95 %. Zpravidla se pro zkoušku požaduje alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 2,2 a pokrývajících rozsah pro LD₅₀. Počet dávek se však stanoví s ohledem na směrnici křivky toxicity (dávka versus mortalita) a s ohledem na statistickou metodu zvolenou pro analýzu výsledků. Vhodné dávky je možné zvolit pomocí orientační zkoušky.
Každá zkušební koncentrace se podá alespoň třem paralelním zkušební skupinám o 10 včelách.
Vedle zkušebních skupin se nasadí alespoň tři kontrolní skupiny, každá o 10 včelách. Je-li použito organické rozpouštědlo nebo smáčedlo, zařadí se další tři kontrolní skupiny po 10 včelách pro rozpouštědlo a smáčedlo.

XVII.1.6.2 Referenční látka
V rámci zkušebních skupin musí být použita referenční látka. Vyberou se alespoň tři dávky pokrývající očekávanou hodnotu LD₅₀. Pro každou zkušební dávku se nasadí alespoň tři paralelní klícky po 10 včelách. Upřednostňovanou referenční látkou je dimethoát, pro nějž se uvádí LD₅₀, 24 h, kontaktně v rozmezí 0,10 – 0,30 µg účinné látky na včelu (2). Jsou však přijatelné i jiné referenční látky, pokud lze předložit dostatek údajů pro ověření očekávané reakce na dávku (např. parathion).

XVII.1.6.3 Expozice

XVII.1.6.3.1 Podávání dávek
U narkotizovaných včel se jednotlivě provede lokální aplikace. Včely se náhodně rozdělí do různých zkušebních a kontrolních skupin. Objem 1 µl roztoku obsahující zkušební látku ve vhodné koncentraci se aplikuje mikroaplikátorem na zádovou oblast hrudníku každé včely. Mohou být použity i jiné objemy, je-li to opodstatněné. Po aplikaci se včely umístí do zkušebních klícek a zásobí se cukerným roztokem.

XVII.1.6.3.2 Délka expozice
Zkouška má trvat nejlépe 48 h. Jestliže mortalita v průběhu 24 a 48 h roste, je vhodné zkoušku prodloužit na maximálně 96 h, pokud kontrolní mortalita nepřekračuje 10 %.

XVII.1.6.4 Pozorování
Mortalita se zaznamená po 4 h od aplikace a poté po 24 h a 48 h. Je-li nezbytné pozorování prodloužit, provedou se další vyhodnocení v 24hodinových intervalech až do maximálně 96 h, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepřekračuje 10 %.
Zaznamená se neobvyklé chování pozorované během doby zkoušky.

XVII.1.6.5 Limitní zkouška
V některých případech (např. očekává-li se u látky nízká toxicita) může být provedena limitní zkouška za použití 100 µg účinné látky na včelu s cílem prokázat, že LD₅₀ je vyšší než tato hodnota. Postupuje se stejným způsobem, včetně nasazení tří paralelních zkušebních skupin pro každou zkušební dávku, odpovídajících kontrolních skupin a použití referenční látky. Dojde-li k úhynům, musí se provést úplná studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky (viz bod 1.6.4), zaznamenají se.

XVII.2. DATA A ZPRÁVY

XVII.2.1 DATA
Data se shrnou do tabulky, přičemž se pro každou zkušební skupinu, kontrolní skupiny a skupiny s referenční látkou uvede počet použitých včel, mortalita v každém pozorovacím čase a počet včel s nepříznivě ovlivněným chováním. Údaje o mortalitě se analyzují vhodnými statistickými metodami (např. probitovou analýzou, klouzavým průměrem, proložením binomického rozdělení) (3, 4). Sestrojí se křivky závislosti dávka-reakce pro každý čas pozorování (tj. 24 h, 48 h a podle potřeby 72 h, 96 h) a vypočtou se směrnice křivek a střední letální dávky (LD₅₀) s 95% intervalem spolehlivosti. Korekce na mortalitu v kontrolních skupinách lze provést Abbottovou korekcí (4, 5). LD₅₀ se vyjádří v µg zkušební látky na včelu.

XVII.2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

XVII.2.2.1 Zkoušená látka
— fyzikální stav a fyzikálně-chemické vlastnosti (např. stálost ve vodě, tlak par),
— údaje o chemické identitě včetně strukturního vzorce, čistota, (tj. u pesticidů identita a koncentrace účinné látky (účinných látek)).

XVII.2.2.2 Testovací druh
— vědecký název, plemeno, přibližné stáří (v týdnech), metoda výběru shromáždění včel, datum výběru,
— informace o včelstvech použitých pro shromáždění testovacích včel, včetně informací o zdravotním stavu, nemocech dospělců, o případné přípravě atd.

XVII.2.2.3 Zkušební podmínky
— teplota a relativní vlhkost v experimentální místnosti,
— podmínky chovu včetně typu, velikosti a materiálu klícek,
— metody aplikace zkoušené látky, např. použité nosně rozpouštědlo, aplikovaný objem zkušebního roztoku, použité anestetikum,
— uspořádání zkoušky, např. použité zkušební dávky a jejich počet, počet kontrolních skupin, pro každou dávku a kontrolu počet paralelních klícek a počet včel na klícku,
— datum zkoušky.

XVII.2.2.4 Výsledky
— výsledky předběžné orientační zkoušky, byla-li provedena,
— primární data: data: mortalita pro každou zkoušenou dávku v každém čase pozorování,
— graf křivek závislosti dávka-odezva na konci zkoušky;
— hodnoty LD₅₀ s 95% intervaly spolehlivosti pro každý doporučený čas pozorování, a to pro zkoušenou látku a referenční látku,
— statistické metody použité pro stanovení LD₅₀,
— mortalita v kontrolních skupinách,
— jiné pozorované nebo změřené biologické účinky a jakékoli neobvyklé reakce včel,
— jakákoli odchylka od zde popsaného zkušebního postupu metody a jiné důležité informace.

XVII.3 LITERATURA

(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, str. 151 – 165. March 1993.

(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981 – 1992. J. Apicultur. Research 22, str. 119 – 125.

(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. Exper. Ther., 96, str. 99 – 113.

(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.

(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol. 18, str. 265 – 267.