1.2. Postupový diagram pro diagnózu bakteriální kroužkovitosti ve vzorcích bezpříznakových hlíz bramboru
Postup testování je určen ke zjištění latentních infekcí v hlízách bramboru. Pozitivní výsledek z nejméně dvou screeningových testů, z nichž každý je založen na jiném biologickém principu, musí být doplněn izolací patogena, a následně, v případě izolace typických kolonií, potvrzením, že čistá kultura je Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Pozitivní výsledek pouze jednoho screeningového testu není dostačující k tomu, aby byl vzorek považován za podezřelý.
Screeningové a izolační testy musí umožnit detekční práh 10³ až 10⁴ buněk/ml resuspendované pelety zahrnutý jako pozitivní kontroly v každé sérii testů.

(1) Standardní velikost vzorku je 200 hlíz, ačkoli postup lze použít i na menší počet, jestliže 200 hlíz není k dispozici.

(2) Metody extrakce a koncentrace patogena jsou popsány v oddílu 3.1.

(3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede se nejméně jeden screeningový test. Pokud je tento test negativní, je vzorek považován za negativní. V případě, že je tento test pozitivní, je pro ověření prvního pozitivního výsledku nezbytný ještě jeden nebo více screeningových testů založených na různých biologických principech. Pokud je druhý nebo další test negativní, je vzorek považován na negativní. Další testy nejsou nutné.

(4) Test imunofluorescence (IF).
Pro vyšetření IF se vždy použije polyklonální protilátka, další monoklonální protilátky umožní větší přesnost (viz oddíl 4).

(5) PCR test.
Použijí se vhodná validovaná PCR činidla a protokoly (viz oddíl 6).

(6) FISH test.
Použijí se validovaná činidla a protokoly (viz oddíl 5).

(7) Selektivní izolace.
Toto může být v mnoha případech vhodná metoda pro přímou izolaci Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus za použití MTNA média nebo NCP-88 média a ředění resuspendované pelety 1/100. Typické kolonie lze získat během 3-10 dní po rozetření na médium. Kulturu patogena lze následně vyčistit a identifikovat. Pro úplné využití potenciálu test vyžaduje opatrnou přípravu pletiva z pupkové části, aby se omezily sekundární bakterie, které jsou konkurencí Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na médiu a které mohou patogena přerůst. Pokud se kultivační metoda takto nepodaří, musí být izolace provedena z rostlin použitých pro biotest (viz oddíl 8).

(8) Biotest se používá k izolaci Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus z pelet bramborových extraktů pomocí selektivního obohacení v rostlinách lilku vejcoplodého (Solanum melongena). Test vyžaduje optimální inkubační podmínky stanovené pro tuto metodu. Bakteriální inhibitory Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na MTNA nebo NCP-88 médiu pravděpodobně tento test narušovat nebudou (viz oddíl 7).

(9) Typická morfologie kolonie je popsána v oddílu 8.

(10) Kultivace nebo biotesty mohou selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Pokud jsou výsledky screeningových testů pozitivní, ale izolační testy negativní, opakují se izolační testy ze stejné pelety nebo dodatečným odebráním vodivého pletiva z blízkosti pupkového konce hlíz stejného vzorku a v případě potřeby se provede test dalších vzorků.

(11) Spolehlivá identifikace čistých kultur podezřelých na Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se dosáhne použitím testů popsaných v oddílu 9.

(12) Test patogenity je popsán v oddílu 10.