4.3. Postup IF testu:

a) Podle přípravy sklíčka na test v oddílu 4.1 písm. a):
Připraví se sada dvojnásobných roztoků protilátky v IF pufru. V první jamce by měl být titr ¹/₂ (T/2), v ostatních titr ¹/₄ (T/4), titr ¹/₂ (T/2), titr (T) a dvojnásobný titr (2T).

b) Podle přípravy sklíčka na test v oddílu 4.1 písm. b):
Připraví se pracovní ředění (WD) protilátky v IF pufru. Pracovní ředění ovlivňuje přesnost.
Obrázek 1: Příprava sklíčka na test podle oddílu 4.1 písm. a) a oddílu 4.3. písm. a)

Obrázek 2: Příprava sklíčka na test podle oddílu 4.1 písm. b) a oddílu 4.3 b)

4.3.1. Podložní sklíčka se uspořádají na navlhčený papír. Každé testovací okénko se pokryje kompletně ředěním protilátek. Množství protilátky na každém okénku musí být nejméně stejné jako množství použitého extraktu.
Pokud nejsou k dispozici konkrétní pokyny od dodavatele protilátek, postupuje se následovně:

4.3.2. Podložní sklíčka se inkubují na vlhkém papíře přikrytá po dobu 30 minut při pokojové teplotě (18-25 °C).

4.3.3. Setřesou se kapky ze všech podložních sklíček a tato se pečlivě opláchnou pufrem IF. Umyjí se ponořením po dobu 5 minut v pufru IF Tween (dodatek 3) a následně v pufru IF. Je třeba zabránit vzniku aerosolu nebo přenosu kapiček, které by mohly způsobit vzájemnou kontaminaci, a pečlivě odstranit přebytečnou vlhkost jemným osušením.

4.3.4. Sklíčka se umístí na vlhký papír. Testovací okénka se pokryjí ředěním konjugátu FITC, kterým se stanovuje titr. Množství konjugátu naneseného do okének musí být stejné jako množství použité protilátky.

4.3.5. Zakrytá sklíčka se inkubují na vlhkém papíru po dobu 30 minut při pokojové teplotě (18-25 °C).

4.3.6. Kapky konjugátu se setřesou ze sklíček a tato se opláchnou a umyjí jako předtím (4.3.3.).
Opatrně se odstraní přebytečná vlhkost.

4.3.7. Napipetuje se 5-10 µl 0,1M fosfátového pufru s glycerolem (dodatek 3) nebo komerční krycí tekutiny do každého okénka a přiloží krycí sklíčko.