9. Přenese se horní fáze do čisté mikrozkumavky.

Připraví se kontrolní materiál stejným způsobem jako vzorky.
6.1 Metody purifikace DNA
Použijí se výše popsané pozitivní a negativní kontrolní vzorky.
K purifikaci cílové DNA z komplexních substrátů vzorků jsou k dispozici různé metody odstraňující inhibitory PCR a jiných enzymatických reakcí a koncentrující cílovou DNA v extraktu vzorku.
Následující metoda byla optimalizována pro použití s validovanou metodou PCR, uvedenou v dodatku 6.

6.2 PCR

6.3. Analýza produktu PCR

14. Peleta se nechá uschnout na vzduchu nebo v DNA speed vac.

15. Peleta se resuspendujte v 100 µl sterilní vody (UPW) a nechá stát nejméně 20 minut při pokojové teplotě.

16. Skladuje se při teplotě -20 °C až do upotřebení při PCR.

17. Jakákoliv bílá usazenina se odstraní odstředěním a pro PCR se použije 5 µl supernatantu obsahujícího DNA.

2. Přidá se 100 µl extraktu ze vzorku a umístí se do termobloku nebo vodní lázně o teplotě 95 °C na dobu 10 minut.

3. Mikrozkumavka se vloží na 5 minut do ledu.

4. Přidá se 80 µl zásobního roztoku lyzozymu (50 mg lyzozymu na 1 ml v 10 mM Tris HCl, pH 8,0) a inkubuje se při teplotě 37 °C po dobu 30 minut.

5. Přidá se 220 µl Easy DNA ^® roztok A (Invitrogen), dobře se promíchá třepáním a inkubuje se při teplotě 65 °C po dobu 30 minut.

6. Přidá se 100 µl Easy DNA ^® roztok B (Invitrogen)a silně se promíchá třepáním, až usazenina sama poteče do mikrozkumavky a vzorek začne být stejnoměrně viskózní.

7. Přidá se 500 µl chloroformu a míchá se třepáním, až se viskozita sníží a směs se stane homogenní.

8. Odstřeďuje se na 15 000 g po dobu 20 minut při 4 °C pro oddělení fází a vytvoření mezifáze.

- kontroly pufru používaného pro extrakci bakterie a DNA ze vzorku,
- reakční směs PCR.
Je třeba použít vhodná bezpečnostní opatření, aby se zabránilo kontaminaci vzorku cílovou DNA. PCR test by měli provádět zkušení laboranti v laboratořích specializovaných na molekulární biologii, aby se minimalizovala možnost kontaminace cílovou DNA.
- extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus s negativním výsledkem,
PCR test by měl zahrnovat následující negativní kontroly:
Poznámka:
Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění 10³ až 10⁴ buněk Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na 1 ml přidaných do vzorku extraktů, které byly předtím testovány s negativním výsledkem. Pro dosažení maximální citlivosti a přesnosti ve všech laboratořích mohou být vyžadovány optimalizační pokusy.
Používají se validovaná PCR činidla a protokoly. Přednostně se používá metoda s interní kontrolou.
Aby se zabránilo možné kontaminaci, připraví se pozitivní kontroly v odděleném prostředí od vzorků, které budou testovány.
Extrakty ze vzorků by měly být pokud možno bez zeminy. V případě použití PCR testu je potřeba připravit extrakty z umytých brambor.
S negativními kontrolami (u průběhu extrakce DNA a PCR) by se mělo vždy zacházet jako s konečnými vzorky, aby bylo jasné, jestli došlo k přenosu DNA.
Měly by být zahrnuty následující pozitivní kontroly:
6. PCR test
- alikvotní části resuspendovaných pelet, k nimž byl přidán Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (příprava viz dodatek 2),
PRINCIP
Použije-li se PCR test jako hlavní screeningový test a je pozitivní, musí být jako druhý povinný screeningový test proveden IF test. Pokud se PCR test používá jako druhý screeningový test a je pozitivní, je pro dokončení diagnózy nutné další testování podle postupového diagramu.
- suspenze 10⁶ buněk na 1 ml Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ve vodě z virulentního izolátu (např. NCPPB 2140 nebo NCPPB 4053),
- pokud možno použít při provádění PCR testu také DNA extrahovanou z pozitivních kontrolních vzorků.
Využití této metody v celém rozsahu jako hlavního screeningového testu se doporučuje jen tehdy, je-li požadována specializovaná expertíza.

6.1.a) Metoda podle Pastrika (2000)

6.1.b) Jiné metody
Jiné metody extrakce DNA by se mohly použít, pokud by se prokázalo, že jsou při purifikaci DNA z kontrolních vzorků obsahujících 10³ až 10⁴ patogenních buněk na 1 ml stejně efektivní.

6.2.1. Připraví se testované vzorky a kontroly pro PCR podle validovaného protokolu (dodatek 6). Připraví se jeden desetinný roztok vzorku DNA (1:10 ve sterilní vodě).

6.2.2. Připraví se příslušná reakční směs pro PCR v prostředí, kde nehrozí kontaminace, podle zveřejněného protokolu (dodatek 6). Validovaný protokol PCR je multiplexová reakce, která zahrnuje také interní kontrolu PCR.

6.2.3. Do sterilních PCR mikrozkumavek se přidá 5 µl extraktu DNA na 25 µl PCR reakce.

6.2.4. Zahrne se negativní kontrolní vzorek obsahující pouze reakční směs PCR a přidá se stejná sterilní voda UPW, která byla použita do směsi PCR namísto vzorku.

6.2.5. PCR mikrozkumavky se umístí do stejného termocykleru, který byl použit při počátečním testování a provede se vhodně optimalizovaný program PCR (dodatek 6)

6.3.1. Rozdělí se amplikony PCR elektroforézou v agarózovém gelu. Nanese se nejméně 12 µl amplifikované reakční směsi DNA z každého vzorku smíchané s 3 µl nanášecího pufru (dodatek 6) do 2,0 % (w/v) agarózového gelu v Trisacetát-EDTA (TAE) pufru (dodatek 6) při 5-8 V na cm. Použije se vhodný marker DNA, např. 100 bp ladder.

6.3.2. Detekují se proužky DNA barvením v ethidium bromidu (0,5 mg na l) po dobu 30-45 minut, za použití vhodných bezpečnostních opatření pro zacházení s tímto mutagenem.

6.3.3. V obarveném a UV (krátké vlnové délky, např. 302 nm) prosvíceném gelu se hledají amplifikované produkty PCR o očekávané velikosti a výsledek se zdokumentuje.

6.3.4. U všech nových nálezů se zkontroluje pravost amplikonu PCR provedením restrikční enzymové analýzy ve zbývajícím vzorku amplifikované DNA inkubací při optimální teplotě a době s vhodným restrikčním enzymem a pufrem (viz dodatek 6). Rozdělí se naštěpené fragmenty elektroforézou v agarózovém gelu a pozoruje se charakteristický vzor restrikčního fragmentu pod UV prosvícením po obarvení ethidiumbromidem a porovnává se s neštěpenou a štěpenou pozitivní kontrolou.
Lze mít podezření na kontaminaci, pokud byl očekávaný amplikon získán z jedné nebo více negativních zkoušek.
Interpretace výsledku PCR testu:
PCR test je negativní, pokud amplikon typický pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus očekávané velikosti nebyl zjištěn v daném vzorku, ale byl zjištěn ve všech pozitivních kontrolních vzorcích (v případě vícenásobné PCR s rostlinnými interními kontrolními primery: druhý produkt PCR očekávané velikosti musí být amplifikován s daným vzorkem).
Lze mít podezření na inhibici PCR, pokud byl očekávaný amplikon získán z pozitivního kontrolního vzorku obsahujícího Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ve vodě, ale z pozitivní kontroly s Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus v bramborovém extraktu byly negativní. Ve vícenásobných protokolech PCR s interními kontrolami PCR i inhibici reakce došlo, pokud nebyl získán žádný z obou amplikonů.
Poznámka:
PCR test je pozitivní, pokud byl zjištěn amplikon typický pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus očekávané velikosti a vzoru (pokud se požaduje), za předpokladu, že nebyl amplifikován žádným z negativních kontrolních vzorků. Spolehlivého potvrzení pozitivního výsledku lze dosáhnout také opakováním testu s druhou sadou PCR primerů (oddíl 9.3).

1. Napipetuje se 220 µl lýzového pufru (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) do mikrozkumavky o objemu 1,5 ml.

10. Přidá se 1 ml 100 % etanolu (-20 °C), krátce se promíchá třepáním a inkubuje se na ledu po dobu 10 minut.

11. Odstředí se na 15 000 g po dobu 20 minut při 4 °C a odstraní se z pelety etanol.

12. Přidá se 500 µl 80 % etanolu (-20 °C) a promíchá převracením mikrozkumavky.

13. Odstřeďuje se na 15 000 g po dobu 10 minut při 4°C, peleta se zachová a odstraní etanol.