8. Izolace Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus
Diagnóza může být potvrzena pouze tehdy, je-li původce kroužkovitosti izolován a takto identifikován. Ačkoliv je původce kroužkovitosti náročným organismem, je možno ho izolovat z pletiv projevujících příznaky napadení.
Mohou jej však přerůst rychle rostoucí saprofytické bakterie, a proto se nedoporučuje provádět izolaci přímo z pelety pletiva hlízy (3.1.5) nebo stonku (3.2). Přímá izolace Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus je možná za použití selektivního média a vhodného ředění resuspendované pelety z pupkové části hlízy nebo ze stonků rostliny.
Izolace se provádí ze všech hlíz bramboru nebo částí stonku a z rostlin lilku vejcoplodého, které nevykazují příznaky napadení, ale u nichž byl pozitivní výsledek v testu IF/PCR složených vzorků (viz oddíl 7.9). Pokud je třeba provést maceraci stonků lilku, měla by být provedena podle oddílu 3.1.2.
Jako pozitivní kontroly se připraví desetinná ředění suspenze 10⁶ cfu na ml Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (např. NCPPB 4053 nebo PD 406). Aby se vyloučilo nebezpečí kontaminace, připraví se pozitivní kontroly odděleně od vzorků, které mají být testovány.
Pro každou nově připravenou dávku selektivního média by se měla před použitím k testování obvyklých vzorků přezkoušet jeho vhodnost pro růst patogenu.
Kontrolní materiál se testuje stejným způsobem jako vzorky.

8.1. Roztěr na selektivní médium

8.1.1. Ze 100 µl alikvotní části ze vzorku resuspendované bramborové pelety nebo šťávy z lilku vejcoplodého se připraví desetinásobné ředění v peletovém pufru (dodatek 3).

8.1.2. Izolace z neředěné bramborové pelety se obvykle nepodaří kvůli náročným růstovým podmínkám Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus a konkurenci saprofytů. Vzhledem k tomu, že bakterie je obvykle v infikovaných pletivech přítomná ve vysokých koncentracích, lze saprofyty obvykle vypláchnout ředěním, zatímco patogen zůstává. Proto se doporučuje rozetřít 100 µl z každého vzorku, v ředění1/100 až 1/10 000 na MTNA médium nebo NCP-88 médium (dodatek 5), za použití pomůcek určených k roztěrům (hokejek) a techniky roztěrů.

8.1.3. Desky se inkubují v temnu při teplotě 21-23°C.

8.1.4. Počáteční kontrola misek zahrnuje porovnání s kontrolními miskami a počítání všech kolonií podobných Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se provádějí po třech dnech, s dalším počítáním po 5,7 a 10 dnech.

8.2. Čištění podezřelých kolonií
Poznámka:
Subkultury kolonií podobných Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus pro inokulaci lilku vejcoplodého a/nebo následnou identifikaci by se měly pěstovat na YGM médiu; inokulace a identifikace by se měly provést dříve, než jsou média příliš přerostlá, tj. nejlépe po 3-5 dnech.

8.2.1. Kolonie podobné Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se rozetřou na jedno z následujících médií (složení uvedena v dodatku 5):
- živný dextrózový agar (pouze pro subkultury),
- kvasničný pepton glukosový agar,
- agar z kvasničného extraktu s minerálními solemi.
Inkubace probíhá při teplotě 21-24 °C po dobu maximálně 10 dní.
Původce kroužkovitosti roste pomalu a obvykle vytváří kolonie velikosti špendlíkové hlavičky, vyklenuté, smetanově zbarvené.

8.2.2. Opětovně se provede roztěr pro zaručení čistoty. U subkultur se rychlost růstu zlepšuje. Typické kolonie jsou smetanově bílé nebo barvy slonoviny, někdy žluté, okrouhlé, hladké, vyvýšené, konvexně vyklenuté, slizovitě tekuté, s rovnými okraji a obvykle mají v průměru 1 – 3 mm.
Jednoduché Gramovo barvení (dodatek 9) může pomoci vybrat kolonie pro další testování.

8.2.3 Podezřelé kultury se identifikují (viz oddíl 9) a provede se zkouška patogenity (viz oddíl 10).