Dodatek 7
Validovaná činidla pro FISH test

1. Oligosondy
Sonda specifická pro Cms CMS-CY3-01: 5'- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3'
Nespecifická eubakteriální sonda EUB-338-FITC: 5'- gct gcc tcc cgt agg agt-3'

2. Fixační roztok
[UPOZORNĚNÍ: FIXAČNÍ ROZTOK OBSAHUJE PARAFORMALDEHYD, KTERÝ JE TOXICKÝ! POUŽÍVAT RUKAVICE A NEVDECHOVAT. DOPORUČUJE SE PRACOVAT V DIGESTOŘI.]
i) Zahřeje se 9 ml molekulárně čisté vody (např. Ultra pure water = (UPW)) na teplotu přibližně 60 °C a přidá se 0,4 g paraformaldehydu. Paraformaldehyd se rozpustí po přidání 5 kapek 1N NaOH a zamíchání magnetickým míchadlem.
ii) Upraví se pH na 7,0 přidáním 1ml fosfátového pufru 0,1 M (PB; pH 7,0) a 5 kapek HCl 1N. Indikačním proužkem se zkontroluje pH a v případě potřeby se upraví pomocí HCl nebo NaOH.
[UPOZORNĚNÍ: V ROZTOCÍCH S PARAFORMALEDHYDEM NEPOUŽÍVAT MĚŘIČ pH!]
iii) Roztok se přefiltrujte přes membránový filtr 0,22 µm a skladuje se chráněný před prachem při teplotě 4 °C do dalšího použití.
iv) Poznámka:
Alternativní fixační roztok: 96 % etanol.

3. 3x Hybmix

NaCl	2,7 M
Tris-HCl	60 mM (pH 7,4)
EDTA (sterilizovaný přes filtr a autoklávovaný)	15 mM

Zředí se až 1x, podle potřeby.

4. Hybridizační roztok

1x Hybmix
Sodium dodecyl sulfát (SDS)	0,01 %
Sonda EUB 338	5 ng/µl
Sonda CMSCY301	5 ng/µl

Připraví se množství hybridizačního roztoku podle výpočtů v tabulce. Pro každé sklíčko (obsahující dvojmo 2 různé vzorky) je třeba 90 µl hybridizačního roztoku.
Tabulka: Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi

	2 sklíčka	8 sklíček
Sterilní ultra čistá voda	50,1	200,4
3x hybmix	30,0	120,0
1 % SDS	0,9	3,6
sonda EUB 338 (100 ng/µl)	4,5	18,0
sonda CMSCY301 (100 ng/µl)	4,5	18,0
Celkový objem (µl)	90,0	360,0

Poznámka.:
Všechny roztoky obsahující světlocitlivé oligosondy se uchovávají v temnu při teplotě - 20 °C. Během použití je nutné je ochraňovat před přímým slunečním zářením nebo elektrickým světlem.

5. 0,1M fosfátový pufr, pH 7,0

Na2HPO4	8,52 g
KH2PO4	5,44 g
Destilovaná voda	1,001

Složky se rozpustí, zkontroluje se pH a sterilizuje se autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.