15. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ CHINOLIN-8-OLU A BIS(CHINOLIN-8-OL)-SULFÁTU
1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ
Tato metoda popisuje kvalitativní a kvantitativní stanovení chinolin-8-olu a jeho sulfátu.
2. DEFINICE
Obsah chinolin-8-olu a bis(chinolin-8-ol)-sulfátu ve vzorku stanovený touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech chinolin-8-olu.
3. PRINCIP
3.1 Kvalitativní stanovení
Ke kvalitativnímu stanovení se využívá chromatografie na tenké vrstvě.
3.2 Kvantitativní stanovení
Kvantitativní stanovení se provede pomocí spektrofotometrie komplexu vzniklého reakcí s Fehlingovým roztokem při 410 nm.
4. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší
4.1 Chinolin-8-ol
4.2 Benzen. Vzhledem k jeho toxicitě je třeba s benzenem pracovat opatrně.
4.3 Chloroform
4.4 Vodný roztok hydroxidu sodného, 50% roztok (m/m)
4.5 Síran měďnatý pentahydrát
4.6 Vinan draselno-sodný
4.7 Kyselina chlorovodíková, 1M
4.8 Kyselina sírová, 0,5M
4.9 Roztok hydroxidu sodného, 1M.
4.10 Ethanol
4.11 Butan-1-ol
4.12 Ledová kyselina octová
4.13 Kyselina chlorovodíková, 0,1M
4.14 „Celit 545“ nebo ekvivalent
4.15 Standardní roztoky
4.15.1 Do odměrné baňky na 100 ml se naváží 100 mg chinolin-8-olu (4.1). Rozpustí se v malém množství kyseliny sírové (4.8). Doplní se kyselinou sírovou (4.8) po rysku.
4.15.2 Do odměrné baňky na 100 ml se naváží 100 mg chinolin-8-olu. Rozpustí se v ethanolu (4.10). Doplní se po rysku ethanolem (4.10) a promíchá.
4.16 Fehlingův roztok
Roztok A
Do odměrné baňky na 100 ml se naváží 7 g síranu měďnatého pentahydrátu (4.5). Rozpustí se v malém množství vody. Doplní se po rysku vodou a promíchá.
Roztok B
Do odměrné baňky na 100 ml se naváží 35 g vinanu draselného-sodného (4.6). Rozpustí se v 50 ml vody. Přidá se 20 ml hydroxidu sodného (4.4). Doplní se po rysku vodou a promíchá. Bezprostředně před použitím se do odměrné baňky na 100 ml odpipetuje 10 ml roztoku A a 10 ml roztoku B. Doplní se po rysku a promíchá.
4.17 Vyvíjecí rozpouštědla pro chromatografii na tenké vrstvě
I : Butan-1-ol (4.11)/kyselina octová (4.12)/voda (80:20:20, V/V/V).
II : Chloroform (4.13)/kyselina octová (4.12) (95:5, V/V).
4.18 2,6-dichlor-4-(chlorimino)cyklohexa-2,5-dienon, 1% (m/V) roztok v ethanolu (4.10)
4.19 Uhličitan sodný, 1% (m/V) roztok ve vodě
4.20 Ethanol (4.10), 30% (V/V) roztok ve vodě
4.21 Dinatrium-dihydrogen-ethylendiamintetraacetát, 5% (m/V) roztok ve vodě
4.22 Tlumivý roztok, pH 7
Do odměrné baňky na 1 litr se naváží 27 g bezvodého dihydrogenfosforečnanu draselného a 70 g hydrogenfosforečnanu didraselného trihydrátu. Doplní se vodou po rysku.
4.23 Hotové desky pro chromatografii na tenké vrstvě
Hotové desky pro chromatografii na tenké vrstvě o tloušťce 0,25 mm (např. Merck Kieselgel 60 nebo ekvivalentní). Před použitím se deska postříká 10 ml činidla (4.21) a usuší se při 80 °C.
5. PŘÍSTROJE A POMŮCKY
5.1 Baňka se zábrusem na 100 ml s kulatým dnem
5.2 Odměrné baňky
5.3 Dělené pipety na 10 a 5 ml
5.4 Nedělené pipety na 20, 15, 10 a 5 ml
5.5 Dělicí nálevky na 100, 50 a 25 ml
5.6 Skládaný papírový filtr, průměr 90 mm
5.7 Rotační odparka
5.8 Zpětný chladič se zábrusem
5.9 Spektrofotometr
5.10 Kyvety s optickou dráhou o délce 10 mm
5.11 Míchačka s vyhříváním
5.12 Skleněná chromatografická kolona o těchto rozměrech: 160 mm dlouhá s průměrem 8 mm, na spodním, zúženém konci se zátkou ze skelné vaty, a s nástavcem pro aplikaci tlaku na horním konci.
6. POSTUP
6.1 Kvalitativní stanovení
6.1.1 Kapalné vzorky
6.1.1.1 U části testovaného vzorku se upraví pH na 7,5 a 10 μl se nanese na startovací linii předem upravené silikagelové desky pro chromatografii na tenké vrstvě (4.23).
6.1.1.2 Do dvou dalších bodů startovací linie se nanese 10 a 30 μl standardního roztoku (4.15.2), poté se chromatogram vyvíjí v jednom z vyvíjecích rozpouštědel (4.17).
6.1.1.3 Když čelo postoupí o 150 mm, deska se suší při 110 °C (15 minut). Pod UV lampou (366 nm) skvrny chinolin-8-olu žlutě fluoreskují.
6.1.1.4 Deska se postříká roztokem uhličitanu sodného (4.19). Usuší se a postříká se roztokem 2,6-dichlor-4-(chlorimino)cyklohexa-2,5-dienonu (4.18). Skvrny chinolin-8-olu se zbarví modře.
6.1.2 Pevné vzorky nebo krémy
6.1.2.1 1 g vzorku se rozptýlí v 5 ml tlumivýho roztoku (4.22). Potom se pomocí 10 ml chloroformu (4.3) převede do dělicí nálevky a protřepe se. Po oddělení vrstvy chloroformu se vodná vrstva ještě dvakrát extrahuje 10 ml chloroformu (4.3). Spojené a přefiltrované chloroformové extrakty se v baňce s kulatým dnem na 100 ml (5.1) odpaří téměř do sucha na rotační odparce (5.7). Odparek se rozpustí ve 2 ml chloroformu (4.3) a 10 a 30 μl získaného roztoku se nanese na silikagelovou desku pro chromatografii na tenké vrstvě (4.23) podle postupu popsaného v bodě 6.1.1.1 a dále.
6.1.2.2 Na desku se nanese 10 a 30 μl standardního roztoku (4.15.2) a pokračuje se podle postupu popsaného v bodech 6.1.1.2 až 6.1.1.4.
6.2 Kvantitativní stanovení
6.2.1 Kapalné vzorky
6.2.1.1 Do baňky s kulatým dnem se naváží 5 g vzorku. Přidá se 1 ml roztoku kyseliny sírové (4.8) a směs se odpaří téměř do sucha za sníženého tlaku při teplotě 50 °C.
6.2.1.2 Tento zbytek se rozpustí ve 20 ml teplé vody. Převede se do odměrné baňky na 100 ml. Vypláchne se třikrát 20 ml vody. Doplní se na 100 ml vodou a promíchá.
6.2.1.3 5 ml tohoto roztoku se odpipetuje do dělicí nálevky na 50 ml (5.5). Přidá se 10 ml Fehlingova roztoku (4.16). Měďnatý komplex chinolin-8-olu se třikrát extrahuje 8 ml chloroformu (4.3).
6.2.1.4 Chloroformové vrstvy se zfiltrují a shromáždí v odměrné baňce na 25 ml (5.2). Doplní se po rysku chloroformem (4.3) a protřepou se. Absorbance žlutého roztoku se měří při 410 nm proti chloroformu.
6.2.2 Pevné vzorky a krémy
6.2.2.1 Do baňky na 100 ml s kulatým dnem (5.1) se naváží 0,500 g vzorku. Přidá se 30 ml benzenu (4.2) a 20 ml kyseliny chlorovodíkové (4.7). Roztok se za míchání 30 minut vaří pod zpětným chladičem.
6.2.2.2 Obsah se převede do dělicí nálevky na 100 ml (5.5). Vypláchne se 5 ml 1 mol/l HCl (4.7). Vodná fáze se převede do baňky s kulatým dnem (5.1), benzenová fáze se promyje 5 ml kyseliny chlorovodíkové (4.7).
6.2.2.3 V případě emulzí, které brání dalšímu postupu, se smísí 0,500 g vzorku s 2 g Celitu 545 (4.14), čímž vznikne sypký prášek. Směs se v malých dávkách převede do skleněné chromatografické kolony (5.12).
Po každém přídavku se náplň kolony stlačí. Jakmile se celý vzorek převede do kolony, eluuje se kyselinou chlorovodíkovou (4.13) takovým způsobem, aby se získalo 10 ml eluátu asi za 10 minut (pokud je to nutné, eluce může probíhat za mírného přetlaku dusíku). Během eluce je třeba zajistit, aby nad vrstvou náplně kolony bylo stále trochu kyseliny chlorovodíkové. Prvních 10 ml eluátu se podrobí dalšímu postupu popsanému v bodě 6.2.2.4.
6.2.2.4 Spojené vodné fáze (6.2.2.2) nebo eluát z kolony (6.2.2.3) se v rotační odparce za sníženého tlaku odpaří téměř do sucha.
6.2.2.5 Zbytek se rozpustí v 6 ml roztoku hydroxidu sodného (4.9). Přidá se 20 ml Fehlingova roztoku (4.16) a obsah se převede do dělicí nálevky na 50 ml (5.5). Baňka se vypláchne 8 ml chloroformu (4.3). Protřepe se a chloroformová fáze se zfiltruje do odměrné baňky na 50 ml (5.2).
6.2.2.6 Extrakce s 8 ml chloroformu (4.3) se třikrát opakuje. Chloroformové fáze se shromáždí v odměrné baňce na 50 ml. Doplní se po rysku chloroformem (4.3) a protřepou. Měří se absorbance žlutého roztoku při 410 nm proti chloroformu (4.3).
7. KALIBRAČNÍ KŘIVKA
Do čtyř baněk na 100 ml s kulatým dnem (5.1), z nichž každá obsahuje 3 ml 30% vodného roztoku ethanolu (4.20), se odpipetuje 5, 10, 15 a 20 ml standardního roztoku (4.15.1), což odpovídá 5, 10, 15 a 20 mg chinolin-8-olu. Pokračuje se tak, jak je popsáno v bodě 6.2.1.
8. VÝPOČET
8.1 Kapalné vzorky
kde:
a = množství chinolin-8-olu odečtené z kalibrační křivky (7) v mg,
m = hmotnost (v mg) zkušebního vzorku (6.2.1.1).
8.2 Pevné vzorky nebo krémy
kde:
a = množství chinolin-8-olu odečtené z kalibrační křivky (7) v mg,
m = hmotnost (v mg) zkušebního vzorku (6.2.1.1).
9. OPAKOVATELNOST
Pro výrobky obsahující asi 0,3 % (m/m) chinolin-8-olu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,02 %.