bod 35 · 494/2005 Sb.

35. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ HEXAMIDINU, DIBROMHEXAMIDINU, DIBROMPROPAMIDINU A CHLORHEXIDINU

1. Rozsah a oblast použití
V této metodě je popsáno kvalitativní a kvantitativní stanovení
— hexamidinu a jeho solí včetně 2-hydroxyethansulfonátu a 4-hydroxybenzoátu,
— dibromhexamidinu a jeho solí včetně 2-hydroxyethansulfonátu,
— dibrompropamidinu a jeho solí včetně 2-hydroxyethansulfonátu,
— diacetátu, diglukonátu a dihydrochloridu chlorhexidinu
v kosmetických prostředcích.

2. Definice
Koncentrace hexamidinu, bromdibromhexamidinu, bromdibrompropamidinu a chlorhexidinu stanovené touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech (% m/m).

3. Podstata metody
Kvalitativní a kvantitativní stanovení se provádí pomocí chromatografie iontových párů za použití vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) s obrácenými fázemi s následnou detekcí UV spektrofotometrií. Hexamidin, dibromhexamidin, dibrompropamidin a chlorhexidin se kvalitativně stanovují podle svých retenčních časů v chromatografické koloně.

4. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a podle potřeby musí být vhodná pro HPLC.

4.1 Methanol

4.2 Natrium-heptan-1-sulfonát monohydrát

4.3 Ledová kyselina octová (d₂₀ = 1,05 g/ml)

4.4 Chlorid sodný

4.5 Mobilní fáze
Poznámka: Je-li nutné zlepšit tvar píků, lze mobilní fáze upravit a připravit níže uvedeným způsobem:
— eluent I: 5,84 g chloridu sodného (4.4) a 1,1013 g natrium-heptan-1-sulfonátu monohydrátu (4.2) se rozpustí ve 100 ml vody. Přidá se 900 ml methanolu (4.1) a upraví se ledovou kyselinou octovou (4.3) na hodnotu pH 3,5.
— eluent II: 5,84 g chloridu sodného (4.4) a 1,1013 g natrium-heptan-1-sulfonátu monohydrátu (4.2) se rozpustí v jednom litru vody a upraví se ledovou kyselinou octovou (4.3) na hodnotu pH 3,5.

4.5.1 Eluent I: 0,005 mol/l roztok natrium-heptan-1-sulfonátu monohydrátu (4.2) v methanolu (4.1) upravený ledovou kyselinou octovou (4.3) na hodnotu pH 3,5.

4.5.2 Eluent II: 0,005 mol/l roztok natrium-heptan-1-sulfonátu monohydrátu (4.2) ve vodě upravený ledovou kyselinou octovou (4.3) na hodnotu pH 3,5.

4.6 Hexamidin-di(2-hydroxyethansulfonát) [C₂₀H₂₆N₄O₂·2C₂H₆O₄S]

4.7 Dibromhexamidin-di(2-hydroxyethansulfonát) [C₂₀H₂₄Br₂N₄O₂·2C₂H₆O₄S]

4.8 Dibrompropamidin-di(2-hydroxyethansulfonát) [C₁₇H₁₈Br₂N₄O₂·2C₂H₆O₄S]

4.9 Chlorhexidin-diacetát [C₂₂H₃₀Cl₂N₁₀·2C₂H₄O₂]

4.10 Standardní roztoky: v eluentu I (4.5.1) se připraví 0,05% (m/V) roztoky všech čtyř konzervantů (4.6 až 4.9).

4.11 3,4,4'-Trichlorkarbanilid (Triclocarban - INN)

4.12 4,4'-Dichlor-3-(trifluormethyl)karbanilid (Halocarban - INN)

5. Přístroje a pomůcky

5.1 Obvyklé laboratorní vybavení

5.2 Chromatograf pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s UV detektorem s nastavitelnou vlnovou délkou

5.3 Analytická dělicí kolona: kolona z nerezové oceli o délce 30 cm a vnitřním průměru 4 mm, s náplní μ-Bondapack C₁₈, 10 μm, nebo s ekvivalentní náplní.

5.4 Ultrazvuková lázeň

6. Kvalitativní stanovení

6.1 Příprava vzorku
Do odměrné baňky na 10 ml se naváží asi 0,5 g vzorku přesně a doplní se po rysku eluentem I (4.5.1). Baňka se na 10 minut vloží do ultrazvukové lázně (5.4). Roztok se zfiltruje nebo odstředí. Filtrát nebo supernatant se použije pro chromatografii.

6.2 Chromatografie

6.2.1 Gradient mobilní fáze

Čas (min)	eluent I (% V/V) (4.5.1)	eluent II (% V/V) (4.5.2)
0	50	50
15	65	35
30	65	35
45	50	50

6.2.2 Průtok mobilní fáze (6.2.1) se nastaví na 1,5 ml/min a teplota kolony se nastaví na 35 °C.

6.2.3 Vlnová délka detektoru se nastaví na 264 nm.

6.2.4 Provede se nástřik 10 μl každého z referenčních roztoků (4.10) a zaznamenají se jejich chromatogramy.

6.2.5 Provede se nástřik 10 μl roztoku vzorku (6.1) a zaznamená se jeho chromatogram.

6.3 Důkaz přítomnosti hexamidinu, dibromhexamidinu, dibrompropamidinu nebo chlorhexidinu se provede porovnáním retenčních časů píků zaznamenaných v bodě 6.2.5 s píky získanými pro referenční roztoky v bodě 6.2.4.

7. Kvantitativní stanovení

7.1 Příprava standardních roztoků
Jako vnitřní standard se použije jeden z konzervantů (4.6 až 4.9), který není ve vzorku přítomen. Není-li to možné, může být použit Triclocarban (4.11) nebo Halocarban (4.12).

7.1.1 Zásobní roztok konzervantu, jehož přítomnost je prokázána v bodě 6.3, 0,05% (m/V) v eluentu I (4.5.1).

7.1.2 Zásobní roztok konzervantu zvoleného jako vnitřní standard, 0,05% (m/V) v eluentu I (4.5.1).

7.1.3 Pro každý nalezený konzervant se připraví čtyři standardní roztoky tak, že se do odměrných baněk na 10 ml odměří podle níže uvedené tabulky množství zásobního roztoku prokázaného konzervantu (7.1.1) a množství zásobního roztoku vnitřního standardu (7.1.2).

Standardní roztok	Zásobní roztok vnitřního standardu	Zásobní roztok konzervantu, jehož přítomnost byla prokázána
Standardní roztok	počet přidaných ml (7.1.2)	počet přidaných ml (7.1.1)	μg/ml (^*)
I	1,0	0,5	25
II	1,0	1,0	50
III	1,0	1,5	75
IV	1,0	2,0	100
(^*) Tyto hodnoty jsou uvedeny jako ukazatele a odpovídají koncentracím standardních roztoků prokázaných konzervantů, připravených ze zásobních roztoků obsahujících přesně 0,05 % prokázaného konzervantu.

7.2 Příprava vzorku

7.2.1 Do odměrné baňky na 10 ml se naváží asi 0,5 g (p gramů) vzorku přesně, přidá se 1,0 ml roztoku vnitřního standardu (7.1.2) a 6 ml eluentu I (4.5.1) a promíchá se.

7.2.2 Baňka se umístí na 10 minut do ultrazvukové lázně (5.4). Ochladí se. Doplní se po rysku eluentem I a promíchá. Odstředí se nebo se zfiltruje přes skládaný filtrační papír. Supernatant nebo popřípadě filtrát se použije pro chromatografii.

7.3 Chromatografie

7.3.1 Gradient mobilní fáze, průtok, teplota kolony a vlnová délka detektoru zařízení pro HPLC (5.2) se nastaví podle podmínek požadovaných při kvalitativním stanovení (6.2.1 až 6.2.3).

7.3.2 Nastříkne se 10 μl roztoku vzorku (7.2.2) a změří se plochy píků. Tento postup se opakuje s dalšími 10μl alikvotními podíly roztoku vzorku tak dlouho, dokud se nezískají shodné výsledky. Vypočítá se poměr plochy píku analyzované sloučeniny k ploše píku vnitřního standardu.

7.4 Kalibrace

7.4.1 Nastříkne se 10 μl každého standardního roztoku (7.1.3) a změří se plochy píků.

7.4.2 Pro každý standardní roztok (7.1.3) se vypočítá poměr plochy píku hexamidinu, dibromhexamidinu, dibrompropamidinu nebo chlorhexidinu k ploše píku vnitřního standardu. Kalibrační křivka se sestrojí vynesením těchto poměrů na osu y a odpovídajících koncentrací standardních roztoků prokázaných konzervantů v μg/ml na osu x.

7.4.3 Z kalibrační křivky (7.4.2) se odečte koncentrace prokázaného konzervantu odpovídající poměru ploch píků vypočítanému v bodě 7.3.2.

8. Výpočet

8.1 Obsah hexamidinu, dibromhexamidinu, dibrompropamidinu nebo chlorhexidinu ve vzorku v hmotnostních procentech se vypočítá podle vzorce:
$% m / m = \frac{c}{1000 \times p} \times \frac{{MW}_{1}}{{MW}_{2}}$
kde

p =	hmotnost analyzovaného vzorku (7.2.1) v g,
c =	koncentrace konzervantu v roztoku vzorku, odečtená z kalibrační křivky, v μg/ml,
MW₁ =	molekulová hmotnost základní formy přítomného konzervantu,
MW₂ =	molekulová hmotnost odpovídající soli (viz bod 10).

9. Opakovatelnost
Pro výrobky obsahující asi 0,1 % (m/m) hexamidinu, dibromhexamidinu, dibrompropamidinu nebo chlorhexidinu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,005 %.

10. Tabulka molárních hmotností

Hexamidin	C₂₀H₂₆N₄O₂	354,45
Hexamidin-di(2-hydroxyethansulfonát)	C₂₀H₂₆N₄O₂·2C₂H₆O₄S	606,72
Hexamidin-di-p-hydroxybenzoát	C₂₀H₂₆N₄O₂·2C₇H₆O₃	630,71
Dibromhexamidin	C₂₀H₂₄Br₂N₄O₂	512,24
Dibromhexamidin-di(2-hydroxyethansulfonát)	C₂₀H₂₄Br₂N₄O₂·2C₂H₆O₄S	764,51
Dibrompropamidin	C₁₇H₁₈Br₂N₄O₂	470,18
Dibrompropamidin-di(2-hydroxyethansulfonát)	C₁₇H₁₈Br₂N₄O₂·2C₂H₆O₄S	722,43
Chlorhexidin	C₂₂H₃₀Cl₂N₁₀	505,45
Chlorhexidin-diacetát	C₂₂H₃₀Cl₂N₁₀·2C₂H₄O₂	625,56
Chlorhexidin-diglukonát	C₂₂H₃₀Cl₂N₁₀·2C₆H₁₂O₇	897,76
Chlorhexidin-dihydrochlorid	C₂₂H₃₀Cl₂N₁₀·2HCl	578,37