A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ

1. Princip
Po kyselé/zásadité extrakci konzervantů se extrakt analyzuje chromatografií na tenké vrstvě (TLC) a reakční chromatografií („derivatizace na desce“). V závislosti na výsledcích se kvalitativní stanovení potvrdí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) nebo, v případě kyseliny propionové, plynovou chromatografií (GC).

2. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

2.1 Všeobecně
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší. Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň ekvivalentní čistoty.

2.2 Aceton

2.3 Diethylether

2.4 Acetonitril

2.5 Toluen

2.6 n-Hexan

2.7 Parafin, tekutý

2.8 Kyselina chlorovodíková, 4 mol/l

2.9 Hydroxid draselný,4 mol/l vodný roztok

2.10 Chlorid vápenatý, CaCl₂·2H₂O

2.11 Uhličitan lithný, Li₂CO₃

2.12 2-Brom-2'-acetonafton

2.13 Kyselina 4-hydroxybenzoová

2.14 Kyselina salicylová

2.15 Kyselina benzoová

2.16 Kyselina sorbová

2.17 Kyselina propionová

2.18 Standardní roztoky
Připraví se 0,1% (m/V) roztoky (100 mg/100 ml) každého z pěti konzervantů (2.13 až 2.17) v diethyletheru.

2.19 Derivatizační činidlo
0,5% roztok 2-bromo-2'-acetonaftonu (2.12) v acetonitrilu (2.4) (50 mg/10 ml). Tento roztok by měl být připravován každý týden a uchováván v ledničce.

2.20 Roztok katalyzátoru
0,3% (m/V) roztok uhličitanu lithného (2.11) ve vodě (300 mg/100 ml). Tento roztok by měl být připravován vždy čerstvý.

2.21 Mobilní fáze
Toluen (2.5)/aceton (2.2) (20:0,5, V/V)

2.22 Tekutý parafin (2.7)/n-hexan (2.6) (1:2, V/V)

3. Přístroje a pomůcky
Obvyklé laboratorní vybavení

3.1 Vodní lázeň nastavitelná na teplotu 60 °C

3.2 Vyvíjecí komora

3.3 Zdroj ultrafialového světla, 254 a 366 nm

3.4 Hotové desky pro chromatografii na tenké vrstvě, Silikagel 60, bez fluorescenčního indikátoru, 20 x 20 cm, tloušťka vrstvy 0,25 mm s koncentrační zónou 2,5 x 20 cm (Merck 11845 nebo ekvivalentní)

3.5 Mikrostříkačka na 10 μl

3.6 Mikrostříkačka na 25 μl

3.7 Sušárna nastavitelná na teplotu až 105 °C

3.8 Erlenmeyerovy baňky na 50 a 200 ml se zábrusovou zátkou

3.9 Filtrační papír, průměr 90 mm, Schleicher & Schüll, Weissband No. 5892, nebo ekvivalentní

3.10 Univerzální indikátorový papírek, pH 1 - 11

3.11 Skleněné vzorkovací lahvičky na 5 ml

3.12 Rotační vakuová odparka (Rotavapor nebo ekvivalentní)

3.13 Topná deska

4. Postup

4.1 Příprava vzorků
Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se zábrusovou zátkou (3.8) se odváží přibližně 1 g vzorku. Přidají se čtyři kapky 4 mol/l kyseliny chlorovodíkové (2.8) a 40 ml acetonu (2.2). U silně zásaditých prostředků, jako je toaletní mýdlo, by mělo být přidáno 20 kapek 4 mol/l kyseliny chlorovodíkové (2.8). Pomocí indikátorového papírku (3.10) se zkontroluje, zda je pH přibližně 2. Baňka se uzavře a po dobu 1 minuty se silně protřepává.
Je-li nezbytné usnadnit extrakci konzervantů do acetonové fáze, směs se opatrně zahřeje na asi 60 °C, aby se tekutá fáze rozpustila.
Roztok se zchladí na laboratorní teplotu a přefiltruje přes filtrační papír (3.9) do Erlenmeyerovy baňky.
20 ml filtrátu se převede do Erlenmeyerovy baňky na 200 ml, přidá se 20 ml vody a promíchá se. pH směsi se upraví přibližně na 10 pomocí 4 mol/l hydroxidu draselného (2.9) za použití indikátorového papírku (3.10).
Přidá se 1 g chloridu vápenatého (2.10) a silně se protřepe. Zfiltruje se přes filtrační papír (3.9) do dělicí nálevky na 250 ml obsahující 75 ml diethyletheru (2.3) a silně se třepe 1 minutu. Vrstvy se nechají oddělit a vodná vrstva se převede do Erlenmeyerovy baňky na 250 ml. Etherová vrstva se zlikviduje. Za použití indikátorového papírku (3.10) se pH vodného roztoku upraví na přibližně 2 okyselením 4 mol/l kyselinou chlorovodíkovou (2.8). Přidá se 10 ml diethyletheru (2.3), baňka se zazátkuje a silně protřepává 1 minutu; vrstvy se nechají oddělit a etherová vrstva se převede do rotační odparky (3.12). Vodná vrstva se zlikviduje.
Etherová vrstva se odpaří téměř do sucha a zbytek se znovu rozpustí v 1 ml diethyletheru (2.3). Roztok se převede do vzorkovací lahvičky (3.11).

4.2 Chromatografie na tenké vrstvě
Na startovní linii koncentrační zóny TLC desky (3.4) se do bodů, jejichž počet odpovídá počtu referenčních roztoků a roztoků vzorků, které mají být analyzovány, nanese stříkačkou (3.5) ve stejných odstupech vždy po 3 μl uhličitanu lithného (2.20) a vysuší se v proudu studeného vzduchu.
Chromatografická deska se přenese na topnou desku (3.13) zahřátou na 40 °C, aby se skvrny udržely co nejmenší. Mikrostříkačkou (3.5) se na startovní linii desky nanese vždy 10 μl každého standardního roztoku (2.18) a roztoku vzorku (4.1) přesně do bodů, kam byl nanesen uhličitan lithný.
Nakonec se opět přesně do bodů, kam byly naneseny referenční roztoky/roztoky vzorku a roztok uhličitanu lithného, nanese přibližně 15 μl derivatizačního činidla (2.19) (roztok 2-bromo-2'-acetonaftonu).
Chromatografická deska se zahřívá v sušárně (3.7) 45 minut při 80 °C. Po vychladnutí se deska vyvíjí v komoře (3.2), která byla 15 minut (bez vyložení filtračním papírem) sycena mobilní fází 2.21 (toluen/aceton), dokud čelo rozpouštědla nedosáhne vzdálenosti 15 cm (doba vyvíjení je přibližně 80 minut).
Deska se vysuší v proudu studeného vzduchu a získané skvrny se vyhodnotí pod UV světlem (3.3). Pro zesílení fluorescence slabých skvrn může být chromatografická deska ponořena do tekutého parafinu/n-hexanu (2.22).

5. Kvalitativní stanovení
Pro každou skvrnu se vypočte hodnota R_f.
Hodnoty R_f a chování vzorku pod UV světlem se porovnají s hodnotami a chováním referenčních vzorků.
Učiní se předběžné závěry o přítomnosti a kvalitativním stanovení konzervantů. Provede se vysokoúčinná kapalinová chromatografie popsaná v oddílu B, nebo ukazuje-li se, že je přítomna kyselina propionová, provede se plynová chromatografie popsaná v oddílu C. Získané retenční časy se porovnají s retenčními časy referenčních vzorků.
Výsledky TLC a HPLC nebo GC se zkombinují a konečný důkaz konzervantů vychází z kombinace výsledků.