5.1.3 Účinnost protimikrobních konzervačních látek
Pokud léčivý přípravek nemá sám dostačující protimikrobní účinnost, může se, zvláště u přípravků obsahujících vodu, přidat protimikrobní konzervační látka, která za obvyklých podmínek skladování nebo užívání zamezí pomnožování mikrobiální kontaminace nebo ji omezí. Používá se zvláště u vícedávkových balení a chrání pacienta před infekcí a před poškozením způsobeným zkažením přípravku. Protimikrobní konzervaci nelze použít k nahrazení správné výrobní praxe.
Účinnost konzervační látky může být zvýšena nebo snížena účinnou látkou léčivého přípravku nebo jeho celkovým složením, případně jeho obalem nebo uzávěrem. Protimikrobní účinnost léčivého přípravku se stanoví v jeho konečném balení a v průběhu trvání jeho použitelnosti, aby se zjistilo, že se účinnost během uchovávání nenarušila. Toto zkoušení se má provádět na vzorcích odebraných z konečného obalu bezprostředně před zkoušením.
V průběhu vývoje léčivého přípravku se prokazuje, že protimikrobní účinnost přípravku jako takového anebo, pokud to je nutné, s přidáním vhodné konzervační látky nebo látek zajišťuje dostačující ochranu před nežádoucími účinky, jež mohou pocházet z mikrobiální kontaminace nebo z jejího pomnožení v průběhu uchovávání a používání přípravku.
Účinnost protimikrobního působení se prokazuje dále popsanou zkouškou, která není určena k užití pro běžné kontrolní účely.
Zkouška účinností protimikrobní konzervace
Podstatou zkoušky je naočkování vhodných mikroorganismů, pokud možno do léčivého přípravku v jeho konečném obalu, uchovávání naočkovaného přípravku při předepsané teplotě, odebírání vzorků z obalu v určených časových intervalech a stanovení počtu mikroorganismů ve vzorcích takto odebraných.
Konzervační vlastnosti přípravků jsou dostačující, jestliže při zkoušce za předepsané teploty a v předepsaných časech se počet mikroorganismů v naočkovaném přípravku významně sníží nebo nevzroste. Požadavky na pokles počtu mikroorganismů v závislosti na době se liší podle druhu přípravků a stupně požadované ochrany (viz tabulky 5.1.3-1 až 5.1.3-3).
Zkušební kmeny

Pseudomonas aeruginosaATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, CCM 1961, CNCTC Ps 37/65
Staphylococcus aureusATCC 6538, NCTC 10788, NCIMB 9518,CIP 4.83, CCM 4516, CNCTC Mau 29/58
Candida albicansATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72, CCM 8215, CNCTC 59/91
Aspergillus nigerATCC 16404, IMI 149007, IP 1431.83, CCM 8222

Zkoušky se provádějí s každým kmenem samostatně. Určené kmeny se doplňují, když je to vhodné, jinými kmeny nebo druhy, které mohou představovat pravděpodobné kontaminanty přípravku. Např. se doporučuje, aby pro všechny perorální přípravky byla použita Escherichia coli (ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126, CCM 5417) a Zygosaccharomyces rouxii (NCYC 381, IP 2021.92, CCM 8224) pro perorální přípravky obsahující vyšší koncentrace cukru.
Příprava inokula
Ze sbírkových kultur se bakterie přeočkují na povrch živné půdy B (2.6.12) a houby na povrch živné půdy C bez přidání antibiotik (2.6.12). Bakterie se inkubují 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C, C. albicans 48 h při 20 °C až 25 °C a A. niger při 20 °C až 25 °C po dobu jednoho týdne nebo do dosažení dobré sporulace. Kmeny lze přeočkovávat po oživení dříve, než dosáhnou optimálního stavu, ale počet přeočkování má být omezen na minimum.
Narostlé kolonie bakterií a C. albicans se smyjí sterilním roztokem obsahujícím chlorid sodný R (9 g/l) a pepton R (1 g/l), převedou se do vhodné nádoby a stejným roztokem se naředí tak, aby obsahovaly 108 mikroorganismů v 1 ml. Kolonie A. niger se smyjí a naředí asi na 108 v 1 ml stejným způsobem za pomoci sterilního roztoku obsahujícího chlorid sodný R (9 g/l) a polysorbát 80 R (0,5 g/l).
Z každé suspenze se ihned odebere vzorek a stanoví se počty jednotek vytvářejících kolonie v 1 ml jednotlivé suspenze metodou stanovení počtu na pevných půdách nebo metodou membránové filtrace (2.6.12). Tato hodnota slouží ke stanovení velikosti inokula a je východiskem pro provedení zkoušky. Suspenze se použijí ihned po přípravě.
Postup zkoušky
Ke stanovení počtu živých mikrobů v naočkovaném přípravku se použije stejná živná půda jako při pomnožování příslušného mikroorganismu.
Naočkuje se série balení zkoušeného přípravku, každé balení suspenzí jednoho zkušebního kmene tak, aby v 1 g nebo v 1 ml přípravku bylo 105 až 106 mikroorganismů. Objem suspenze inokula nemá překročit 1 % objemu přípravku. Pečlivě se promísí, aby se dosáhlo stejnoměrného rozptýlení inokula.
Naočkovaný přípravek se uchovává při teplotě 20 °C až 25 °C, chráněn před světlem. Z každého obalu se odebírá vhodný vzorek, obvykle 1 g nebo 1 ml, a to ihned po naočkování a dále ve vhodných intervalech podle druhu přípravku a stanoví se počet živých zárodků metodou stanovení počtu na pevných půdách nebo metodou membránové filtrace (2.6.12). K odstranění zbytkové protimikrobní účinnosti se použije ředění, filtrace nebo specifická inaktivační látka. Použije-li se ředění, je třeba počítat se snížením citlivosti malého množství živých mikroorganismů. Použije-li se specifická inaktivační látka, je nutno ověřit přiměřenými kontrolami, zda je systém schopen umožnit růst testovacího kmene.
Postup se validuje ověřením jeho schopnosti dokázat požadované snížení počtu živých zárodků.
Požadavky
Požadavky pro hodnocení protimikrobní účinnosti jsou v tabulkách 5.1.3-1 až 5.1.3-3 vyjádřeny v logaritmickém snížení počtu živých zárodků proti hodnotám získaným pro čerstvě naočkované přípravky.
Tab 5.1.3-1 Parenterální a oftalmologické přípravky
Logaritmické snížení počtu zárodků
6 h24 h7 d14 d28 d
BakterieA23--NR**
B-13-NI*
HoubyA--2-NI
B---1NI

* NI = bez zvýšení počtu
** NR = bez nálezu
Požadavky v řádku A vyjadřují doporučenou účinnost, které má být dosaženo. V oprávněných případech, kdy tyto požadavky nemohou být splněny, např. pro zvýšené riziko nežádoucích účinků, uplatní se požadavky uvedené v řádku B.
Tab 5.1.3-2 Přípravky k místnímu použití
Logaritmické snížení počtu zárodků
24 h7 d14 d28 d
BakterieA23-NI
B--3NI
HoubyA--2NI
B---NI

Požadavky v řádku A vyjadřují doporučenou účinnost, které má být dosaženo. V oprávněných případech, kdy tyto požadavky nemohou být splněny, např. pro zvýšené riziko nežádoucích účinků, uplatní se požadavky uvedené v řádku B.
Tab 5.1.3-3 Perorální přípravky
Logaritmické snížení počtu zárodků
14 d28 d
Bakterie3NI
Houby1NI

Výše uvedené požadavky vyjadřují doporučenou účinnost, které má být dosaženo.