5.1 Dodatky k technologii léčivých přípravků

5.1.1 Metody přípravy sterilních výrobků
Sterilita je nepřítomnost živých mikroorganismů. Sterilita výrobku se nemůže zaručit zkoušením, ale zajistí se použitím vhodných validovaných výrobních postupů. Je proto nezbytné prověřit vliv vybrané sterilizační metody výrobku (včetně jeho konečného obalu nebo balení) s ohledem na jeho účinnost a neporušenost. Rovněž je nezbytné tuto metodu validovat před jejím zavedením do praxe. Doporučuje se vybrat takový obal, který dovolí optimální způsob sterilizace. Není-li validovaný postup úzkostlivě dodržován, vzniká riziko nesterilního nebo poškozeného výrobku. Novou validaci je třeba provést při každé větší změně sterilizačního postupu, včetně změn v plnění sterilizátoru. Očekává se, že zásady správné výrobní praxe, jak jsou popsány např. v pokynech pro správnou výrobní praxi ES, se budou při návrhu postupu dodržovat, a to zvláště použitím:
- kvalifikovaného personálu s odpovídajícím školením,
- odpovídajících prostor,
- vhodného výrobního zařízení umožňujícího snadné čištění a sterilizaci,
- postačujících opatření k omezení mikrobiální kontaminace před sterilizací,
- validovaných postupů pro všechny kritické výrobní kroky,
- monitorování pracovního prostředí a postupů průběžných výrobních kontrol.
Opatření nezbytná pro minimalizaci mikrobiální kontaminace před sterilizací zahrnují použití vstupních materiálů s vhodně nízkou mikrobiální kontaminací. Mikrobiologické sledování a určení vhodných limitů může být vhodné pro složky, které se snadno kontaminují pro svůj původ, povahu nebo způsob přípravy.
Zde popsané metody se hlavně týkají inaktivace nebo odstranění bakterií, kvasinek a plísní. Pro biologické přípravky zvířecího nebo lidského původu nebo v případě, že takové materiály byly užity při výrobním postupu, je nezbytné při validaci prokázat, že postup je schopen odstranit nebo inaktivovat závažnou kontaminaci viry. Pokyny pro tyto postupy jsou např. v příslušných European Community Notes for Guidance.
Kdekoli je to možné, užívá se sterilizace v konečném obalu. Je-li užita plně validovaná sterilizace v konečném obalu párou, suchým teplem nebo ionizujícím zářením, může se se souhlasem oprávněné autority provádět parametrické uvolňování, což je uvolnění šarže sterilizovaných položek založené na údajích o postupu spíše než na základě předložení vzorku ke zkoušce na sterilitu.
Není-li sterilizace v konečném obalu možná, použije se filtrace filtry zadržujícími bakterie nebo aseptické zpracování. Kdekoli je to možné, použije se dodatečné ošetření výrobku (např. jeho zahřátí) v konečném obalu. Ve všech případech se požaduje, aby obal i uzávěr zajistily sterilitu výrobku po dobu jeho použitelnosti.
Hladina sterilizační jistoty
Ve vhodných případech se v dále uvedených metodách odkazuje na pojem "hladina sterilizační jistoty". Dosažení sterility u kteréhokoliv člena souboru členů podrobených sterilizaci nemůže být zaručeno ani prokázáno. Inaktivace mikroorganismů fyzikálními nebo chemickými prostředky sleduje exponenciální křivku. Zůstává tedy stále určitá statistická pravděpodobnost, že nějaký mikroorganismus může přežít sterilizační postup. Pro daný postup je pravděpodobnost přežití určena počtem, druhem a odolností přítomných mikroorganismů a prostředím, ve kterém se při ošetření nalézají. Hladina sterilizační jistoty sterilizačního postupu udává stupeň jistoty, s nímž uvažovaný postup vysterilizuje soubor sterilizovaných členů. Hladina sterilizační jistoty daného postupuje vyjádřena jako pravděpodobnost výskytu nesterilních položek v tomto souboru. Např. hladina sterilizační jistoty 10^-6 značí pravděpodobnost existence výskytu nejvýše jednoho životaschopného mikroorganismu v 1 . 10⁶ položek konečného výrobku. Hladina sterilizační jistoty postupu pro daný výrobek se stanoví vhodnými validačními studiemi.
Metody a podmínky sterilizace
Sterilizace se může provést některou z dále popsaných metod. Jejich modifikace nebo kombinace se může použít za předpokladu, že vybraný postup se validuje jak s ohledem na jeho účinnost, tak i na neporušenost výrobku, včetně jeho obalu nebo balení.
U všech metod sterilizace se sledují kritické podmínky, aby se potvrdilo dosažení předem stanovených podmínek v celé šarži během celého sterilizačního postupu. To platí ve všech případech, včetně těch, kde se použily doporučené podmínky.
Sterilizace v konečném obalu
Pro sterilizaci v konečném obalu je nezbytné vzít v úvahu nehomogennost fyzikálních, případně chemických podmínek ve sterilizátoru. Místo ve sterilizátoru, které je pro sterilizační agens dostupné nejpozději, se stanoví jak pro každý způsob plnění, tak i pro různé velikosti a typy obalů nebo balení, např. nejchladnější místo v autoklávu. Minimální letalita daná sterilizačním cyklem a jeho reprodukovatelnost se také určí, aby se zajistilo, že všechny náplně shodně dostanou specifické ošetření.
Při zavedení sterilizace v konečném obalu je třeba získávat data o průběhu rutinního užití, kdekoliv je to možné, monitorováním a vhodným záznamem fyzikálních, případně chemických podmínek dosažených v náplni uvnitř sterilizátoru během každého sterilizačního cyklu.
Sterilizace parou (zahřívání v autoklávu). Sterilizaci nasycenou párou pod tlakem je třeba dát přednost všude, kde je to možné, obzvláště pro vodné přípravky. Pro tuto metodu sterilizace v konečném obalu jsou základními podmínkami pro vodné přípravky 15 min zahřívání na nejméně 121 C. Lze použít i jiné kombinace teploty a času za předpokladu, že bylo dostatečně prokázáno, že vybraný postup poskytne přiměřenou a reprodukovatelnou hladinu smrcení při rutinním používání se stanovenou tolerancí. Použité postupy a opatření jsou takové, aby se dosáhlo hladiny sterilizační jistoty 10^-6 nebo lepší. Pokyny zabývající se validací pomocí F₀ jsou poskytnuty dále (5.1.5).
Při sterilizaci se získávají znalosti o fyzikálních podmínkách (teplota a tlak) uvnitř autoklávu. Teplota se obvykle měří pomocí teplotních čidel umístěných v obalech zastupujících výrobek a v předem určeném nejchladnějším místě naplněného sterilizátoru. Podmínky se při každém cyklu vhodně zaznamenávají, např. jako teplotní graf nebo jinými vhodnými prostředky.
Kde se provádí biologické vyhodnocení, získává se pomocí vhodných biologických indikátorů (5.1.2).
Sterilizace suchým teplem. Pro tuto metodu sterilizace v konečném obalu jsou základními podmínkami nejméně 2 h při nejméně 160 C. Lze použít i jiné kombinace teploty a času za předpokladu, že bylo dostatečně prokázáno, že vybraný postup poskytne přiměřenou a reprodukovatelnou hladinu smrcení při rutinním používání se stanovenou tolerancí. Použité postupy a opatření jsou takové, aby se dosáhlo hladiny sterilizační jistoty 10^-6 nebo lepší.
Tato sterilizace se provádí v horkovzdušných sterilizátorech vybavených nucenou cirkulací vzduchu nebo v podobných zařízeních vyvinutých speciálně pro tento účel. Sterilizátor se plní tak, aby v celé náplni byla dosažena stejná teplota. Teplota se obvykle měří pomocí teplotních čidel umístěných v obalech zastupujících výrobek a v předem určeném nejchladnějším místě naplněného sterilizátoru. Během celého cyklu se teplota vhodným způsobem zaznamenává.
Kde se provádí biologické vyhodnocení, získává se pomocí vhodných biologických indikátorů (5.1.2).
Suché teplo při teplotách vyšších než 220 °C se často používá ke sterilizaci a depyrogenizaci laboratorního skla. V tomto případě se může použít pokles o 3 log tepelně odolného endotoxinu místo biologických indikátorů (5.1.2).
Sterilizace ionizujícím zářením. Sterilizace touto metodou se dosáhne vystavením výrobku ionizujícímu záření ve formě gama-záření z vhodného zdroje (např. kobalt-60) nebo svazku elektronů o vysoké energii vycházejících z vhodného urychlovače elektronů.
V některých státech jsou směrnice, které stanoví pravidla pro použití ionizujícího záření ke sterilizačním účelům, např. v příslušných European Community Notes for Guidance.
Pro tuto metodu sterilizace v konečném obalu je doporučena absorbovaná dávka 25 kGy. Jiné dávky se mohou použít za předpokladu, že bylo dostatečně prokázáno, že vybraná dávka poskytne přiměřenou a reprodukovatelnou hladinu smrcení při rutinním používání se stanovenou tolerancí. Použité postupy a opatření jsou takové, aby se dosáhlo hladiny sterilizační jistoty 10^-6 nebo lepší.
Při sterilizačním postupu se sleduje výrobkem absorbovaná dávka radiace za použití stanovených dozimetrických postupů, které jsou nezávislé na počtu dávek. Dozimetry se kalibrují standardními zdroji referenční radiace, které jsou dodávány s přístroji od výrobce. Intervaly kalibrace by neměly přesáhnout 1 rok.
Kde se provádí biologické vyhodnocení, získává se pomocí vhodných biologických indikátorů (5.1.2).
Sterilizace plynem. Tato metoda sterilizace se používá výhradně tam, kde není jiná vhodná alternativa. Je nezbytné zajistit, aby plyn a vlhkost dokonale pronikly do sterilizovaného materiálu, a dále zajistit odstranění plynu za podmínek předem stanovených tak, aby jakékoli zbytky plynu, případně jeho rozkladných produktů, ve sterilizovaném výrobku byly pod koncentrací, která by při používání výrobku mohla mít toxické účinky. Pokyny pro použití ethylenoxidu jsou uvedeny např. v příslušných European Community Notes for Guidance.
Kdekoliv je to možné, měří se a zaznamenává koncentrace plynu, relativní vlhkost, teplota a doba trvání postupu. Měření se provádí v místě, kde jsou nejpozději dosaženy sterilizační podmínky stanovené při validaci procesu.
Účinnost postupu použitého při každé sterilizované náplni se kontroluje vhodným biologickým indikátorem (5.1.2).
Přiměřený vzorek každé šarže se zkouší na sterilitu před uvolněním šarže (2.6.1).
Filtrace
Určité účinné látky a výrobky, které se nemohou sterilizovat v konečných obalech, se mohou podrobit filtračnímu postupu, který používá filtry typu, jenž prokázal uspokojivé výsledky při zátěžových zkouškách užívajících vhodné mikroorganismy, např. suspenze Pseudomonas diminuta (ATCC 19146, NCIMB 11091, CIP 103020 nebo CCM 4623). Doporučuje se provést zátěž při koncentraci nejméně 10⁷ jednotek vytvářejících kolonie/cm² účinné plochy filtru. Suspenze se připraví v živné půdě z hydrolyzátů sóji a kaseinu a po průchodu filtrem se asepticky odebere a inkubuje aerobně při 32 °C. Takové výrobky vyžadují zvláštní předběžná opatření. Výrobní postup a prostředí jsou navrženy tak, aby omezovaly mikrobiální kontaminaci, a pravidelně se podrobují příslušnému sledování. Výrobní zařízení, obaly a uzávěry, a kdekoli je to možné, také vstupní látky se podrobí vhodnému sterilizačnímu postupu. Doporučuje se provádět filtraci co nejblíže k místu plnění. Operace následující po filtraci se provádějí v aseptických podmínkách.
Roztoky se filtrují membránovými filtry zadržujícími bakterie. Jmenovitá velikost pórů těchto filtrů je 0,22 μm nebo menší nebo se použije jiný typ filtru, o němž je známo, že má odpovídající vlastnost zachytávat bakterie. Vhodnými opatřeními se zabrání ztrátě roztoku způsobené absorpcí na filtr a také uvolňování kontaminant z filtru. Je třeba věnovat pozornost mikrobiální kontaminaci před filtrací, kapacitě filtru, velikosti šarže a době filtrace. Filtr se nepoužívá déle, než bylo schváleno při validaci kombinace filtru a dotyčného výrobku.
Neporušenost sestaveného sterilizačního filtru se před použitím ověří a po použití potvrdí provedením zkoušky vhodné pro typ použitého filtru a fázi zkoušení, např. bublinkovým testem, testem difuzního toku nebo testem tlakové ztráty.
Pro možná dodatečná rizika filtrační metody ve srovnání s ostatními sterilizačními postupy může být v případech, kde nelze zajistit nízkou mikrobiální kontaminaci jinými prostředky, vhodné použít předfiltraci filtrem zadržujícím bakterie.
Aseptická příprava
Cílem aseptického postupu je udržet sterilitu výrobku složeného ze součástí, z nichž každá byla sterilizována některou z výše popsaných metod. Toho se dosáhne použitím podmínek a zařízení určených k zábraně mikrobiální kontaminace. Aseptický postup může zahrnovat aseptické plnění výrobku do systémů obal-uzávěr, aseptické míchání složek následované aseptickým plněním a balením.
Pro udržení sterility složek a výrobků při výrobě je třeba věnovat zvláštní pozornost zejména:
- prostředí,
- personálu,
- kritickým povrchům,
- sterilizaci systému obal-uzávěr a postupům přepravy,
- maximální době uchovávání přípravku před rozplněním do konečných obalů.
Postup validace obsahuje vhodnou kontrolu všeho výše uvedeného a kontrola postupu se provádí pravidelně pomocí zkoušek, které postup napodobí a používají mikrobiologické pomnožovací půdy, které se potom inkubují a vyšetřují na mikrobní kontaminaci (zkoušky pomocí rozplněných půd). Navíc před uvolněním každé šarže jakéhokoli výrobku, sterilizované filtrací nebo též aseptickým zpracováním, se přiměřený počet vzorků přezkouší na sterilitu (2.6.1).

5.1.2 Biologické indikátory pro sterilizaci
Biologické indikátory jsou standardizované přípravky z vybraných mikroorganismů používané k ověření účinnosti sterilizačního postupu. Obvykle je tvoří populace bakteriálních spor umístěná na inertním nosiči, např. proužku filtračního papíru, krycím sklíčku nebo trubičce z plastu. Naočkovaný nosič je pokryt tak, aby byl chráněn před jakýmkoliv poškozením nebo kontaminací, přičemž sterilizační agens může vejít do styku s mikroorganismy. Suspenze spor může být též v zatavených ampulích. Biologické indikátory se připravují tak, aby se mohly uchovávat v určených podmínkách; je vyznačena doba exspirace.
Mikroorganismy téhož bakteriálního druhu, jako jsou bakterie používané v přípravě biologických indikátorů, se mohou očkovat přímo do tekutého výrobku, který se má sterilizovat, nebo do tekutého výrobku, který je mu podobný. V tomto případě se však prokáže, že tekutý výrobek nemá inhibiční účinek na použité spory, zvláště na jejich klíčení.
Biologický indikátor je charakterizován jménem použitého bakteriálního druhu, číslem kmene v původní sbírce, počtem živých spor na nosiči a hodnotou D. Hodnota D je hodnota sterilizačního parametru (doba trvání nebo absorbovaná dávka), která je zapotřebí ke snížení počtu živých organismů na 10 % původní hodnoty. To je významné jedině v dobře definovaných experimentálních podmínkách. Obsaženy jsou pouze deklarované mikroorganismy. Mohou se používat biologické indikátory obsahující na jednom nosiči více než jeden bakteriální druh. Uvedou se informace o živné půdě a podmínkách inkubace.
Doporučuje se, aby indikátorové organismy byly umístěny na místa, o nichž se předpokládá nebo, kde je to možné, na nichž bylo dříve fyzikálním měřením zjištěno, že jsou méně přístupná sterilizačnímu agens. Po expozici sterilizačnímu agens se nosiče spor za použití aseptického postupu přenesou do živných půd tak, aby se předešlo jejich kontaminaci. Mohou se použít biologické indikátory, které obsahují ampulku s živnou půdou umístěnou přímo v obale chránícím naočkovaný nosič.
Výběr indikátorových mikroorganismů se provádí tak, že:
Po inkubaci růst zkušebního mikroorganismu, který byl podroben sterilizačnímu postupu, prokazuje, že tento postup byl nedostatečný.

a) v porovnání s patogenními mikroorganismy a mikroorganismy, jež mohou výrobek potenciálně kontaminovat, je u zkušebního kmene velká rezistence k jednotlivým sterilizačním postupům,

b) zkušební kmen je nepatogenní,

c) zkušební kmen se snadno kultivuje.

1. Sterilizace parou. Použití biologických indikátorů určených pro sterilizaci parou se doporučuje pro validaci sterilizačních cyklů. Doporučují se spory Bacillus stearothermophilus (např. ATCC 7953, NCTC 10007, NCIMB 8157, CCM 4395 nebo CIP 52.81). Počet živých spor na nosiči přesahuje 5 . 10⁵. Hodnota D při 121 °C přesahuje 1,5 min. Je ověřeno, že 6min expozice biologických indikátorů páře při (121 ± 1) °C nechává spory schopné oživení a že při 15min expozici biologického indikátoru páře při (121 ± 1) °C zkušební mikroorganismy nevyrostou.

2. Sterilizace suchým teplem. Pro přípravu biologických indikátorů se doporučují spory Bacillus subtilis (např. var. niger ATCC 9372, NCIMB 8058, CCM 4624 nebo CIP 77.18). Počet živých spor na nosiči přesahuje 1 .10⁵ a hodnota D je asi 5 min až 10 min. Suché teplo při teplotě vyšší než 220 °C se často používá ke sterilizaci a depyrogenizaci skleněných předmětů. V tomto případě se místo biologických indikátorů může k důkazu snížení o 3 log použít bakteriální endotoxin rezistentní na teplo.

3. Sterilizace ionizujícím zářením. K monitorování běžných operací se mohou použít biologické indikátory jako doplněk stanovení účinnosti zvolené dávky radiační energie, zvláště v případě sterilizace urychlenými elektrony. Doporučují se spory Bacillus pumilus (např. ATCC 27.142, NCTC 10327, NCIMB 10692, CCM 4625 nebo CIP 77.25). Počet živých spor na nosiči přesahuje 1 .10⁷. Hodnota D přesahuje 1,9 kGy. Je ověřeno, že zkušební mikroorganismy nevyrostou, jestliže byl biologický indikátor vystaven 25 kGy (minimální absorbovaná dávka).

4. Sterilizace plynem. Použití biologických indikátorů je nezbytné při všech postupech sterilizace plynem, jak pro validaci sterilizačního cyklu, tak pro běžné operace. Počet živých spor na nosiči přesahuje 5 . 10⁵ Pro peroxid vodíku a kyselinu peroctovou se doporučují spory Bacillus stearothermophilus (např. ATCC 7953, NCTC 10007, NCIMB 8157, CCM 4395 nebo CIP 52.81), pro ethylenoxid a formaldehyd se doporučují spory Bacillus subtilis (např. var. niger ATCC 9372, NCIMB 8058 CCM 4624 nebo CIP 77.18). Pro použité postupy jsou známy parametry rezistence: např. pro ethylenoxid přesahuje hodnota D 2,5 min pro zkušební cyklus zahrnující 600 mg/l ethylenoxidu při 54 °C a 60% relativní vlhkosti. Je ověřeno, že při výše popsaném cyklu nedojde k růstu zkušebních mikroorganismů, pokud byly biologické indikátory vystaveny 60min expozici. Pokud byla expozice indikátorů jen 15 min a teplota nižší (600 mg/l, 30 °C a 60% relativní vlhkost), zůstanou spory schopné oživení. Je důležité, aby biologický indikátor byl schopen zjistit, že vlhkost ve sterilizátoru ani ve sterilizovaném výrobku nedostačuje k zajištění inaktivace dehydrovaných mikroorganismů. Při 60min expozici indikátorů 600 mg/l ethylenoxidu při 54 °C bez zvlhčení zůstanou spory schopné oživení.

5.1.3 Účinnost protimikrobních konzervačních látek
Pokud léčivý přípravek nemá sám dostačující protimikrobní účinnost, může se, zvláště u přípravků obsahujících vodu, přidat protimikrobní konzervační látka, která za obvyklých podmínek skladování nebo užívání zamezí pomnožování mikrobiální kontaminace nebo ji omezí. Používá se zvláště u vícedávkových balení a chrání pacienta před infekcí a před poškozením způsobeným zkažením přípravku. Protimikrobní konzervaci nelze použít k nahrazení správné výrobní praxe.
Účinnost konzervační látky může být zvýšena nebo snížena účinnou látkou léčivého přípravku nebo jeho celkovým složením, případně jeho obalem nebo uzávěrem. Protimikrobní účinnost léčivého přípravku se stanoví v jeho konečném balení a v průběhu trvání jeho použitelnosti, aby se zjistilo, že se účinnost během uchovávání nenarušila. Toto zkoušení se má provádět na vzorcích odebraných z konečného obalu bezprostředně před zkoušením.
V průběhu vývoje léčivého přípravku se prokazuje, že protimikrobní účinnost přípravku jako takového anebo, pokud to je nutné, s přidáním vhodné konzervační látky nebo látek zajišťuje dostačující ochranu před nežádoucími účinky, jež mohou pocházet z mikrobiální kontaminace nebo z jejího pomnožení v průběhu uchovávání a používání přípravku.
Účinnost protimikrobního působení se prokazuje dále popsanou zkouškou, která není určena k užití pro běžné kontrolní účely.
Zkouška účinností protimikrobní konzervace
Podstatou zkoušky je naočkování vhodných mikroorganismů, pokud možno do léčivého přípravku v jeho konečném obalu, uchovávání naočkovaného přípravku při předepsané teplotě, odebírání vzorků z obalu v určených časových intervalech a stanovení počtu mikroorganismů ve vzorcích takto odebraných.
Konzervační vlastnosti přípravků jsou dostačující, jestliže při zkoušce za předepsané teploty a v předepsaných časech se počet mikroorganismů v naočkovaném přípravku významně sníží nebo nevzroste. Požadavky na pokles počtu mikroorganismů v závislosti na době se liší podle druhu přípravků a stupně požadované ochrany (viz tabulky 5.1.3-1 až 5.1.3-3).
Zkušební kmeny

Pseudomonas aeruginosa	ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, CCM 1961, CNCTC Ps 37/65
Staphylococcus aureus	ATCC 6538, NCTC 10788, NCIMB 9518,CIP 4.83, CCM 4516, CNCTC Mau 29/58
Candida albicans	ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72, CCM 8215, CNCTC 59/91
Aspergillus niger	ATCC 16404, IMI 149007, IP 1431.83, CCM 8222

Zkoušky se provádějí s každým kmenem samostatně. Určené kmeny se doplňují, když je to vhodné, jinými kmeny nebo druhy, které mohou představovat pravděpodobné kontaminanty přípravku. Např. se doporučuje, aby pro všechny perorální přípravky byla použita Escherichia coli (ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126, CCM 5417) a Zygosaccharomyces rouxii (NCYC 381, IP 2021.92, CCM 8224) pro perorální přípravky obsahující vyšší koncentrace cukru.
Příprava inokula
Ze sbírkových kultur se bakterie přeočkují na povrch živné půdy B (2.6.12) a houby na povrch živné půdy C bez přidání antibiotik (2.6.12). Bakterie se inkubují 18 h až 24 h při 30 °C až 35 °C, C. albicans 48 h při 20 °C až 25 °C a A. niger při 20 °C až 25 °C po dobu jednoho týdne nebo do dosažení dobré sporulace. Kmeny lze přeočkovávat po oživení dříve, než dosáhnou optimálního stavu, ale počet přeočkování má být omezen na minimum.
Narostlé kolonie bakterií a C. albicans se smyjí sterilním roztokem obsahujícím chlorid sodný R (9 g/l) a pepton R (1 g/l), převedou se do vhodné nádoby a stejným roztokem se naředí tak, aby obsahovaly 108 mikroorganismů v 1 ml. Kolonie A. niger se smyjí a naředí asi na 10⁸ v 1 ml stejným způsobem za pomoci sterilního roztoku obsahujícího chlorid sodný R (9 g/l) a polysorbát 80 R (0,5 g/l).
Z každé suspenze se ihned odebere vzorek a stanoví se počty jednotek vytvářejících kolonie v 1 ml jednotlivé suspenze metodou stanovení počtu na pevných půdách nebo metodou membránové filtrace (2.6.12). Tato hodnota slouží ke stanovení velikosti inokula a je východiskem pro provedení zkoušky. Suspenze se použijí ihned po přípravě.
Postup zkoušky
Ke stanovení počtu živých mikrobů v naočkovaném přípravku se použije stejná živná půda jako při pomnožování příslušného mikroorganismu.
Naočkuje se série balení zkoušeného přípravku, každé balení suspenzí jednoho zkušebního kmene tak, aby v 1 g nebo v 1 ml přípravku bylo 10⁵ až 10⁶ mikroorganismů. Objem suspenze inokula nemá překročit 1 % objemu přípravku. Pečlivě se promísí, aby se dosáhlo stejnoměrného rozptýlení inokula.
Naočkovaný přípravek se uchovává při teplotě 20 °C až 25 °C, chráněn před světlem. Z každého obalu se odebírá vhodný vzorek, obvykle 1 g nebo 1 ml, a to ihned po naočkování a dále ve vhodných intervalech podle druhu přípravku a stanoví se počet živých zárodků metodou stanovení počtu na pevných půdách nebo metodou membránové filtrace (2.6.12). K odstranění zbytkové protimikrobní účinnosti se použije ředění, filtrace nebo specifická inaktivační látka. Použije-li se ředění, je třeba počítat se snížením citlivosti malého množství živých mikroorganismů. Použije-li se specifická inaktivační látka, je nutno ověřit přiměřenými kontrolami, zda je systém schopen umožnit růst testovacího kmene.
Postup se validuje ověřením jeho schopnosti dokázat požadované snížení počtu živých zárodků.
Požadavky
Požadavky pro hodnocení protimikrobní účinnosti jsou v tabulkách 5.1.3-1 až 5.1.3-3 vyjádřeny v logaritmickém snížení počtu živých zárodků proti hodnotám získaným pro čerstvě naočkované přípravky.
Tab 5.1.3-1 Parenterální a oftalmologické přípravky

Logaritmické snížení počtu zárodků
		6 h	24 h	7 d	14 d	28 d
Bakterie	A	2	3	-	-	NR**
	B	-	1	3	-	NI*
Houby	A	-	-	2	-	NI
	B	-	-	-	1	NI

^* NI = bez zvýšení počtu
^** NR = bez nálezu
Požadavky v řádku A vyjadřují doporučenou účinnost, které má být dosaženo. V oprávněných případech, kdy tyto požadavky nemohou být splněny, např. pro zvýšené riziko nežádoucích účinků, uplatní se požadavky uvedené v řádku B.
Tab 5.1.3-2 Přípravky k místnímu použití

Logaritmické snížení počtu zárodků
		24 h	7 d	14 d	28 d
Bakterie	A	2	3	-	NI
	B	-	-	3	NI
Houby	A	-	-	2	NI
	B	-	-	-	NI

Požadavky v řádku A vyjadřují doporučenou účinnost, které má být dosaženo. V oprávněných případech, kdy tyto požadavky nemohou být splněny, např. pro zvýšené riziko nežádoucích účinků, uplatní se požadavky uvedené v řádku B.
Tab 5.1.3-3 Perorální přípravky

Logaritmické snížení počtu zárodků
	14 d	28 d
Bakterie	3	NI
Houby	1	NI

Výše uvedené požadavky vyjadřují doporučenou účinnost, které má být dosaženo.

5.1.4 Mikrobiologická jakost léčivých přípravků
Při výrobě, balení, skladování a distribuci léčivých přípravků se k zajištění jejich mikrobiologické jakosti použijí vhodné prostředky. Léčivé přípravky mají vyhovovat dále uvedeným požadavkům.
Kategorie 1
Přípravky, u nichž je v platném článku předepsána sterilita aplikační formy, nebo jiné přípravky, jež jsou označeny jako sterilní.
- Zkouška na sterilitu (2.6.1).
Kategorie 2
Přípravky k místnímu použití nebo k použití v dýchacím ústrojí s výjimkou přípravků, u nichž je předepsána sterilita.
- Celkový počet živých aerobů (2.6.12). Nejvýše 10² aerobních bakterií a hub v gramu nebo v mililitru.
- Nejvýše 10¹ enterobakterií a některých jiných gramnegativních bakterií v gramu nebo v mililitru (2.6.13).
- Nepřítomnost Pseudomonas aeruginosa (v 1,0 g nebo v 1,0 ml) (2.6.13).
- Nepřítomnost Staphylococcus aureus (v 1,0 g nebo v 1,0 ml) (2.6.13).
Kategorie 3
Kategorie 4
Přípravky z rostlin sestávající jen z jedné nebo více rostlinných drog (celých, rozdrobněných nebo práškovaných).

A. Přípravky z rostlin, k nimž se před použitím přidává vroucí voda.
- Celkový počet živých aerobů (2.6.12). Nejvýše 10⁷ aerobních bakterií a nejvýše 10⁵ hub v gramu nebo v mililitru.
- Nejvýše 10² Escherichia coli v gramu nebo v mililitru (2.6.13 za použití vhodného zředění).

A. Přípravky k perorálnímu a rektálnímu použití.
- Celkový počet živých aerobů (2.6.12). Nejvýše 10³ aerobních bakterií a nejvýše 10² hub v gramu nebo v mililitru.
- Nepřítomnost Escherichia coli (v 1,0 g nebo v 1,0 ml) (2.6.13).

B. Přípravky z rostlin, k nimž se před použitím vroucí voda nepřidává.
- Celkový počet živých aerobů (2.6.12). Nejvýše 10⁵ aerobních bakterií a nejvýše 10⁴ hub v gramu nebo v mililitru.
- Nejvýše 10³ enterobakterií a některých jiných gramnegativních bakterií v gramu nebo v mililitru (2.6.13).
- Nepřítomnost Escherichia coli (v 1,0 g nebo v 1,0 ml) (2.6.13).
- Nepřítomnost Salmonella (v 10,0 g nebo v 10,0 ml) (2.6.13).

B. Přípravky k perorálnímu podání obsahující suroviny přírodního živočišného, rostlinného nebo nerostného původu, které nelze protimikrobně ošetřit a pro něž oprávněná autorita připouští mikrobiologické znečištění suroviny překračující 10³ živých mikroorganismů v gramu nebo v mililitru. Nevztahuje se na přípravky z rostlin popsané ve 4. kategorii.
- Celkový počet živých aerobů (2.6.12). Nejvýše 10⁴ aerobních bakterií a nejvýše 10² hub v gramu nebo v mililitru.
- Nejvýše 10² enterobakterií a některých jiných gramnegativních bakterií v gramu nebo v mililitru (2.6.13).
- Nepřítomnost Salmonella (v 10,0 g nebo v 10,0 ml) (2.6.13).
- Nepřítomnost Escherichia coli (v 1,0 g nebo 1,0 ml) (2.6.13).
- Nepřítomnost Staphylococcus aureus (v 1,0 g nebo v 1,0 ml) (2.6.13).

5.1.5 Používání pojmu F₀ při sterilizaci vodných přípravků parou
Tato část podává informace a návod, ale není závaznou částí lékopisu.
Hodnota F₀ sterilizačního postupu využívajícího nasycenou páruje letalita vyjádřená jako odpovídající čas v minutách při teplotě 121 °C ve vztahu k mikroorganismům majícím hodnotu Z = 10 při sterilizaci výrobku v jeho konečném obalu.
Celková hodnota F₀ postupu bere v úvahu všechny zahřívací a chladicí fáze cyklu a může se vypočítat integrací smrtících hodnot všech teplotních intervalů s ohledem na dobu jejich trvání.
Jestliže je cyklus sterilizace parou navržen na základě metody F_0, je nezbytné věnovat velkou pozornost přiměřenému jištění sterility. Navíc může být také nutné vedle validace postupu provádět při běžné výrobě trvalé a přísné mikrobiologické sledování tak, aby se prokázalo, že se mikrobiologické parametry pohybují v rámci platných mezí s cílem dosáhnout hladinu sterilizační jistoty 10^-6 nebo lepší.
V případě sterilizace parou se hodnota Z vztahuje k tepelné odolnosti mikroorganismu v závislosti na teplotě. Hodnota Z je změna teploty potřebná ke změně hodnoty D o faktor 10.
Hodnota D (decimální redukční hodnota) je hodnota parametru sterilizace (čas nebo absorbovaná dávka) potřebná ke snížení počtu živých organismů na 10 % původního počtu. Hodnota D má význam jedině při zachování přesně definovaných experimentálních podmínek. Používají se následující matematické vztahy:
$F_0=D_{121}\log N_0-\log N={\mathrm{LD}}_{121}\log \mathrm{IF},$
kde značí:
D₁₂₁ – hodnotu D referenčních spor (5.1.2) při teplotě 121 °C,
N₀ – počáteční počet živých mikroorganismů,
N – konečný počet živých mikroorganismů,
IF – inaktivační faktor.
$Z=\frac{T_2-T_1}{\log D_1-\log D_2},$
kde značí:
D₁ – hodnotu D mikroorganismu při teplotě T₁,
D₂ – hodnotu D mikroorganismu při teplotě T₂.
$\mathrm{IF}=N_o-N={10}^{\text{t/D}}$
kde značí:
t – dobu expozice,
D – hodnotu D mikroorganismu za podmínek expozice.