2.2.29 Kapalinová chromatografie
Kapalinová chromatografie je separační metoda, kde mobilní fází je kapalina a stacionární fází naplněnou do kolony je buď jemně rozptýlená pevná látka, nebo kapalina nanesená na pevný nosič, nebo pevný nosič, který je chemicky modifikován navázáním organických skupin.
Kapalinová chromatografie je založena na mechanismu adsorpce, rozdělování, iontové výměny nebo vylučování.
Zařízení. Přístroj se obvykle skládá z čerpacího systému, dávkovacího zařízení (injekční stříkačka nebo nastřikovaní ventil), chromatografické kolony, detektoru a zapisovače. Mobilní fáze je obvykle přiváděna pod tlakem z jednoho nebo více zásobníků a protéká kolonou konstantní rychlostí a potom detektorem.
Teplota chromatografické kolony je udržována konstantní. Složení předepsané mobilní fáze může být buď konstantní během celého chromatografického procesu (izokratická eluce), nebo se může měnit podle definovaného programu (gradientová eluce).
Použitý detektor umožňuje stanovení množství sledovaných látek eluovaných z kolony. Detekce je obvykle založena na absorpční spektrofotometru. Diferenční refraktometrie, fluorimetrie; spalovací a elektrochemické metody jsou také používány.
Pracovní postup. Kolona se uvede do rovnovážného stavu s předepsanou mobilní fází. Připraví se roztok zkoušené látky a porovnávací roztok nebo roztoky tak, jak je předepsáno. Roztoky nesmí obsahovat pevné částice. Za použití porovnávacích roztoků se určí vhodné nastavení přístroje a nastřikované množství potřebné pro přiměřenou odezvu. Provedou se opakované nástřiky pro ověření reprodukovatelnosti odezvy, a je-li to požadováno, stanoví se počet teoretických pater.
Nastříknou se roztoky a zaznamenají se výsledné chromatogramy. Provedou se opakované nástřiky k ověření reprodukovatelnosti odezvy. Stanoví se plochy píků sledovaných látek, případně výšky píků, leží-li hodnota faktoru symetrie píku vypočtená podle vzorce uvedeného níže mezi 0,80 a 1,20. V aplikacích vyžadujících gradientovou eluci je třeba použít stanovení ploch píků. Je-li použit vnitřní standard, zkontroluje se, zda není žádný pík zkoušené látky překryt Pikem vnitřního standardu.
Ze získaných hodnot se vypočte obsah stanovované složky nebo složek. Je-li požadován procentuální obsah jedné nebo více složek zkoušené látky, vypočte se stanovením plochy píku nebo píků jako procenta celkové plochy všech píků vyjma píků rozpouštědla nebo jakéhokoliv přidaného činidla (metoda normalizace). Pak se doporučuje použití automatického integrátoru a zesilovače s širokým rozsahem.
Faktor symetrie píku se vypočte z výrazu:
$\frac{b_{0,05}}{2A},$
v němž značí:
b_0,05 - šířku píku v jedné dvacetině jeho výšky (mm),
A - vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině výšky píku (mm).
Rozlišení (R_S) se vypočte ze vzorce:
$R_s=\frac{\text{1,18}{t}_{\mathrm{Rb}}-t_{\mathrm{Ra}}}{b_{0,5a}+b_{0,5b}},$
$t_{\mathrm{Rb}}>t_{\mathrm{Ra}}$
v němž značí:
t_Rb a t_Ra - vzdálenosti podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicemi spuštěnými z vrcholů dvou sousedních píků (mm),
b_0,5a a b_0,5b - šířky píků v polovině jejich výšky (mm).
Výsledky stanovení lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi měřenými píky v chromatogramu je větší než 1,0, pokud není předepsáno jinak.
Počet teoretických pater (n) se vypočte z údajů, získaných za izotermických podmínek ze vzorce:
$n=\text{5,54}{\frac{t_R}{b_{0,5}}}^2,$
v němž značí:
t_R - vzdálenost podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu sledovaného píku (mm),
b_0,5 - šířku píku v polovině jeho výšky (mm).
Kapacitní poměr (D_m) (známý též jako kapacitní faktor) je definován jako:
$D_m=\frac{\text{množství rozpuštěných látek ve stacionární fázi}}{\text{množství rozpuštěných látek v mobilní fázi}}=K\frac{V_s}{V_m},$
v němž značí:
K - rovnovážný rozdělovači koeficient,
V_s - objem stacionární fáze,
V_m - objem mobilní fáze.
Kapacitní poměr složky může být určen z chromatogramu s použitím vzorce:
$D_m=\frac{t_R-t_{R\text{'}}}{t_{R\text{'}}},$
v němž značí:
t_R - vzdálenost podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu píku odpovídajícího složce (mm),
t_R - vzdálenost podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu píku odpovídajícího nezadržované složce (mm).
Poměr signálu k šumu (S/N) je počítán ze vzorce:
$\text{S/N}=\frac{2H}{h_n},$
v němž značí:
H- výšku píku odpovídajícího dané složce na chromatogramu získaném s předepsaným porovnávacím roztokem,
h_n - absolutní hodnotu největší výchylky signálu šumu od základní linie na chromatogramu kontrolního roztoku získaného při slepé zkoušce a sledovaného v rozsahu úměrném 20násobku šířky píku v polovině jeho výšky na chromatogramu předepsaného porovnávacího roztoku a pozorovaného v místě rovnoměrně situovaném okolo místa, kde by se tento pík nacházel.