2.2 Fyzikální a fyzikálně-chemické metody
Příprava referenčních tlumivých roztoků
Tetraoxalat draselný 0,05 mol/l. 12,61 g C₄H₃KO₈ .2H₂O se rozpustí ve vodě R a doplní se jí do 1000,0 ml.
Hydrogenvínan draselný nasycený při 25 °C. Nadbytek C₄H₅KO₆ se intenzivně protřepává s vodou R při 25 °C. Přefiltruje se nebo dekantuje. Připravuje se těsně před použitím. Dihydrogencitronan draselný 0,05 mol/l. 11,41 g C₆H₇KO₇ se rozpustí ve vodě R a doplní se jí do 1000,0 ml. Připravuje se těsně před použitím.
Hydrogenftalan draselný 0,05 mol/l. 10,13 g C₈H₅KO₄ vysušeného při 110 °C až 135 °C se rozpustí ve vodě R a doplní se jí do 1000,0 ml.
Dihydrogenfosforečnan draselný 0,025 mol/l + hydrogenfosforečnan sodný 0,025 mol/l. 3,39 g KH₂PO₄ a 3,53 g Na₂HPO₄, oba vysušené po dobu 2 h při 110 °C až 130 °C, se rozpustí ve vodě R a doplní se jí do 1000,0 ml.
Dihydrogenfosforečnan draselný 0,0087 mol/l + hydrogenfosforečnan sodný 0,0303 mol/l. 1,18 g KH₂PO₄ a 4,30 g Na₂HPO₄, oba vysušené po dobu 2 h při 110 °C až 130 °C, se rozpustí ve vodě R a doplní se jí do 1000,0 ml.
Tetraboritan sodný 0,01 mol/l. 3,80 g Na₂B₄O₇ . 10H₂O se rozpustí ve vodě R a doplní se jí do 1000,0 ml. Uchovává se chráněn před vzdušným oxidem uhličitým.
Uhličitan sodný 0,025 mol/l + hydrogenuhličitan sodný 0,025 mol/l. 2,64 g Na₂CO₃ a 2,09 g NaHCO₃ se rozpustí ve vodě R a doplní se jí do 1000,0 ml.
Tab. 2.2.3-2 pH referenčních tlumivých roztoků při různých teplotách

Teplota (°C)	Tetraoxalat draselný 0,05 mol/l	Hydrogenvínan draselný (nasycený při 25 °C)	Dihydrogen-citronan draselný 0,05 mol/l	Hydrogenftalan draselný 0,05 mol/l	Dihydrogen-fosforečnan draselný 0,025 mol/l + hydrogenfosfo-rečnan sodný 0,025 mol/l	Dihydrogen-fosforečnan draselný 0,0087 mol/l + hydrogenfosfo-rečnan sodný 0,0303 mol/l	Tetraboritan sodný 0,01 mol/l	Uhličitan sodný 0,025 mol/l + hydrogen- uhličitan sodný 0,025 mol/l
	C4H3KO8 . . 2H2O	C4H5KO6	C6H7KO7	C8H5KO4	KH2PO4 + Na2HPO4	KH2PO4 + NA2HPO4	Na2B4O7 . . 10H2O	Na2CO3 + NaHCO3
15	1,67		3,80	4,00	6,90	7,45	9,28	10,12
20	1,68		3,79	4,00	6,88	7,43	9,23	10,06
25	1,68	3,56	3,78	4,01	6,87	7,41	9,18	10,01
30	1,68	3,55	3,77	4,02	6,85	7,40	9,14	9,97
35	1,69	3,55	3,76	4,02	6,84	7,39	9,10	9,93
$\frac{\mathrm{\Delta pH}}{\mathrm{\Delta t}}·$	+0,001	-0,0014	-0,0022	+0,0012	-0,0028	-0,0028	-0,0082	-0,0096

^* Změna pH na 1 °C
Tab. 2.2.11-1 Korekční faktor teploty v závislosti na tlaku

Destilační teplota	Korekční faktor k
do 100 °C	0,30
101 °C až 140 °C	0,34
141 °C až 190 °C	0,38
191 °C až 240 °C	0,41
nad 240 °C	0,45

2.2.24 Absorpční spektrofotometrie v infračervené oblasti
Spektrofotometry v infračervené oblasti se používají pro záznam spekter v oblasti od 4000 cm^-1 do 670 cm^-1 (2,5 μm až 15 μm) nebo v některých případech až do 200 cm^-1 (50 μm). Spektrofotometry s Fourierovou transformací využívají polychromatické záření a Fourierovou transformací se převádí spektrum z původních dat do frekvenční reprezentace. Mohou být také použity spektrofotometry opatřené optickým systémem schopným vytvářet monochromatické záření v měřené oblasti. Normálně je spektrum dáno jako funkce transmitance, poměrem intenzity propuštěného a dopadajícího záření.
Absorbance A je definována jako dekadický logaritmus převrácené hodnoty transmitance T a je vyjádřena vztahem:
$A={\log }_{10}\frac{1}{T}={\log }_{10}\frac{I_0}{I},$
v němž značí:
T - I/I₀,
I₀ - intenzitu dopadajícího monochromatického záření,
I - intenzitu prošlého monochromatického záření.
Příprava vzorku
Pro záznam s využitím propustnosti nebo absorpce. Látka se upraví jedním z následujících postupů.
Kapaliny. Kapalina se zkouší buď jako film mezi dvěma destičkami propustnými pro infračervené záření, nebo v kyvetě vhodné tloušťky rovněž propustné pro infračervené záření.
Kapaliny nebo pevné látky v roztoku. Připraví se roztok ve vhodném rozpouštědle. Zvolí se koncentrace a tloušťka kyvety tak, aby se získalo vhodné spektrum. Dobré výsledky se zpravidla získají s koncentracemi od 10 g/l do 100 g/l pro tloušťku kyvety 0,5 mm až 0,1 mm. Absorpce způsobená rozpouštědlem by měla být kompenzována vložením podobné kyvety s použitým rozpouštědlem do referenčního paprsku.
Pevné látky. Pevné látky se zkoušejí dispergované ve vhodné kapalině (suspenze) nebo v pevné látce (halogenidová tableta) podle toho, co je vhodnější. Je-li to v článku předepsáno, připraví se film z taveniny mezi dvěma destičkami propustnými pro infračervené záření.
Plyny. Plyny se zkoušejí v kyvetě propustné pro infračervené záření mající optickou dráhu asi 100 mm. Kyveta se evakuuje a naplní se na požadovaný tlak pomocí kohoutu nebo jehlového ventilu při použití vhodné trubice pro převod plynu mezi kyvetou a nádobou obsahující zkoušenou látku. Je-li to nutné, upraví se tlak v kyvetě na tlak atmosférický použitím plynu propustného pro infračervené záření (např. dusíku R nebo argonu R). K odstranění interference absorpce způsobené vodou, oxidem uhličitým nebo jinými atmosférickými plyny se vloží do referenčního paprsku stejná kyveta, která je buď evakuována, nebo naplněna plynem propustným pro infračervené záření.
Pro záznam s využitím mnohonásobné reflexe
Je-li tento záznam předepsán v článku, upraví se látka jednou z následujících metod.
Roztoky. Látka se rozpustí ve vhodném rozpouštědle za podmínek uvedených v článku. Roztok se odpaří na thalliumbromido-jodidové destičce nebo na jiné vhodné destičce.
Pevné látky. Látka se homogenně rozprostře na thalliumbromido-jodidové nebo jiné vhodné destičce.
Identifikace s použitím referenčních látek
Stejným způsobem se upraví jak zkoušená, tak i referenční látka a za stejných podmínek se zaznamenají spektra od 4000 cm^-1 do 670 cm^-1 (2,5 μm až 15 μm). Minima propustnosti (absorpční maxima) spektra zkoušené látky odpovídají polohou i relativní intenzitou hodnotám referenční látky (CRL).
Vykazují-li spektra zaznamenaná v pevném stavu rozdíly v polohách minim propustnosti (absorpčních maxim), zpracuje se stejným způsobem zkoušená i referenční látka tak, aby vykrystalizovaly nebo vznikly ve stejné formě, nebo se postupuje tak, jak je předepsáno v článku, a pak se zaznamenají spektra.
Identifikace s použitím referenčních spekter
Kontrola rozlišovací schopnosti. Zaznamená se spektrum 0,04 mm silného polystyrenového filmu. Rozdíl x (viz obr. 2.2.24-1) mezi procenty transmitance při maximu propustnosti A při 2870 cm^-1 (3,48 μm) a minimu propustnosti B při 2849,5 cm^-1 (3,51 μm) by měl být větší než 18. Rozdíly mezi procenty transmitance při maximu propustnosti C při 1589 cm^-1 (6,29 μm) a minimu propustnosti D při 1583 cm^-1 (6,32 μm) by měl být větší než 12.
Ověření stupnice vlnočtů. Stupnice vlnočtů může být ověřena použitím polystyrenového filmu, který má minima propustnosti (absorpční maxima) při vlnočtech v cm^-1 uvedených v tab. 2.2.24-1.
Tab. 2.2.24-1 Minima propustnosti (a přijatelná tolerance) polystyrenového filmu v cm^-1.

3060,0 (±1,5)

2849,5 (±1,5)

1942,9 (±1,5)

1601,2 (±1,0)

1583,0 (±1,0)

1154,5 (±1,0)

1028,3 (±1,0)

Pracovní postup. Zkoušená látka se připraví podle návodu uvedeného u referenčního spektra. Za pracovních podmínek, které byly použity při kontrole rozlišovací schopnosti, se zaznamená spektrum zkoušené látky a na něj se superponují absorpční pásy polystyrenu při 2849,5 cm^-1 (3,51 μm), 1601,2 cm^-1 (6,25 μm) a 1028,3 cm^-1 (9,72 μm). Porovnají se obě spektra a maxima polystyrenu uvedená výše. Použijí-li se polohy maxim polystyrenu jako referenční hodnoty, pak polohy význačných maxim spektra zkoušené látky musí odpovídat význačným maximům referenčního spektra s odchylkou nejvýše 0,5 % vlnočtové stupnice. Relativní intenzity maxim obou spekter by měly být shodné.
Nečistoty v plynech
Pro analýzu nečistot v plynech se použije kyveta propustná pro infračervené záření s vhodnou optickou dráhou (např. 1 m až 20 m). Naplní se způsobem uvedeným v odstavci Plyny. Detekce a kvantifikace nečistot se provede podle postupu uvedeného v článku.

Obr. 2.2.24-1 Typické spektrum polystyrenu používané při kontrole rozlišovací schopnosti

(a) Suspenze. Rozetře se malé množství zkoušené látky s minimálním množstvím tekutého parafinu R nebo jiné vhodné kapaliny; k přípravě vhodné suspenze stačí zpravidla 5 mg až 10 mg zkoušené látky. Suspenze se stlačí mezi dvě destičky propustné pro infračervené záření.

(b) Tableta. Není-li uvedeno jinak, rozetřou se 1 mg až 2 mg zkoušené látky s 300 mg až 400 mg jemně práškovaného a vysušeného bromidu draselného R nebo chloridu draselného R. Tato množství postačují zpravidla k přípravě tablety o průměru 13 mm a k získání spektra vhodné intenzity. Směs se pečlivě rozetře, stejnoměrně se jí naplní vhodná forma a slisuje se ve vakuu tlakem asi 800 MPa (8 t.cm^-2). Z různých příčin mohou vzniknout špatné tablety: např. nedostatečné nebo přílišné roztírání, vlhkost nebo jiné nečistoty v dispergujícím prostředí a nedostatečné rozmělnění částeček. Tableta se nepoužije, vykazuje-li při vizuální kontrole nejednotnou propustnost, nebo je-li transmitance při asi 2000 cm^-1 (5 μm) v nepřítomnosti specifického absorpčního pásu menší než 75 % bez kompenzace.

2.2.1 Čirost a stupeň opalescence tekutin
Použijí se stejné zkumavky z bezbarvého průhledného neutrálního skla s plochým dnem a s vnitřním průměrem 15 mm až 25 mm. Porovnává se zkoušená tekutina s čerstvě připravenou porovnávací suspenzí (příprava popsána níže) při výšce vrstvy 40 mm. Roztok se porovnává v rozptýleném denním světle za 5 min po přípravě porovnávací suspenze shora ve směru podélné osy zkumavky proti černému pozadí. Rozptyl světla má být takový, aby bylo možno snadno rozlišit porovnávací suspenzi I od vody R a porovnávací suspenzi II od porovnávací suspenze I.
Tekutina je čirá, jestliže její čirost je stejná jako u vody R nebo použitého rozpouštědla, zkoušeno za podmínek výše uvedených, nebo jestliže nejeví silnější opalescenci než porovnávací suspenze I.
Zkoumadla
Roztok hydraziniumsulfatu. 1,000 g hydraziniumsulfatu R se rozpustí ve vodě R a doplní se jí do 100,0 ml. Nechá se stát 4 až 6 h.
Roztok methenaminu. V kuželové baňce na 100 ml se skleněným uzávěrem se rozpustí 2,500 g methenaminu R v 25,0 ml vody R.
Základní suspenze pro opalescenci. K roztoku methenaminu v baňce se přidá 25,0 ml roztoku hydraziniumsulfatu. Promíchá se a nechá se stát 24 h. Tato základní suspenze je stálá dva měsíce. Uchovává se ve skleněných nádobách s intaktním povrchem. Suspenze nesmí přilnout ke stěně nádoby a před použitím se musí dobře promíchat.
Standard pro opalescenci. 15,0 ml základní suspenze pro opalescenci se doplní vodou R do 1000,0 ml. Čerstvě připravená suspenze může být uchovávána nejdéle 24 h.
Porovnávací suspenze. Připraví se v čas potřeby podle následující tab. 2.2.1-1 smícháním obou složek a protřepáním před použitím.
Tab. 2.2.1-1

	I	II	III	IV
Standard pro opalescenci	5,0 ml	10,0 ml	30,0 ml	50,0 ml
Voda R	95,0 ml	90,0 ml	70,0 ml	50,0 ml

2.2.2 Stupeň zbarvení tekutin
Hodnocení stupně zbarvení tekutin v barevné řadě hnědá, žlutá, červená se provádí jednou ze dvou metod níže uvedených, předepsaných v jednotlivých článcích.
Tekutina je bezbarvá, jestliže je stejného vzhledu jako voda R nebo rozpouštědlo, nebo není-li více zbarvena než porovnávací barevný roztok H₉ (tab. 2.2.2-2).
Metoda I
Použijí se stejné zkumavky z bezbarvého průhledného neutrálního skla s vnějším průměrem 12 mm. Porovnávají se 2,00 ml zkoušené tekutiny s 2,00 ml vody R nebo rozpouštědla nebo porovnávacího barevného roztoku (viz tabulky porovnávacích barevných roztoků), jak je předepsáno v článku. Porovnávání se provádí v rozptýleném denním světle proti bílému pozadí kolmo k podélné ose zkumavky.
Metoda II
Použijí se stejné zkumavky z bezbarvého průhledného neutrálního skla s plochým dnem a s vnitřním průměrem 15 mm až 25 mm. Porovnává se zkoušená tekutina s vodou R nebo rozpouštědlem nebo s porovnávacím barevným roztokem (viz tabulky porovnávacích barevných roztoků). Výška vrstvy je 40 mm. Porovnávání se provádí v rozptýleném denním světle proti bílému pozadí shora ve směru podélné osy zkumavky.
Zkoumadla
Základní barevné roztoky
Žlutý roztok
46,0 g chloridu železitého R se rozpustí v asi 900 ml směsi 25,0 ml kyseliny chlorovodíkové R a 975,0 ml vody R a doplní se do 1000,0 ml stejnou směsí. Titračně se stanoví skutečný obsah, který se upraví přidáním stejné směsi na 45,0 mg FeCl₃ . 6H₂O/ml. Roztok se uchovává chráněn před světlem.
Stanovení obsahu. K 10,0 ml připraveného roztoku v 250ml kuželové baňce se zabroušenou zátkou se přidá 15,0 ml vody R, 5,0 ml kyseliny chlorovodíkové R a 4,0 g jodidu draselného R. Baňka se uzavře, nechá se stát 15 min v temnu a poté se přidá 100 ml vody R. Uvolněný jod se titruje thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS za použití 0,5 ml roztoku škrobu R jako indikátoru, který se přidá před koncem titrace.
1 ml thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 27,03 mg FeCl₃ . 6H₂O.
Červený roztok
60,0 g chloridu kobaltnatého R se rozpustí asi v 900 ml směsi 25,0 ml kyseliny chlorovodíkové R a 975,0 ml vody R a doplní se do 1000,0 ml stejnou směsí. Titračně se stanoví skutečný obsah, který se upraví přidáním stejné směsi na 59,5 mg CoCl₂ . 6H₂O/ml.
Stanovení obsahu. K 5,0 ml připraveného roztoku v 250ml kuželové baňce se zabroušenou zátkou se přidá 5,0 ml peroxidu vodíku zředěného R, 10,0 ml roztoku hydroxidu sodného R (300 g/l) a opatrně se vaří 10 min. Po ochlazení se přidá 60 ml kyseliny sírové zředěné R a 2,0 g jodidu draselného R. Baňka se uzavře a vzniklá sraženina se rozpustí mírným třepáním. Uvolněný jod se titruje thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS za použití 0,5 ml škrobu RS jako indikátoru, který se přidá před koncem titrace. Titruje se do vzniku růžového zbarvení.
1 ml thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 23,79 mg CoCl₂ . 6H₂O.
Modrý roztok
63,0 g síranu měďnatého R se rozpustí asi v 900 ml směsi 25,0 ml kyseliny chlorovodíkové R a 975,0 ml vody R a doplní se do 1000,0 ml stejnou směsí. Stanoví se skutečný obsah, který se upraví přidáním stejné směsi na 62,4 mg CuSO₄ . 5H₂O/ml.
Stanovení obsahu. K 10,0 ml připraveného roztoku v 250ml kuželové baňce se zabroušenou zátkou se přidá 50,0 ml vody R, 12,0 ml kyseliny octové zředěné R a 3,0 g jodidu draselného R. Uvolněný jod se titruje thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS za použití 0,5 ml škrobu RS jako indikátoru, který se přidá před koncem titrace. Titruje se do vzniku slabě hnědého zbarvení.
1 ml thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 24,97 mg CuSO₄ . 5H₂O.
Standardní barevné roztoky
Smícháním tří základních barevných roztoků se připraví pět standardních barevných roztoků (tab. 2.2.2-1).
Tab. 2.2.2-1

Standardní barevný roztok	Množství roztoku v ml
	žlutý roztok	červený roztok	modrý roztok	kyselina chlorovodíková 10 g/l
H (hnědý)	3,0	3,0	2,4	1,6
HŽ (hnědožlutý)	2,4	1,0	0,4	6,2
Ž (žlutý)	2,4	0,6	0,0	7,0
ZŽ (zelenožlutý)	9,6	0,2	0,2	0,0
Č (červený)	1,0	2,0	0,0	7,0

Porovnávací barevné roztoky pro metody I a II
Zředěním standardních barevných roztoků se připraví porovnávací barevné roztoky (tab. 2.2.2-2 až 2.2.2-6).
Tab. 2.2.2-2 Porovnávací barevné roztoky H

Porovnávací barevný roztok	Množství roztoku v ml
	standardní roztok H	kyselina chlorovodíková 10 g/l
H1	75,0	25,0
H2	50,0	50,0
H3	37,5	62,5
H4	25,0	75,0
H5	12,5	87,5
H6	5,0	95,0
H7	2,5	97,5
H8	1,5	98,5
H9	1,0	99,0

Tab. 2.2.2-3 Porovnávací barevné roztoky HŽ

Porovnávací barevný roztok	Množství roztoku v ml
	standardní roztok HŽ	kyselina chlorovodíková 10 g/l
HŽ1	100,0	0,0
HŽ2	75,0	25,0
HŽ3	50,0	50,0
HŽ4	25,0	75,0
HŽ5	12,5	87,5
HŽ6	5,0	95,0
HŽ7	2,5	97,5

Tab. 2.2.2-4 Porovnávací barevné roztoky Ž

Porovnávací barevný roztok	Množství roztoku v ml
	standardní roztok Ž	kyselina chlorovodíková 10 g/l
Ž1	100,0	0,0
Ž2	75,0	25,0
Ž3	50,0	50,0
Ž4	25,0	75,0
Ž5	12,5	87,5
Ž6	5,0	95,0
Ž7	2,5	97,5

Tab. 2.2.2-5 Porovnávací barevné roztoky ZŽ

Porovnávací barevný roztok	Množství roztoku v ml
	standardní roztok ZŽ	kyselina chlorovodíková 10 g/l
ZŽ1	25,0	75,0
ZŽ2	15,0	85,0
ZŽ3	8,5	91,5
ZŽ4	5,0	95,0
ZŽ5	3,0	97,0
ZŽ6	1,5	98,5
ZŽ7	0,75	99,25

Tab. 2.2.2-6 Porovnávací barevné roztoky Č

Porovnávací barevný roztok	Množství roztoku v ml
	standardní roztok Č	kyselina chlorovodíková 10 g/l
Č1	100,0	0,0
Č2	75,0	25,0
Č3	50,0	50,0
Č4	37,5	62,5
Č5	25,0	75,0
Č6	12,5	87,5
Č7	5,0	95,0

Uchovávání
Pro metodu I mohou být porovnávací barevné roztoky uchovávány v těsně uzavřených zkumavkách z bezbarvého průhledného neutrálního skla s vnějším průměrem 12 mm chráněných před světlem.
Pro metodu II se připravují porovnávací barevné roztoky těsně před použitím se standardních barevných roztoků.

2.2.3 Potenciometrické stanovení pH
Hodnota pH udává pomocí konvenčně stanovené logaritmické stupnice aktivitu hydroxoniových iontů ve vodném roztoku. Pro praktické účely se používá konvenční stupnice pH. Hodnota pH zkoušeného roztoku je vztažena na hodnotu pH referenčního roztoku (pH_s) podle vzorce:
$\mathrm{pH}={\mathrm{pH}}_s-\frac{E-E_s}{k},$
v němž značí:
E - potenciál článku se zkoušeným roztokem vyjádřený ve voltech,
E_s - potenciál článku s roztokem o známém pH_s rovněž ve voltech,
k - konstanta závislá na teplotě.
Tab. 2.2.3-1 Hodnoty k při různých teplotách

Teplota °C	k
15	0,0572
20	0,0582
25	0,0592
30	0,0601
35	0,0611

Při potenciometrickém stanovení pH se měří rozdíl potenciálu mezi dvěma vhodnými elektrodami ponořenými do zkoušeného roztoku. Jedna z elektrod (indikační) je citlivá na vodíkové (hydroxoionové) ionty (obvykle elektroda skleněná) a druhá je srovnávací elektroda (např. nasycená kalomelová elektroda).
Přístroj. Měřicím přístrojem je voltmetr s vnitřním odporem nejméně 100násobně větším než odpor použitých elektrod. Je kalibrován v jednotkách pH a jeho rozlišovací schopnost musí být nejméně 0,05 jednotek pH (nebo nejméně 0,003 V).
Postup. Není-li v článku uvedeno jinak, provádějí se všechna měření při stejné teplotě (20 °C až 25 °C). Tab. 2.2.3-2 vyjadřuje změny pH v závislosti na teplotě u řady referenčních tlumivých roztoků používaných pro kalibraci přístroje. Pro případnou korekci na teplotu je třeba se řídit instrukcemi výrobce. Přístroj se kalibruje tlumivým roztokem hydrogenftalanu draselného (primární standard) a jedním z dalších tlumivých roztoků rozdílného pH (přednostně jedním z roztoků uvedených v tab. 2.2.3-2). Naměřená hodnota pH třetího tlumivého roztoku, jehož pH leží mezi oběma uvedenými hodnotami pH tlumivých roztoků, se nesmí lišit o více než 0,05 jednotek pH od skutečné hodnoty tohoto roztoku. Ponoření elektrod do měřeného roztoku a odečítání je třeba provádět za stejných podmínek jako u roztoků tlumivých.
Při častém používání přístroje se kontrola jeho kalibrace provádí pravidelně. V opačném případě je třeba provádět tyto kontroly před každým měřením.
Všechny zkoušené a referenční tlumivé roztoky se připravují z vody prosté oxidu uhličitého R.

2.2.4 Vztah mezi reakcí roztoku, přibližnými hodnotami pH a zabarvením některých indikátorů
K 10 ml zkoušeného roztoku se přidá 0,1 ml indikátoru, pokud není předepsáno v tab. 2.2.4-1 jinak.
Tab. 2.2.4-1

Reakce	pH	Indikátor	Zabarvení
zásaditá	> 8	lakmusový papír thymolová modř	modré šedé nebo fialově modré
slabě zásaditá	8,0 - 10,0	fenolftalein* thymolová modř	bezbarvé až růžové šedé
silně zásaditá	> 10	fenolftaleinový papír thymolová modř	červené fialově modré
neutrální	6,0 - 8,0	methylová červeň fenolová červeň*	žluté žluté nebo růžové
neutrální na tropeolin OO	> 3,0	tropeolin OO	žluté
neutrální na dimethylovou žluť	> 4,0	dimethylová žluť*	žluté; červené po přidání 0,1 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l
neutrální na methylovou červeň	4,5 - 6,0	methylová červeň	oranžově červené
neutrální na fenolftalein	< 8,0	fenolftalein*	bezbarvé; růžové nebo červené po přidání 0,05 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l
kyselá	< 6,0	methylová červeň bromthymolová modř**	oranžové nebo červené žluté
slabě kyselá	4,0 - 6,0	methylová červeň bromkrezolová zeleň	oranžové zelené nebo modré
silně kyselá	< 4	papír s červení Kongo dimethylová žluť*	zelené nebo modré oranžové nebo červené

* Použije se 0,05 ml.
** Použije se roztok bromthymolové modři R1.

2.2.5 Relativní hustota
Relativní hustota $d_{20}^{20}$ látky je poměr hmotnosti určitého objemu látky k hmotnosti stejného objemu vody při 20 °C.
Relativní hustota $d_{20}^{20}$ se stanoví s přesností na tolik desetinných míst, kolik je uvedeno v článku, pomocí pyknometru, hydrostatické váhy nebo hustoměru. Tlak vzduchu se při stanovení nebere v úvahu, což může do měření vnést chybu 1 jednotky na třetím desetinném místě.
Obvykle se používají ještě následující dvě definice.
Relativní hustota $d_4^{20}$ látky je poměr hmotnosti určitého objemu látky při 20 °C k hmotnosti stejného objemu vody při 4 °C.
Hustota ϱ₂₀ látky je poměr její hmotnosti k jejímu objemu při 20 °C. Udává se v kilogramech na krychlový metr (1 kg.m^-3 = 10^-3 g.cm^-3).
Číselné vztahy mezi relativní hustotou a hustotou udávanou v kilogramech na krychlový metr jsou:
${\varrho }_{20}={\text{998,202 d}}_{20}^{20}$ nebo $d_{20}^{20}=\text{1,00180}.{10}^{-3}{\varrho }_{20}$
${\varrho }_{20}={\text{999,972 d}}_4^{20}$ nebo $d_4^{20}=\text{1,00003}.{10}^{-3}{\varrho }_{20}$
$d_4^{20}={\text{0,998230 d}}_{20}^{20}$.

2.2.6 Index lomu
Index lomu $n_{\lambda }^t$ prostředí vztažený na vzduch se udává jako poměr sinu úhlu dopadu paprsku světla ve vzduchu k sinu úhlu lomu paprsku světla v daném prostředí.
Pokud není uvedeno jinak, měří se index lomu při (20 ± 0,5) °C při vlnové délce D-linie sodíkového světla (λ = 589,3 nm); užívaný symbol je potom $n_D^{20}$.
Přístroje na měření indexu lomu - refraktometry - obvykle stanovují mezní úhel. Základní částí těchto přístrojů je hranol o známém indexu lomu, který je ve styku se zkoušenou kapalinou.
Ke kalibraci přístroje se použijí referenční kapaliny uvedené v tab. 2.2.6-1. Hodnota indexu lomu každé referenční kapaliny je uvedena na štítku jejího balení.
Tab. 2.2.6-1

Referenční kapalina	Δn/Δt (teplotní koeficient)
trimethylpentan CRL	-0,000 49
chlorid uhličitý CRL	-0,000 57
toluen CRL	-0,000 56
methylnaftalen CRL	-0,000 48

Při použití bílého světla je refraktometr vybaven příslušným kompenzačním zařízením. Přístroj umožňuje přesný odečet nejméně na tři desetinná místa a je vybaven zařízením umožňujícím práci při předepsané teplotě. Stupnice teploměru je dělena po 0,5 °C nebo přesněji.

2.2.7 Optická otáčivost
Optická otáčivost je vlastnost některých látek otáčet rovinu polarizovaného světla.
Specifická optická otáčivost ${{\alpha }_m}_{\lambda }^t$ je otáčivost vyjádřená v radiánech (rad), měřená při teplotě t, při vlnové délce λ a tloušťce vrstvy 1 metr, kterou vykazuje kapalina nebo roztok obsahující 1 kilogram opticky aktivní látky v krychlovém metru roztoku. Pro praktické využití se specifická optická otáčivost ${{\alpha }_m}_{\lambda }^t$ obvykle vyjadřuje v miliradiánech a čtverečných metrech na kilogram (mrad.m.²kg^-1).
Lékopis přijal následující konvenční definice:
Úhel optické otáčivosti kapaliny je úhel otočení a roviny polarizovaného světla vyjádřený ve stupních (°) při vlnové délce D-linie sodíkového světla (λ = 589,3 nm) měřený při 20 °C a tloušťce vrstvy 1 decimetr; pro roztok je postup přípravy popsaný v článku.
Specifická optická otáčivost ${\alpha }_D^{20}$ kapaliny je úhel otočení a roviny polarizovaného světla vyjádřený ve stupních (°) při vlnové délce D-linie sodíkového světla (λ = 589,3 nm), měřený při 20 °C ve zkoušené kapalině, vypočítaný pro vrstvu tloušťky 1 decimetr a dělený hustotou vyjádřenou v gramech na krychlový centimetr.
Specifická optická otáčivost ${\alpha }_D^{20}$ látky v roztoku je úhel otočení a roviny polarizovaného světla vyjádřený ve stupních (°) při vlnové délce D-linie sodíkového světla (λ = 589,3 nm), měřený při 20 °C v roztoku zkoušené látky a vypočtený pro vrstvu tloušťky 1 decimetr, obsahující 1 gram látky na mililitr. Specifická optická otáčivost pevné látky je vždy vyjádřena pro dané rozpouštědlo a pro danou koncentraci rozpuštěné látky.
V konvenčním systému přijatém lékopisem se specifická optická otáčivost vyjadřuje ve stupních krát mililitry na decimetr a gram [(°).ml.dm^-1.g^-1].
Přepočítávací faktor z mezinárodního systému na systém lékopisný je následující:
${{\alpha }_m}_{\lambda }^t={\alpha }_{\lambda }^t.\text{0,1745.}$
V určitých případech specifikovaných v článcích smí být úhel otočení měřen při jiné teplotě než 20 °C a při jiných vlnových délkách.
Polarimetr umožňuje odečítání s přesností nejméně na 0,01 °. Stupnice je obyčejně kontrolovaná pomocí ověřených křemenných destiček. Linearita stupnice se může kontrolovat pomocí roztoků sacharosy.
Postup. Stanoví se nulová poloha polarimetru a úhel otočení roviny polarizovaného světla při vlnové délce D-linie sodíkového světla (λ = 589,3 nm) při (20 ± 0,5) °C. Měření se může uskutečnit při jiných teplotách jen tehdy, jestliže článek uvádí korekci naměřené optické otáčivosti na tuto teplotu.
Stanoví se nulová poloha přístroje s uzavřenou trubicí; pro kapaliny se nulová poloha stanoví s prázdnou trubicí a pro látky v roztoku s trubicí naplněnou předepsaným rozpouštědlem. Vypočítá se průměr alespoň z pěti měření.
Specifická optická otáčivost se vypočítá pomocí následujících vzorců, pravotočivost a levotočivost se označí (+), resp. (-).
Pro kapaliny:
${\alpha }_D^{20}=\frac{\alpha }{l.{\rho }_{20}}.$
Pro pevné látky v roztoku:
${\alpha }_D^{20}=\frac{1000\alpha }{l.c}.$
Obsah opticky aktivní látky c vyjádřený v g/l nebo c‘ vyjádřený v procentech se vypočítá podle následujících vzorců:
$c=\frac{1000\alpha }{l.{\alpha }_D^{20}},$$c‘=\frac{100\alpha }{l.{\alpha }_D^{20}.{\rho }_{20}}.$
Ve všech uvedených vzorcích značí:
α - úhel otočení ve stupních při (20 ± 0,5) °C,
l - délku polarimetrické trubice v decimetrech,
ϱ₂₀ - hustotu při 20 °C v gramech na krychlový centimetr; pro účely lékopisu je hustota nahrazena relativní hustotou (2.2.5),
c - koncentraci látky v g/l,
c‘- koncentraci látky v %.

2.2.8 Viskozita
Dynamická viskozita nebo koeficient viskozity η je tangenciální síla připadající na jednotku povrchu a vyjádřená jako smykové napětí τ v pascalech, potřebná k tomu, aby se dvě rovnoběžné vrstvy kapaliny o ploše 1 m² navzájem posunuly o vzdálenost 1 m (x) rychlostí (v) 1 m.s^-1.
Rychlostní gradient dv/dx udává smykový poměr D a vyjadřuje se v s^-1 Pro dynamickou viskozitu η platí vztah η = τ/D.
Jednotkou dynamické viskozity je pascalsekunda (Pa.s). Nejpoužívanější menší jednotkou je milipascalsekunda (mPa.s).
Kinematická viskozita v(m²/s) je poměr dynamické viskozity η a hustoty ρ (kg/m³) kapaliny při téže teplotě. Pro kinematickou viskozitu platí vztah v = η/ρ. Kinematická viskozita se obvykle vyjadřuje v mm².s^-1.
Kapilární viskozimetr lze používat pro stanovení viskozity newtonských kapalin a rotační viskozimetr pro stanovení viskozity newtonských i nenewtonských kapalin.
Jiné viskozimetry lze používat za předpokladu, že jejich přesnost není menší než ta, kterou poskytují viskozimetry popsané níže.

2.2.9 Měření kapilárním viskozimetrem
Stanovení viskozity pomocí vhodného kapilárního viskozimetru se provádí při teplotě (20 ± 0,1) °C, není-li předepsáno jinak. Čas potřebný k tomu, aby hladina kapaliny klesla od jedné značky ke druhé, se měří stopkami s přesností na 0,2 sekundy. Měření je platné, pokud se dvě po sobě jdoucí měření neliší o více než 1 %. Pro výpočet se bere průměr nejméně ze tří měření doby průtoku zkoušené kapaliny.
Dynamická viskozita η (2.2.8) v milipascalsekundách (mPa.s) se vypočítá podle vzorce:
$\eta =\mathrm{k\rho t}$,
v němž značí:
k - konstantu viskozimetru (mm².s^-2),
ρ - hustotu zkoušené tekutiny (mg.mm^-3) získanou vynásobením relativní hustoty $d_{20}^{20}$ číslem 0,9982,
t - dobu průtoku zkoušené kapaliny v sekundách.
Konstanta k se stanoví za použití vhodné viskozimetrické kalibrační kapaliny předepsané v lékopise.
K výpočtu kinematické viskozity (mm².s^-1) se použije vzorec:
$v=\mathrm{kt}.$
Stanovení může být provedeno přístrojem (viz obr.2.2.9-1, str. 105), který má parametry¹) uvedené v tab. 2.2.9-1.
Tab. 2.2.9-1

Číslo velikosti	Nominální konstanta viskozimetru	Rozmezí kinematické viskozity	Vnitřní průměr trubice R	Objem části C	Vnitřní průměr trubice N
	mm2.s-2	mm2.s-1	mm (±2 %)	ml (±5 %)	mm
1	0,01	3,5 až 10	0,64	5,6	2,8 až 3,2
1A	0,03	6 až 30	0,84	5,6	2,8 až 3,2
2	0,1	20 až 100	1,15	5,6	2,8 až 3,2
2A	0,3	60 až 300	1,51	5,6	2,8 až 3,2
3	1,0	200 až 1000	2,06	5,6	3,7 až 4,3
3A	3,0	600 až 3000	2,74	5,6	4,6 až 5,4
4	10	2000 až 10 000	3,70	5,6	4,6 až 5,4
4A	30	6000 až 30 000	4,07	5,6	5,6 až 6,4
5	100	20 000 až 100 000	6,76	5,6	6,8 až 7,5

Minimální doba průtoku pro velikost číslo 1 musí být 350 s; pro všechny další velikosti 200 s.
Postup. Trubicí (L) viskozimetru se naplní část A dostatečným množstvím zkoušené kapaliny vytemperované na teplotu 20 °C, pokud není uvedeno jinak. Hladina kapaliny v části (B) nesmí zasahovat do ústí ventilační trubice (M). Viskozimetr se ponoří do vodní lázně o teplotě (20 ±0,1) °C, není-li uvedeno jinak, ve svislé poloze a nechá se temperovat nejméně 30 min, aby se teploty vyrovnaly. Trubice (M) se uzavře a hladina kapaliny v trubici (N) se vytlačí asi 8 mm nad značku (E). V této poloze se kapalina zadrží uzavřením horního ústí trubice (N) a otevřením trubice (M). Při vlastním měření se otevře trubice (N) a s přesností 0,2 s se změří stopkami časový interval mezi poklesem hladiny kapaliny od značky (E) po značku (F).

2.2.10 Měření rotačním viskozimetrem
Běžně užívané typy rotačních viskozimetrů jsou založeny na měření smykových sil v kapalném prostředí, umístěném mezi dva souosé válce, z nichž jeden je poháněn motorem a druhý je přinucen k otáčení rotací prvého. Za těchto podmínek se mírou viskozity nebo zdánlivé viskozity stává úhlová odchylka (M) válce přinuceného k otáčení, což odpovídá momentu síly vyjádřenému v newtonmetrech.
Pro laminární proudění je dynamická viskozita η vyjádřená v pascalsekundách dána vzorcem:
$\eta =\frac{1}{\omega }\frac{M}{4\pi .h}·\frac{1}{R_A^2}-\frac{1}{R_B^2},$
v němž značí:
h - výšku ponoření válce přinuceného k otáčení v kapalném prostředí vyjádřenou v metrech,
R_A, R_B - poloměry válců v metrech, přičemž R_A je menší než R_B,
ω - úhlovou rychlost v radiánech za sekundu.
Konstanta k přístroje²) může být určena při různých rychlostech otáčení za použití viskozimetrické kalibrační kapaliny předepsané lékopisem. Viskozita pak odpovídá vzorci:
$\eta =k\frac{M}{\omega },$
Postup. Viskozita se měří podle pokynů pro obsluhu rotačního viskozimetru. Teplota pro měření viskozity je předepsána v článku. Pro pseudoplastické a jiné nenewtonské systémy uvádí článek typ viskozimetru, který se má použít, a úhlovou rychlost nebo smykový poměr, při kterém se měření provádí. Jestliže je nemožné získat předepsaný smykový poměr přesně, použije se smykový poměr poněkud nižší a vyšší a provede se interpolace.

Obr. 2.2.9-1 Viskozimetr
Rozměry v milimetrech

2.2.11 Destilační rozmezí
Destilační rozmezí je teplotní interval vztažený na tlak 101,3 kPa (760 Torrů), ve kterém kapalina nebo její definovaná část destiluje za následujících podmínek.
Přístroj. Přístroj (viz obr. 2.2.11-1) se skládá z destilační baňky (A), k jejímuž postrannímu ramenu je vhodně připojen chladič (B) zakončený nebo nastavený hladce zahnutým nástavcem (C). Teploměr je vložený do hrdla baňky tak, aby horní konec rtuťové nádobky byl o 5 mm níže než spojení hrdla baňky se spodní stěnou boční trubice. Stupnice teploměru je dělená po 0,2 °C a její rozsah je asi 50 °C. Po dobu stanovení musí být baňka, včetně jejího hrdla, chráněna před průvanem vhodnou ochranou.
Postup. Do baňky (A) se dá 50,0 ml zkoušené kapaliny a několik kousků pórovité hmoty. Destilát se jímá do 50ml válce děleného po 1 ml. Chlazení tekoucí vodou je nevyhnutelné u kapalin destilujících níže než při 150 °C. Baňka se zahřívá tak, aby se rychle dosáhlo varu. Zaznamená se teplota, při které spadne do válce první kapka destilátu. Zahřívání se nastaví tak, aby kapalina destilovala konstantní rychlostí 2 ml/min až 3 ml/min. Zaznamená se teplota, při které předestiloval celý objem kapaliny nebo její předepsaná část. Objem předestilované kapaliny se měří při 20 °C.
Zjištěná teplota se koriguje na předepsaný barometrický tlak podle vzorce:
$t_1=t_2+k\text{101,3}-b,$
v němž značí:
t₁ - korigovanou teplotu,
t₂ - zjištěnou teplotu při barometrickém tlaku b,
k - korekční faktor dle tab. 2.2.11-1, pokud není uvedeno jinak,
b - barometrický tlak po dobu destilace (kPa).

Obr. 2.2.11-1 Přistroj na stanovení destilačního rozmezí
Rozměry v milimetrech

2.2.12 Teplota varu
Teplota varu je teplota, při které tlak páry nad kapalinou je 101,3 kPa (760 Torrů).
Přístroj. Použije se stejný přístroj jako při stanovení destilačního rozmezí (2.2.11) mimo teploměru. Ten je vložen do hrdla baňky tak, že dolní konec rtuťové nádobky je v jedné rovině s dolním koncem hrdla destilační baňky. Baňka je umístěna na desce z izolačního materiálu s otvorem o průměru 35 mm.
Postup. Do baňky (A) se dá 20,0 ml zkoušené tekutiny a několik kousků pórovité hmoty (varné kaménky). Baňka se zahřívá tak, aby se co nejrychleji dosáhlo varu. Zaznamená se teplota, při které začne stékat kapalina v místě bočního ramene baňky do chladiče.
Zjištěná teplota se koriguje na předepsaný barometrický tlak podle vzorce:
$t_1=t_2+k\text{101,3}-b,$
v němž značí:
t₁ - korigovanou teplotu,
t₂ - teplotu zjištěnou při barometrickém tlaku b,
k - korekční faktor (viz tab. 2.2.11-1),
b - barometrický tlak zjištěný v době stanovení (kPa).

2.2.13 Stanovení vody destilací
Přístroj (viz obr. 2.2.13-1) se skládá ze skleněné baňky (A), která je připojena skleněnou trubicí (D) k cylindrické kondenzační části (B) zakončené odměrnou trubicí (E) s uzávěrem dělenou po 0,1 ml. Na zabroušené hrdlo části (B) je nasazen zpětný chladič (C). Jako zdroj tepla je vhodnější použít elektrický vařič s reostatem nebo olejovou lázeň. Horní část baňky a spojovací trubice (D) mohou být opatřeny tepelnou izolací.

Obr. 2.2.13-1 Přístroj pro stanovení vody destilací
Rozměry v milimetrech
Postup. Použije se přístroj dokonale vymytý a vysušený.
Do baňky se odměří 200 ml toluenu R a asi 2,0 ml vody R. Destiluje se dvě hodiny, potom se nechá asi 30 min chladit a odečte se množství předestilované vody s přesností na 0,05 ml.
Do baňky se kvantitativně vpraví množství zkoušené látky navážené s přesností 1 %, které obsahuje 2 ml až 3 ml vody R. Jestliže je zkoušená látka polotuhé konzistence, váží se na lodičce z kovové fólie. Přidá se několik kousků porézního materiálu a baňka se 15 min opatrně zahřívá. Když začne toluen vřít, destiluje se rychlostí asi 2 kapky/s, dokud se neoddestiluje většina vody, a potom se zvýší rychlost destilace asi na 4 kapky/s. Když byla předestilována všechna voda, opláchne se vnitřek chladiče toluenem R. Pokračuje se ještě 5 min v destilaci a pak se odstaví zdroj tepla. Odměrná trubice se nechá ochladit na pokojovou teplotu a nechají se stéci všechny kapky vody ze stěn do odměrné trubice. Když se voda a toluen úplně oddělí, odečte se množství vody a vypočte se procentuální podíl vody v substanci podle vzorce:
$\frac{100n_2-n_1}{m},$
v němž značí:
m - hmotnost zkoušené látky v gramech,
n₁ - množství vody získané z první destilace v ml,
n₂ - celkové množství vody z obou destilací v ml.

2.2.14 Teplota tání - kapilární metoda
Teplota tání stanovená kapilární metodou je teplota, při které roztaje poslední částice sloupce léčiva v kapiláře.
Pokud je v článku předepsáno, použije se stejné zařízení i postup pro stanovení dalších faktorů, jako je tvorba menisku, nebo rozmezí teploty tání, které charakterizují chování léčiva při tání.
Zařízení. Zařízení se skládá z:
- vhodné skleněné nádoby obsahující kapalinovou lázeň (např. vodu, tekutý parafín nebo silikonový olej) vybavenou vhodným zahříváním;
- vhodného míchadla zabezpečujícího stejnoměrnou teplotu lázně;
- vhodného teploměru s dělením stupnice nepřevyšujícím interval 0,5 °C a značkou ponoru. Rozsah teploměru je v rozmezí maximálně 100 °C;
- kapilár z tvrdého skla prostého alkálií o vnitřním průměru od 0,9 mm do 1,1 mm a v tloušťce stěny od 0,10 mm do 0,15 mm, zatavených na jednom konci.
Postup stanovení. Pokud není předepsáno jinak, jemně upráškované léčivo se suší ve vakuu nad silikagelem bezvodým R po dobu 24 hod. Do kapiláry se vpraví dostatečné množství látky tak, aby vznikl sloupec o výšce 4 mm až 6 mm. Lázeň se zahřeje na teplotu asi o 10 °C nižší než předpokládaná teplota tání a pak se nastaví rychlost zahřívání asi na 1 °C/min. Je-li teplota lázně asi 5 °C pod předpokládanou teplotou tání, umístí se kapilára do zařízení. Ve výše popsaném zařízení je kapilára umístěna tak, že její uzavřený konec je u středu rtuťové baňky teploměru a značka ponoru teploměru je při hladině kapaliny lázně. Zaznamená se teplota, při které poslední částice substance přejde do kapalné fáze.
Kalibrace zařízení. Zařízení může být kalibrováno pomocí teplot tání vhodných referenčních látek, jako např. látek doporučených Světovou zdravotnickou organizací.

2.2.15 Teplota tání - metoda otevřené kapiláry
Následující metodou se u určitých látek stanoví teplota zkapalnění, běžně nazývaná teplotou tání.
Používá se skleněných kapilár otevřených na obou koncích, dlouhých asi 80 mm, o vnějším průměru 1,4 mm až 1,5 mm a o vnitřním průměru 1,0 mm až 1,2 mm.
Pro stanovení se použije pět kapilár. Každá se naplní do výše asi 10 mm zkoušenou látkou připravenou předepsaným způsobem. Kapilára se ponechá vhodnou dobu při předepsané teplotě. Potom se jedna kapilára připevní na teploměr dělený po 0,2 °C, aby sloupec zkoušené látky byl těsně u rtuťové nádržky teploměru. Teploměr s kapilárou se umístí v kádince, aby nádržka se rtutí byla ve vzdálenosti 1 cm od dna kádinky. Kádinka se naplní vodou do výše 5 cm. Voda se zahřívá tak, aby její teplota stoupala rychlostí 1 °C/min.
Jako teplota tání se zaznamenává teplota, při níž sloupec látky v kapiláře začne stoupat.
Tento postup se opakuje i s dalšími čtyřmi kapilárami. Výslednou teplotu tání udává průměr všech pěti stanovení.

2.2.16 Teplota tání - stanovení v kovovém bloku
Okamžitá teplota tání se vypočítá podle vzorce:
$t_t=\frac{t_1+t_2}{2},$
v němž značí:
t₁ - první teplotu,
t₂ - druhou teplotu odečtenou za dále popsaných podmínek.
Zařízení. Zařízení se skládá z kovového bloku odolného vůči zkoušeným látkám s dobrou tepelnou vodivostí (např. mosaz) a s velmi hladkou leštěnou vrchní plochou. Blok se rovnoměrně zahřívá jemně regulovatelným plynovým kahanem nebo pomocí elektrického ohřevu s jemnou regulací. V bloku je válcovitá dutina dostatečně široká pro vložení teploměru, jehož rtuťový sloupec by měl být ve stejné poloze při kalibraci přístroje i stanovení teploty tání zkoušené látky. Válcovitá dutina je rovnoběžná s horním hladkým povrchem bloku ve vzdálenosti asi 3 mm. Přístroj se kalibruje za použití vhodných látek o známé teplotě tání.
Postup stanovení. Blok se zahřeje vhodnou rychlostí na teplotu asi 10 °C pod očekávanou teplotou tání, potom se nastaví rychlost zahřívání asi na 1 °C/min. V pravidelných intervalech se vkládá několik částeček upráškované zkoušené látky, pokud je třeba i vysušené za podmínek uvedených u kapilární metody, na blok v sousedství rtuťové nádržky teploměru. Po každém stanovení se povrch bloku očistí. Zaznamená se teplota t₁, při které látka taje ihned při prvním kontaktu s povrchem bloku. Další zahřívání bloku se zastaví. Během ochlazování se vkládá opět v pravidelných intervalech několik částeček látky na blok. Povrch bloku se opět očistí po každém stanovení. Zaznamená se teplota t₂, při níž zkoušená látka v kontaktu s blokem přestává okamžitě tát.
Kalibrace přístroje. Přístroj se kalibruje s použitím vhodných referenčních látek pro teplotu tání, např. doporučených látek WHO.

2.2.17 Teplota skápnutí
Teplota skápnutí je teplota, při níž skápne první kapka zkoumaného léčiva z nádobky za definovaných podmínek.
Zařízení. Zařízení (viz obr. 2.2.17-1) se skládá ze dvou navzájem sešroubovaných kovových pouzder (A) a (B). V pouzdru (A) je upevněn rtuťový teploměr. Kovová nádobka tvaru pohárku (F) je prostřednictvím dvou upínacích pásků (E) volně připevněna ke spodní části pouzdra (B). Pevné podpěry (D) délky 2 mm zaručují přesnou polohu nádobky a jsou současně využity pro zajištění správné polohy teploměru. Otvor (C) ve stěně pouzdra (B) slouží k vyrovnávání tlaku. Nádobka má hladký povrch a hrany výtokového ústí svírají se stěnou nádobky pravý úhel. Spodní část rtuťového teploměru má tvar a velikost odpovídající obrázku. Dělení teploměru je od 0 °C do 110 °C, kde vzdálenost 1 mm odpovídá 1 °C. Rtuťová nádržka teploměru má průměr (3,5 ± 0,2) mm a výšku (6,0 ± 3) mm. Zařízení je umístěno v ose zkumavky dlouhé asi 200 mm a vnějšího průměru asi 40 mm a upevněno ve zkumavce pomocí zátky, kterou prochází teploměr a jež je opatřena boční drážkou. Otvor nádobky má být ve vzdálenosti asi 15 mm ode dna zkumavky. Celé zařízení je ponořeno do kádinky o objemu asi 1 litru naplněné vodou. Dno zkumavky by mělo být asi 25 mm ode dna kádinky. Hladina vody by měla dosahovat k horní části pouzdra (A). K zabezpečení stejné teploty vody se použije míchadlo.

Obr. 2.2.17-1 Zařízení pro stanovení teploty skápnutí
Rozměry v milimetrech
Postup stanovení. Pokud není uvedeno jinak, naplní se nádobka až po okraj zkoumanou látkou, aniž by se látka zahřívala. Pomocí kopistky se odstraní přebytek léčiva na okrajích nádobky. Po sešroubování pouzder (A) a (B) se nádobka zatlačí do krytu v pouzdře (B) až k pevné podpěře (D). Přebytečné léčivo vytlačené teploměrem se opět odstraní kopistkou. Zařízení se umístí do vodní lázně, jak bylo popsáno výše. Vodní lázeň se zahřívá, a když je teplota asi 10 °C pod očekávanou teplotou skápnutí, nastaví se rychlost zahřívání asi na 1 °C/min. Zaznamená se teplota, při níž skápne první kapka. Měření se provede třikrát vždy s novým vzorkem léčiva. Rozdíl mezi jednotlivými hodnotami stanovení nesmí být výšší než 3 °C. Teplota skápnutí léčiva je aritmetický průměr ze tří stanovení.

2.2.18 Teplota tuhnutí
Teplota tuhnutí je nejvyšší teplota naměřená během tuhnutí podchlazené kapaliny.
Přístroj. Přístroj, viz obr. 2.2.18-1, se skládá ze zkumavky asi o průměru 25 mm a délce 150 mm umístěné uvnitř jiné zkumavky asi o průměru 40 mm a délce 160 mm. Vnitřní zkumavka je uzavřena zátkou, kterou prochází teploměr asi 175 mm dlouhý se stupnicí dělenou po 0,2 °C. Teploměr je upevněn tak, aby jeho spodní část (baňka se rtutí) byla asi 15 mm ode dna zkumavky. Zátka má další otvor, kterým prochází držadlo míchadla, vyrobeného ze skleněné tyčinky nebo jiného vhodného materiálu, vytvarované na jednom konci v pravém úhlu k tyčince do smyčky o vnějším průměru asi 18 mm. Vnitřní zkumavka se svým obalem je umístěna uprostřed kádinky o obsahu 1 l naplněné 20 mm od horního okraje vhodnou chladicí kapalinou. Do chladicí lázně je umístěn teploměr.
Postup. Do vnitřní zkumavky se vpraví dostatečné množství kapaliny nebo předem roztavené zkoušené látky tak, aby byla ponořena celá baňka teploměru, a rychlým ochlazením se stanoví přibližná teplota tuhnutí. Vnitřní zkumavka se přemístí do lázně asi o 5 °C teplejší než přibližná teplota tuhnutí a ponechá se v ní, dokud se všechna látka až na několik posledních krystalků neroztaví. Kádinka se naplní vodou nebo nasyceným roztokem chloridu sodného o teplotě asi o 5 °C nižší než předpokládaná teplota tuhnutí. Vnitřní zkumavka se zasune do vnější, ověří se přítomnost ponechaných zárodečných krystalů a důkladně se míchá, až nastane tuhnutí. Zaznamená se nejvyšší teplota pozorovaná během tuhnutí.

Obr. 2.2.18-1 Přístroj na stanovení teploty tuhnutí
Rozměry v milimetrech

2.2.19 Ampérometrické titrace
Při ampérometrických titracích se bod ekvivalence stanoví měřením změny proudu mezi dvěma elektrodami (indikační elektrodou a srovnávací elektrodou nebo dvěma indikačními elektrodami) ponořenými ve zkoušeném roztoku a udržovanými při konstantním rozdílu napětí v závislosti na množství přidaného odměrného roztoku.
Potenciál indikační elektrody má být dostatečný k dosažení limitního proudu elektrochemicky aktivní látky.
Přístroj. Přístoj má regulovatelný zdroj napětí a citlivý mikroampérmetr. Měřicí systém obvykle sestává z indikační elektrody (např. platinové, rtuťové kapkové, rotující diskové nebo uhlíkové elektrody) a srovnávací elektrody (např. kalomelové nebo argentchloridové elektrody).
Může být také použito zařízení se třemi elektrodami, které obsahuje kromě indikační a srovnávací elektrody též polarizovatelnou pomocnou elektrodu.
Postup. Potenciál indikační elektrody se nastaví na předepsanou hodnotu a vynese se do grafu závislost počátečního proudu a proudu získaného během titrace na množství přidávaného odměrného roztoku. Odměrný roztok se přidá v minimálně třech následných množstvích, jejichž celkový objem se rovná asi 80 % teoretického objemu odpovídajícího předpokládanému bodu ekvivalence. Tyto tři hodnoty mají ležet na přímce. Odměrný roztok se přidává dále za předpokládaný bod ekvivalence v minimálně třech dalších množstvích. Získané hodnoty rovněž mají ležet na přímce. Bod ekvivalence se nachází na průsečíku obou přímek.
V případě amperometrické titrace se dvěma indikačními elektrodami se zaregistruje celá titrační křivka a použije se ke zjištění bodu ekvivalence.

2.2.20 Potenciometrické titrace
Při potenciometrických titracích se bod ekvivalence stanoví měřením změn rozdílu potenciálů mezi dvěma elektrodami (indikační elektrodou a srovnávací elektrodou nebo dvěma indikačními elektrodami) ponořenými do titrovaného roztoku v závislosti na množství přidávaného odměrného roztoku.
Měření potenciálu se obvykle provádí za nulového nebo prakticky nulového proudu.
Přístroj. Přístroj (jednoduchý potenciometr nebo elektronické zařízení) obsahuje voltmetr, který umožňuje přesnost odečtu nejméně na 1 mV.
Použitá indikační elektroda závisí na stanovované látce; může to být skleněná elektroda nebo kovová elektroda (platinová, zlatá, stříbrná, rtuťová atd.). Srovnávací elektrodou je obvykle kalomelová nebo argentchloridová elektroda.
Při acidobazických titracích, pokud není uvedeno jinak, se použijí kombinace skleněná - kalomelová elektroda nebo skleněná - argentchloridová elektroda.
Postup. Do grafu se vynesou změny rozdílu potenciálů v závislosti na přidaném množství odměrného roztoku, přičemž se pokračuje v přidávání odměrného roztoku až za očekávaný bod ekvivalence. Bod ekvivalence odpovídá náhlé změně rozdílu potenciálů.

2.2.21 Fluorimetrie
Fluorimetrie je metoda, které se používá k měření intenzity fluorescenčního záření emitovaného zkoušenou látkou ve vztahu k intenzitě fluorescenčního záření standardu.
Pracovní postup. Zkoušená látka se rozpustí v rozpouštědle nebo ve směsi rozpouštědel udaných v článku, roztok se přenese do kyvety nebo fluorimetrické trubice (průtokové kyvety) a osvětlí se excitačním, co nejvíce monochromatickým světlem o vlnové délce předepsané v článku.
Měří se intenzita emitovaného záření v úhlu 90° vzhledem k excitačnímu paprsku po průchodu filtrem, který propouští zejména záření při vlnové délce fluorescence. Může být použit také jiný typ zařízení, pokud je zajištěno, že získané výsledky jsou identické.
Pro stanovení se nejprve umístí do přístroje rozpouštědlo nebo směs rozpouštědel použitých k rozpouštění stanovované látky a přístroj se nastaví na nulu. Vloží se roztok standardu a nastaví citlivost přístroje tak, aby odečtená hodnota byla větší než 50. Při změně šířky štěrbiny je třeba znovu nastavit nulu a měřit intenzitu fluorescence standardu. Nakonec se vloží roztok neznámé koncentrace a odečte se na přístroji intenzita fluorescence. Koncentrace c_x zkoušené látky v měřeném roztoku se vypočítá ze vztahu:
$c_x=\frac{I_x{c}_s}{I_s},$
v němž značí:
c_s - koncentraci roztoku standardu,
I_x - intenzitu fluorescence emitované roztokem zkoušené látky,
I_s - intenzitu fluorescence emitované roztokem standardu.
Pokud intenzita fluorescence není přímo úměrná koncentraci, je vhodnější použít pro měření kalibrační křivku. V některých případech může být měření provedeno vzhledem k pevnému standardu (např. fluorescenčnímu sklu nebo roztoku jiné fluorescenční látky). V takových případech se koncentrace zkoušené látky stanoví s použitím předem sestrojené kalibrační křivky za stejných podmínek.

2.2.22 Atomová emisní spektrometrie
Atomová emisní spektrometrie je metoda na stanovení koncentrace prvku v látce měřením intenzity jedné z emisních čar atomové páry prvku generované z látky. Stanovení se provádí při vlnové délce odpovídající této emisní čáře.
Přístroj. Skládá se hlavně z atomizátoru stanovovaného prvku (plamen, plazma, oblouk atd.), monochromátoru a detektoru. Pokud je atomizátorem plamen, je vhodné použít vodu R jako rozpouštědlo na přípravu zkoušených a porovnávacích roztoků. Také lze použít organická rozpouštědla, zjistí-li se, že rozpouštědlo nebude ovlivňovat stabilitu plamene.
Pracovní postup. Atomový emisní spektrometr se obsluhuje ve shodě s výrobními předpisy při předepsané vlnové délce. Roztok slepé zkoušky se aplikuje do atomizátoru a signál přístroje se nastaví na nulu. Vnese se nejkoncentrovanější porovnávací roztok a citlivost se nastaví tak, aby se získal vhodný signál.
Stanovení se provádějí porovnáváním s porovnávacími roztoky o známých koncentracích stanovovaného prvku buď metodou přímé kalibrace (Metoda I), nebo metodou standardních přídavků (Metoda II).
Metoda I - Přímá kalibrace
Připraví se roztok analyzované látky (zkoušený roztok), jak je předepsáno, a nejméně tři porovnávací roztoky stanovovaného prvku, jejichž koncentrace zahrnují očekávanou hodnotu ve zkoušeném roztoku. Zkoumadla používaná k přípravě zkoušeného roztoku se přidávají k porovnávacím roztokům ve stejné koncentraci.
Zkoušený roztok a každý porovnávací roztok se vnese do přístroje nejméně třikrát a zaznamená se ustálený signál. Po každém stanovení se přístroj propláchne roztokem slepé zkoušky a zjistí se, zda se signál vrátí k počáteční hodnotě slepé zkoušky.
Sestrojí se kalibrační křivka z průměru signálů získaných z porovnávacích roztoků a z takto získané křivky se zjistí koncentrace prvku ve zkoušeném roztoku.
Metoda II - Standardní přídavky
Do nejméně třech stejných odměrných baněk se přidají stejné objemy roztoků analyzované látky (zkoušený roztok) připravené, jak je předepsáno. Do každé baňky kromě jedné se přidá postupně zvětšující se objem porovnávacího roztoku obsahujícího známou koncentraci stanovovaného prvku, aby se zhotovila série roztoků obsahujících stále stoupající koncentrace známého prvku, které dají odezvy v lineární části křivky. Obsah každé baňky se zředí rozpouštědlem a doplní po značku.
Každý z roztoků se vnese do přístroje nejméně třikrát a zaznamená se ustálený signál. Po každém stanovení se přístroj propláchne rozpouštědlem a zjistí se, zda se signál vrátí k počáteční hodnotě slepé zkoušky.
Vypočítá se lineární rovnice grafu použitím metody nejmenších čtverců a z toho se odvodí koncentrace stanovovaného prvku ve zkoušeném roztoku.
Alternativně se vynese do grafu průměr signálů proti přidanému množství stanovovaného prvku. Extrapoluje se čára spojující body na grafu do přetnutí osy koncentrace. Vzdálenost mezi tímto bodem a průsečíkem os představuje koncentraci stanovovaného prvku ve zkoušeném roztoku.
Pokud je požadována technika pevného vzorku,podrobné detaily postupu jsou uvedeny v článku.

2.2.23 Atomová absorpční spektrometrie
Atomová absorpční spektrometrie je metoda na stanovení koncentrace prvku v látce měřením absorpce záření atomovými parami prvku generovanými z látky. Stanovení se provádí při vlnové délce jedné z absorpčních čar stanovovaného prvku.
Přístroj. Skládá se ze zdroje záření, atomizátoru stanovovaného prvku (plamen, pícka atd.), monochromátoru a detektoru.
Způsob zavádění analyzované látky závisí na typu používaného atomizátoru. Pokud je to plamen, látka se zmlžuje a voda R je vhodné rozpouštědlo na přípravu zkoušených a porovnávacích roztoků. Organická rozpouštědla se též mohou použít, pokud je splněna podmínka, že rozpouštědlo neovlivňuje stabilitu plamene. Jestliže se použije pícka, látky mohou být navážené a rozpuštěné ve vodě R nebo v organickém rozpouštědle, ale s touto technikou je možné analyzovat též přímo pevné vzorky.
Atomová pára může být též generovaná mimo spektrometr, např. metoda studených par pro rtuť nebo určité hydridy. U rtuti jsou atomy generované chemickou redukcí a vzniklé atomové páry jsou transportovány proudem inertního plynu do absorpční kyvety instalované v optické dráze přístroje. Hydridy jsou buď míšeny s plynem napájejícím hořák, nebo jsou transportovány inertním plynem do vyhřívané kyvety, v níž jsou disociovány na atomy.
Pracovní postup. Atomový absorpční spektrometr se obsluhuje ve shodě s předpisy výrobce při nastavené vlnové délce. Roztok slepé zkoušky se aplikuje do atomizátoru a signál přístroje se nastaví tak, že ukazuje maximum propustnosti. Vnese se nejkoncentrovanější porovnávací roztok a citlivost se nastaví tak, aby se získal vhodný signál absorbance. Stanovení se provádí porovnáním s porovnávacími roztoky známých koncentrací stanovovaného prvku buď metodou přímé kalibrace (Metoda I), nebo metodou standardních přídavků (Metoda II).
Metoda I - Přímá kalibrace
Připraví se roztok analyzované látky (zkoušený roztok), jak je předepsáno, a nejméně tři porovnávací roztoky stanovovaného prvku, jejichž koncentrace zahrnují očekávanou hodnotu ve zkoušeném roztoku. Zkoumadla používaná k přípravě zkoušeného roztoku se přidávají k porovnávacím roztokům a použijí se i při slepé zkoušce ve stejné koncentraci.
Zkoušený roztok a každý porovnávací roztok se vnese do přístroje nejméně třikrát a zaznamená se ustálený signál. Přístroj se vždy propláchne roztokem slepé zkoušky a zjistí se, zda se signál vrátí k počáteční hodnotě slepé zkoušky.
Použije-li se pícky, mezi měřením signálů se vypaluje.
Sestrojí se kalibrační křivka z průměru signálů získaných porovnávacích roztoků a ze získané křivky se vypočte koncentrace stanovovaného prvku ve zkoušeném roztoku.
Pokud je požadována technika pevného vzorku, podrobné detaily postupu jsou uvedeny v článku.
Metoda II - Standardní přídavky
Do nejméně tří stejných odměrných baněk se přidají stejné objemy roztoku analyzované látky (zkoušený roztok) připravené, jak je předepsáno. Do každé baňky kromě jedné se přidá postupně zvětšující se objem porovnávacího roztoku obsahujícího známou koncentraci stanovovaného prvku, aby se připravila série roztoků obsahujících stoupající koncentraci známého prvku, které dají odezvu v lineární části křivky. Obsah každé baňky se zředí rozpouštědlem a doplní se jím po značku. Každý z roztoků se vnese do přístroje nejméně třikrát a zaznamená se ustálený signál. Pokaždé se přístroj propláchne rozpouštědlem a zjistí se, zda se signál vrátí k počáteční hodnotě slepé zkoušky.
Použije-li se pícka, mezi měřením signálů se vypaluje.
Vypočítá se lineární rovnice grafu použitím metody nejmenších čtverců a z toho se odvodí koncentrace stanovovaného prvku ve zkoušeném roztoku.
Alternativně se vynese do grafu průměr signálů proti přidanému množství stanovovaného prvku. Extrapoluje se čára spojující body na grafů do přetnutí osy koncentrace. Vzdálenost mezi tímto bodem a průsečíkem os udává koncentraci stanovovaného prvku ve zkoušeném roztoku.
Pokud je požadována technika pevného vzorku, všechny podrobnosti postupu jsou uvedeny v článku.

2.2.25 Absorpční spektrofotometrie v ultrafialové a viditelné oblastí
Stanovení absorbance. Absorbance A roztoku je definována jako dekadický logaritmus převrácené hodnoty transmitance T pro monochromatické světlo a je vyjádřena vztahem:
$A={\log }_{10}1/T={\log }_{10}{I}_0/I,$
v němž značí:
T - I/I₀,
I₀ - intenzitu dopadajícího monochromatického světelného toku,
I - intenzitu prošlého monochromatického světelného toku.
V homogenním prostředí měřená absorbance (A) závisí na tloušťce měřené vrstvy (b), kterou světlo prochází, a na koncentraci absorbující látky v roztoku (c) podle vztahu:
$A=\epsilon .c.b.$
v němž značí:
ε - molární absorpční koeficient (molární absorptivita), je-li koncentrace vyjádřena v mol/l (c) a tloušťka vrstvy v cm.
Výraz $A_{1cm}^{1\%}$ je specifická absorbance, která vyjadřuje absorbanci roztoku látky o koncentraci 10 g/l měřenou v 1 cm vrstvě při určité vlnové délce:
$A_{1\mathrm{cm}}^{1\%}=\frac{{10}_{\epsilon }}{M_r}.$
Není-li uvedeno jinak, měří se absorbance při předepsané vlnové délce v 1 cm vrstvě při (20± 1) °C a měření se provádí proti použitému rozpouštědlu nebo směsi rozpouštědel. Absorbance použitého rozpouštědla měřená proti vzduchu při předepsané vlnové délce by neměla být vyšší než 0,4, a je přednostně menší než 0,2. Absorpční spektrum se vynese jako závislost absorbance nebo její funkce (osa úseček) na vlnové délce nebo na její funkci (osa pořadnic).
Jestliže je v článcích uváděna jedna hodnota vlnové délky pro maximum absorpce, může se nalezená hodnota od této lišit nejvýše o ±2 nm.
Zařízení. Spektrofotometry vhodné pro měření v ultrafialové a viditelné oblasti spektra se skládají z optického systému schopného poskytovat monochromatické světlo v rozsahu 200 nm až 800 nm a ze zařízení vhodného pro měření absorbance.
Kontrola vlnových délek. Správnost stupnice vlnových délek se ověřuje pomocí hodnot absorpčních maxim roztoku chloristanu holmitého R. Poloha čar pro vodíkovou, resp. deuteriovou lampu a poloha čar pro rtuťové páry jsou uvedeny v tab. 2.2.25-1. Povolená tolerance je ±1 nm pro ultrafialovou oblast a ±3 nm pro viditelnou oblast.
Tab. 2.2.25-1 Maxima absorpce roztoku chloristanu holmitého R a poloha čar pro vodíkovou a deuteriovou lampu

241,15 nm (Ho)	404,66 nm (Hg)
253,7 nm (Hg)	435,83 nm (Hg)
287,15 nm (Ho)	486,0 nm (Dbeta)
302,25 nm (Hg)	486,1 nm (Hbeta)
313,16 nm (Hg)	536,3 nm (Ho)
334,15 nm (Hg)	546,07 nm (Hg)
361,5 nm (Ho)	576,96 nm (Hg)
365,48 nm (Hg)	579,07 nm (Hg)

Kontrola absorbance. Správnost stupnice absorbanci se ověřuje roztokem dichromanu draselného R při vlnových délkách uvedených v tab. 2.2.25-2, v níž jsou pro každou vlnovou délku uvedeny přesné hodnoty specifické absorbance a povolené limity. Tolerance pro absorbanci je ±0,01.
Pro kontrolu absorbance se použije roztoku dichromanu draselného R připraveného takto: rozpustí se 57,0 mg až 63,0 mg dichromanu draselného R, předtím vysušeného při 130 °C do konstantní hmotnosti, v kyselině sírové 0,005 mol/l RS a doplní se jí na 1000,0 ml.
Tab. 2.2.25-2

Vlnová délka v nm	A1%1cm	Maxima tolerance
235	124,5	122,9 až 126,2
257	144,0	142,4 až 145,7
313	48,6	47,0 až 50,3
350	106,6	104,9 až 108,2

Absorbance roztoku dichromanu draselného obsahujícího přesně 60,06 mg K₂Cr₂O₇ v 1000,0 ml roztoku kyseliny sírové 0,005 mol/l RS byly použity jako základ pro tab. 2.2.25-2. Hodnoty absorbance tohoto roztoku měřené při tloušťce vrstvy 1 cm jsou uvedeny v tab. 2.2.25-3.
Tab. 2.2.25-3

235 nm	0,748
257 nm	0,865
313 nm	0,292
350 nm	0,640

Limit rozptýleného záření může být sledován při daných vlnových délkách pomocí vhodných roztoků nebo filtrů. Např. absorbance roztoku chloridu draselného R (12 g/l) měřená v 1 cm vrstvě při 200 nm by měla být vyšší než 2 v porovnání s vodou A jako kontrolní kapalinou.
Rozlišovací schopnost (pro kvalitativní analýzu). Pokud je to předepsáno v článku, je třeba provést měření rozlišovací schopnosti přístroje takto: zaznamená se spektrum roztoku toluenu R (0,02% V/V) v hexanu R. Minimální poměr absorbance v maximu při 269 nm a absorbance v minimu při 266 nm je uveden v článku.
Spektrální šířka štěrbiny (pro kvantitativní analýzu). Abychom předešli při měření chybám způsobeným spektrální šířkou štěrbiny při použití přístroje, kde šířka štěrbiny při zvolené vlnové délce může být měněna, měla by být šířka štěrbiny malá ve srovnání s pološířkou absorpčního pásu, ale současně by měla být co největší, abychom získali vysokou hodnotu I₀. V každém případě šířka štěrbiny přístroje by měla být vždy taková, aby při jejím dalším zmenšení nedocházelo ke změnám v odečtu absorbance.
Kyvety. Povolená tolerance vnitřní vzdálenosti protilehlých stěn používaných kyvet je ±0,005 cm. Naplní-li se týmž rozpouštědlem, měly by kyvety pro zkoušený roztok a pro porovnávací kapalinu mít stejnou transmitanci. V opačném případě je třeba zavést příslušnou korekci.
Kyvety je nutno čistit a zacházet s nimi opatrně.

2.2.26 Papírová chromatografie
Vzestupná papírová chromatografie
Zařízení. Zařízení se skládá ze skleněné komory vhodných rozměrů pro použitý chromatografický papír. Horní část komory je zabroušená a opatřená dobře těsnícím víkem. V horní části komory je zařízení umožňující zavěšení chromatografického papíru a jeho ponoření do mobilní fáze bez otevření komory. Na dně komory je umístěna miska obsahující mobilní fázi, do které může být papír ponořen. Jako chromatografický papír se použije vhodný filtrační papír nastříhaný do pruhů dostatečné délky, ne užších než 2,5 cm; papír je nastříhán tak, aby mobilní fáze protékala ve směru vláken papíru.
Pracovní postup. Mobilní fáze, která je předepsána v článku, se nalije do misky na dně komory do výšky 2,5 cm. Pokud je uvedeno v článku, nalije se stacionární fáze i mezi stěny komory a misku. Komora se uzavře a ponechá se stát po dobu 24 h při teplotě 20 °C až 25 °C. V uvedeném intervalu teplot se komora udržuje i v průběhu další analýzy. Na papír se vyznačí měkkou tužkou horizontální linie (start) ve vzdálenosti 3 cm od jednoho konce. Mikropipetou se nanese na start ve formě skvrny objem roztoku, který je uveden v článku. Jestliže celkový objem nanášeného roztoku by vytvořil skvrnu o větším průměru než 10 mm, roztok se nanáší po částech v opakovaných dílčích dávkách tak, aby se před každým dalším nanášením rozpouštědlo odpařilo. Chromatografuje-li se na stejném pruhu papíru více než jeden vzorek, vzdálenost mezi sousedními skvrnami na startu nemá být menší než 3 cm. Papír s naneseným vzorkem se vloží do komory, která se uzavře víkem, a ponechá stát 1 h 30 min. Potom se papír ponoří do mobilní fáze a vyvíjí se do předepsané vzdálenosti nebo po předepsanou dobu. Papír se vyjme a ponechá uschnout na vzduchu. Během vyvíjení se papír chrání před přímým světlem.
Sestupná papírová chromatografie
Zařízení. Zařízení se skládá ze skleněné komory vhodných rozměrů pro použitý chromatografický papír. Horní část komory je zabroušená a opatřená dobře těsnícím víkem. Víko má středový otvor o průměru asi 1,5 cm uzavíratelný těžkou skleněnou deskou nebo zátkou. V horní části komory je umístěn žlábek pro rozpouštědlo se zařízením k zavěšení chromatografického papíru. Na každé straně žlábku jsou paralelně nad jeho horními okraji umístěny dvě skleněné vodicí tyče podpírající papír tak, aby žádná jeho část se nedotýkala stěn komory. Chromatografický papír je tvořen vhodným filtračním papírem nastříhaným na pruhy dostatečné délky a vhodné šíře, tj. mezi 2,5 cm a délkou žlábku; papír je nastříhán tak, aby mobilní fáze protékala ve směru vláken papíru.
Pracovní postup. Na dno komory se nalije rozpouštědlo uvedené v článku do výše 2,5 cm. Komora se uzavře a ponechá stát 24 h při teplotě 20 °C až 25 °C. V tomto rozmezí teplot se komora v průběhu analýzy udržuje. Na papír se vyznačí měkkou tužkou horizontální linie (start) v takové vzdálenosti od jednoho konce, aby po zajištění tohoto konce papíru ve žlábku s rozpouštědlem zbytek papíru volně splýval přes vodicí tyč a start byl několik cm pod vodicí tyčí a paralelně s ní. Pomocí mikropipety se nanese na start objem roztoku, který je uveden v článku. Jestliže celkový objem, který je nutno nanést, by vytvořil skvrnu o větším průměru než 10 mm, je nutno nanášet roztok po částech tak, aby se před každým následujícím nanášením rozpouštědlo odpařilo. Chromatografuje-li se na tomtéž pruhu papíru více než jeden vzorek, pak vzdálenost mezi sousedními skvrnami nemá být menší než 3 cm. Papír s naneseným vzorkem se vloží do komory, která se uzavře víkem, a ponechá se stát 1 h 30 min. Do žlábku se otvorem ve víku vpraví dostatečné množství mobilní fáze, komora se uzavře a papír se vyvíjí do předepsané vzdálenosti nebo po předepsanou dobu. Papír se vyjme z komory a ponechá uschnout na vzduchu. Během vyvíjení se papír chrání před přímým světlem.

2.2.27 Tenkovrstvá chromatografie
Tenkovrstvá chromatografie je separační metoda, u které stacionární fázi tvoří vhodný materiál nanesený v rovnoměrné tenké vrstvě a fixovaný na skleněný, kovový nebo plastický podklad (deska nebo fólie). K separaci dochází migrací rozpuštěných látek tenkou vrstvou v rozpouštědle nebo vhodné směsi rozpouštědel (mobilní fáze).
Pokud není uvedeno jinak, použije se následující zařízení, desky a postup.
Zařízení
Zařízení se skládá:
- z desek nebo fólií s vrstvami hotovými nebo připravenými (jak je popsáno níže) vhodné velikosti (obvykle 100 mm x 100 mm nebo 200 mm x 200 mm) pro nanášení chromatografovaných roztoků a vyvíjení do předepsané vzdálenosti (dráhy). Tloušťka vrstvy je obvykle 0,1 mm až 0,3 mm,
- z chromatografické komory s plochým nebo dvojžlábkovým dnem z inertního transparentního materiálu vhodné velikosti pro použité desky nebo fólie a opatřené dobře těsnícím víkem,
- z mikropipet, mikroinjekčních stříkaček, kalibrovaných kapilár pro jedno použití nebo jiného nanášecího zařízení, které je vhodné pro správné nanášení roztoků.
Desky
Chromatografie se provádí s použitím desek s vrstvami hotovými nebo připravenými, jak je popsáno níže. Oba typy vrstev vyhovují požadavku ověření detekční schopnosti, je-li předepsáno, i požadavku ověření separační schopnosti. Tyto zkoušky se provádějí současně s chromatografií zkoušené látky nanesením předepsaných porovnávacích roztoků. Je-li nutné, vrstvy je možno před použitím aktivovat zahřátím při 100 °C až 105 °C po dobu 1 h.
Příprava vrstev
Připraví se homogenní suspenze stacionární fáze a vhodným zařízením se nanese na pečlivě vyčištěné desky vrstva o síle 0,1 mm až 0,3 mm. Desky s vrstvami se ponechají schnout na vzduchu a potom se zahřívají v sušárně při teplotě 100 °C až 105 °C po dobu 1 h. Před použitím desky se odstraní úzký pruh vrstvy stacionární fáze z obou stran desky, aby tyto pruhy byly v průběhu vyvíjení vertikálně.
Pracovní postup
Stěny chromatografické komory se vyloží filtračním papírem. Do chromatografické komory se podle její velikosti nalije takové množství mobilní fáze, aby po impregnaci filtračního papíru byla na dně komory vrstva mobilní fáze o výšce 5 mm až 10 mm. Komora se uzavře víkem a ponechá se stát při 20 °C až 25 °C po dobu 1 h.
Na vrstvu se nanese ve vzdálenosti asi 15 mm až 20 mm od spodního okraje a nejméně 10 mm od bočního okraje předepsaný objem roztoků v dostatečně malých dávkách, aby vznikly kruhové skvrny (o průměru 2 mm až 6 mm) nebo, je-li předepsáno, skvrny tvaru proužků (10 mm až 20 mm x 2 mm až 6 mm). Roztoky se nanášejí na start paralelně se spodním okrajem desky tak, aby vzdálenost mezi skvrnami byla nejméně 10 mm.
Po odpaření rozpouštědla z nanášených roztoků se deska vloží do chromatografické komory tak, aby byla co nejvíce ve vertikální poloze a skvrny byly nad hladinou mobilní fáze. Chromatografická komora se uzavře a udržuje při teplotě 20 °C až 25 °C. Deska se vyjme z komory, když mobilní fáze dosáhne vzdálenosti předepsané v článku, vysuší se a chromatogram se deteguje předepsaným způsobem.
Pro dvojrozměrnou chromatografií se vrstva po prvním vyvíjení vysuší a provede se druhé vyvíjení ve směru kolmém na směr prvního vyvíjení.
Ověření separační schopností
Požadavky na ověření separační schopnosti jsou uvedeny v příslušných článcích.
Ověření detekční schopností
Detekční schopnost je dostatečná, jsou-li skvrny získané na chromatogramu s nejzředěnějším porovnávacím roztokem jasně viditelné.

2.2.28 Plynová chromatografie
Plynová chromatografie je separační metoda, ve které mobilní fází je plyn (nosný plyn) a stacionární fází naplněnou do kolony je buď pevná látka, nebo kapalina, kterou je pokryt pevný inertní nosič, nebo kapalný film rovnoměrně nanesený na stěnách kolony.
Plynová chromatografie je založena na mechanismu adsorpce a/nebo rozdělování.
Přístroj. Přístroj se skládá ze zdroje plynu, dávkovacího zařízení, chromatografické kolony, detektoru a vyhodnocovacího zařízení. Kolona je obvykle skleněná nebo z nerezové oceli a obsahuje stacionární fázi. Nosný plyn protéká kolonou kontrolovanou rychlostí do detektoru.
Stanovení je prováděno buď při konstantní teplotě, nebo podle daného teplotního programu.
Použitý detektor musí umožňovat stanovení množství sledovaných látek přítomných v eluátu z kolony. Obvykle je založen na principu plamenné ionizace, tepelné vodivosti, tepelné ionizace nebo elektronového záchytu.
Pracovní postup. Kolona, dávkovači zařízení a detektor se stabilizují při předepsaných teplotách. Připraví se roztok zkoušené látky a porovnávací roztok nebo roztoky, jak je předepsáno. Použitím porovnávacích roztoků se určí vhodné nastavení parametrů přístroje a množství, které má být nastřikováno, aby byla získána vhodná odezva. Provedou se opakované nástřiky, aby byla ověřena reprodukovatelnost odezvy, a je-li zapotřebí, určí se počet teoretických pater.
Nastříknou se roztoky a zaznamenají se výsledné chromatogramy. Provedou se opakované nástřiky, aby byla ověřena reprodukovatelnost odezvy. Určí se plochy píků nebo alternativně výšky píků odpovídajících sledovaným složkám, je-li faktor symetrie píku vypočítán, jak je uvedeno níže, mezi 0,80 a 1,20. Při měřeních vyžadujících teplotní program má být určována plocha píků. Je-li použit vnitřní standard, prověří se, zda žádný pík sledované látky není překryt píkem vnitřního standardu.
Ze získaných hodnot se vypočte obsah stanovované složky nebo složek. Je-li předepsáno, vypočte se procentuální obsah jedné nebo více složek sledované látky určením plochy píku nebo píků z celkové plochy všech píků, vyjma píků rozpouštědla nebo kterýchkoliv přidaných látek (normalizační postup). V tomto případě je doporučeno použití zesilovače se širokým rozsahem a automatického integrátoru.
Faktor symetrie píku se vypočte z výrazu:
$\frac{b_{0,05}}{2A},$
v němž značí:
b_0,05 - šířku píku v jedné dvacetině jeho výšky,
A - vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině výšky píku.
Rozlišení (R_s) se vypočte ze vzorce:
$R_s=\frac{1,18t_{\mathrm{Rb}}-t_{\mathrm{Ra}}}{b_{0,5a}+b_{0,5b}},$
$t_{\mathrm{Rb}}>t_{\mathrm{Ra}}$
v němž značí:
t_Rb a t_Ra- vzdálenosti podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicemi spuštěnými z vrcholů dvou sousedních píků (mm),
b_0,5a a b_0,5b šířky píků v polovině jejich výšky (mm).
Výsledky stanovení lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi měřenými píky v chromatogramu je větší než 1,0, pokud není předepsáno jinak.
Počet teoretických pater (n) se vypočte z údajů získaných za izotermických podmínek ze vzorce:
$n=\text{5,54}{\frac{t_R}{b_{0,5}}}^2,$
v němž značí:
t_R - vzdálenost podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu sledovaného píku (mm),
b_0,5 - šířku píku v polovině jeho výšky (mm).
Kapacitní poměr (D_m) (známý též jako kapacitní faktor) je definován jako:
$D_m=\frac{\text{množství rozpuštěných látek ve stacionární fázi}}{\text{množství rozpuštěných látek v mobilní fázi}}=K\frac{V_s}{V_m},$
v němž značí:
K - rovnovážný rozdělovači koeficient,
V_s - objem stacionární fáze,
V_m - objem mobilní fáze.
Kapacitní poměr složky může být určen z chromatogramu s použitím vzorce:
$D_m=\frac{t_R-t_{R\text{'}}}{t_{R\text{'}}},$
v němž značí:
t_R - vzdálenost v mm podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu píku odpovídajícího složce,
t_R‘, - vzdálenost v mm podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu píku odpovídajícího nezadržované složce.
Poměr signálu k šumu (S/N) je počítán ze vzorce:
$\text{S/N}=\frac{2H}{h_n},$
v němž značí:
H - výšku píku odpovídajícího dané složce na chromatogramu získaném s předepsaným porovnávacím roztokem,
h_n - absolutní hodnotu největší výchylky signálu šumu od základní linie na chromatogramu kontrolního roztoku získaného při slepé zkoušce a sledovaného v rozsahu úměrném 20násobku šířky píku v polovině jeho výšky na chromatogramu předepsaného porovnávacího roztoku a pozorovaného v místě rovnoměrně situovaném okolo místa, kde by se tento pík nacházel.
Head-space plynová chromatografie
Head-space plynová chromatografie je metoda zvláště vhodná pro rozdělení a stanovení těkavých látek přítomných v pevných nebo kapalných vzorcích. Metoda je založena na analýze plynné fáze, která je v rovnováze s pevnou nebo kapalnou fází.
Přístroj. Přístroj se skládá z plynového chromatografu opatřeného zařízením pro zavádění zkoušeného vzorku, které může být připojeno k modulu, jenž automaticky ovládá tlak a teplotu. Je-li to nutné, může být připojeno zařízení pro eliminaci rozpouštědel. Analyzovaný vzorek je umístěn do lahvičky opatřené vhodným uzávěrem. Další částí je systém ventilů umožňující průchod nosného plynu. Lahvička je umístěna do termostatované nádobky vyhřívané na vhodnou teplotu dle povahy zkoušeného vzorku. Vzorek je zahříván na tuto teplotu dostatečně dlouho, aby byla ustavena rovnováha mezi pevnou nebo kapalnou fází a plynnou fází.
Nosný plyn je zaváděn do nádobky a po předepsaném čase se otevře vhodný ventil, který umožní expanzi plynu unášejícího zplynitelné látky do chromatografické kolony.
Místo chromatografu speciálně vybaveného pro zavádění vzorků je též možné použít vzduchotěsnou stříkačku a běžný chromatograf. Ustavení rovnováhy pak probíhá v oddělené komůrce a plynná fáze je vedena na kolonu při zajištění podmínek zaručujících, že nedojde k porušení rovnováhy.
Pracovní postup. Použitím porovnávacích vzorků se určí vhodné instrumentální podmínky k dosažení vhodné odezvy.

a) Přímá kalibrace
Do stejných lahviček se umístí odděleně zkoušené látky a všechny porovnávací vzorky, jak je předepsáno v článku, přičemž se zabrání kontaktu mezi dávkovacím zařízením a vzorky. Lahvičky se hermeticky uzavřou a vloží do termostatovaného prostoru udržovaného na teplotě a tlaku předepsaných v článku.
Po ustavení rovnováhy se provede chromatografická analýza za předepsaných podmínek.

b) Standardní přídavek
Do sady stejných vhodných lahviček se umístí stejné objemy zkoušeného přípravku. Do všech lahviček kromě jedné se přidají vhodná množství porovnávacích vzorků, které obsahují známé koncentrace stanovované látky, takže vznikne série přípravků obsahujících postupně vzrůstající koncentrace této látky. Lahvičky se hermeticky uzavřou a vloží se do termostatovaného prostoru udržovaného na teplotě a tlaku předepsaných v článku. Po ustavení rovnováhy se provede chromatografická analýza za předepsaných podmínek.
Metodou nejmenších čtverců se vypočítá lineární rovnice přímky a z ní se určí koncentrace stanovované látky ve zkoušeném přípravku.
Alternativně se vynesou do grafu střední hodnoty naměřených dat proti přidaným množstvím stanovované látky. Extrapoluje se přímka vycházející z bodu na grafu k ose koncentrací. Vzdálenost mezi tímto bodem a průsečíkem os představuje koncentraci stanovované látky ve zkoušeném přípravku.

c) Postupný odběr
V případě, že je požadována metoda postupného odběru, je podrobně popsána v článku.

2.2.29 Kapalinová chromatografie
Kapalinová chromatografie je separační metoda, kde mobilní fází je kapalina a stacionární fází naplněnou do kolony je buď jemně rozptýlená pevná látka, nebo kapalina nanesená na pevný nosič, nebo pevný nosič, který je chemicky modifikován navázáním organických skupin.
Kapalinová chromatografie je založena na mechanismu adsorpce, rozdělování, iontové výměny nebo vylučování.
Zařízení. Přístroj se obvykle skládá z čerpacího systému, dávkovacího zařízení (injekční stříkačka nebo nastřikovaní ventil), chromatografické kolony, detektoru a zapisovače. Mobilní fáze je obvykle přiváděna pod tlakem z jednoho nebo více zásobníků a protéká kolonou konstantní rychlostí a potom detektorem.
Teplota chromatografické kolony je udržována konstantní. Složení předepsané mobilní fáze může být buď konstantní během celého chromatografického procesu (izokratická eluce), nebo se může měnit podle definovaného programu (gradientová eluce).
Použitý detektor umožňuje stanovení množství sledovaných látek eluovaných z kolony. Detekce je obvykle založena na absorpční spektrofotometru. Diferenční refraktometrie, fluorimetrie; spalovací a elektrochemické metody jsou také používány.
Pracovní postup. Kolona se uvede do rovnovážného stavu s předepsanou mobilní fází. Připraví se roztok zkoušené látky a porovnávací roztok nebo roztoky tak, jak je předepsáno. Roztoky nesmí obsahovat pevné částice. Za použití porovnávacích roztoků se určí vhodné nastavení přístroje a nastřikované množství potřebné pro přiměřenou odezvu. Provedou se opakované nástřiky pro ověření reprodukovatelnosti odezvy, a je-li to požadováno, stanoví se počet teoretických pater.
Nastříknou se roztoky a zaznamenají se výsledné chromatogramy. Provedou se opakované nástřiky k ověření reprodukovatelnosti odezvy. Stanoví se plochy píků sledovaných látek, případně výšky píků, leží-li hodnota faktoru symetrie píku vypočtená podle vzorce uvedeného níže mezi 0,80 a 1,20. V aplikacích vyžadujících gradientovou eluci je třeba použít stanovení ploch píků. Je-li použit vnitřní standard, zkontroluje se, zda není žádný pík zkoušené látky překryt Pikem vnitřního standardu.
Ze získaných hodnot se vypočte obsah stanovované složky nebo složek. Je-li požadován procentuální obsah jedné nebo více složek zkoušené látky, vypočte se stanovením plochy píku nebo píků jako procenta celkové plochy všech píků vyjma píků rozpouštědla nebo jakéhokoliv přidaného činidla (metoda normalizace). Pak se doporučuje použití automatického integrátoru a zesilovače s širokým rozsahem.
Faktor symetrie píku se vypočte z výrazu:
$\frac{b_{0,05}}{2A},$
v němž značí:
b_0,05 - šířku píku v jedné dvacetině jeho výšky (mm),
A - vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině výšky píku (mm).
Rozlišení (R_S) se vypočte ze vzorce:
$R_s=\frac{\text{1,18}{t}_{\mathrm{Rb}}-t_{\mathrm{Ra}}}{b_{0,5a}+b_{0,5b}},$
$t_{\mathrm{Rb}}>t_{\mathrm{Ra}}$
v němž značí:
t_Rb a t_Ra - vzdálenosti podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicemi spuštěnými z vrcholů dvou sousedních píků (mm),
b_0,5a a b_0,5b - šířky píků v polovině jejich výšky (mm).
Výsledky stanovení lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi měřenými píky v chromatogramu je větší než 1,0, pokud není předepsáno jinak.
Počet teoretických pater (n) se vypočte z údajů, získaných za izotermických podmínek ze vzorce:
$n=\text{5,54}{\frac{t_R}{b_{0,5}}}^2,$
v němž značí:
t_R - vzdálenost podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu sledovaného píku (mm),
b_0,5 - šířku píku v polovině jeho výšky (mm).
Kapacitní poměr (D_m) (známý též jako kapacitní faktor) je definován jako:
$D_m=\frac{\text{množství rozpuštěných látek ve stacionární fázi}}{\text{množství rozpuštěných látek v mobilní fázi}}=K\frac{V_s}{V_m},$
v němž značí:
K - rovnovážný rozdělovači koeficient,
V_s - objem stacionární fáze,
V_m - objem mobilní fáze.
Kapacitní poměr složky může být určen z chromatogramu s použitím vzorce:
$D_m=\frac{t_R-t_{R\text{'}}}{t_{R\text{'}}},$
v němž značí:
t_R - vzdálenost podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu píku odpovídajícího složce (mm),
t_R - vzdálenost podél základní linie mezi bodem nástřiku a kolmicí spuštěnou z vrcholu píku odpovídajícího nezadržované složce (mm).
Poměr signálu k šumu (S/N) je počítán ze vzorce:
$\text{S/N}=\frac{2H}{h_n},$
v němž značí:
H- výšku píku odpovídajícího dané složce na chromatogramu získaném s předepsaným porovnávacím roztokem,
h_n - absolutní hodnotu největší výchylky signálu šumu od základní linie na chromatogramu kontrolního roztoku získaného při slepé zkoušce a sledovaného v rozsahu úměrném 20násobku šířky píku v polovině jeho výšky na chromatogramu předepsaného porovnávacího roztoku a pozorovaného v místě rovnoměrně situovaném okolo místa, kde by se tento pík nacházel.

2.2.30 Vylučovací chromatografie
Vylučovací chromatografie (s organickou mobilní fází je známá jako gelová chromatografie a s vodnou mobilní fází se používá název gelová filtrace) je chromatografická technika, která rozděluje molekuly v roztoku podle jejich velikosti. Vzorek je vnesen na kolonu naplněnou gelem nebo náplní s porézními částicemi a je nesen mobilní fází kolonou. K separaci podle velikosti dochází opakovanou výměnou rozpuštěných molekul (rozpuštěné látky) mezi rozpouštědlem v mobilní fázi a týmž rozpouštědlem v nepohyblivé kapalné fázi (stacionární fázi), která je v pórech náplně. Rozmezí velikosti pórů náplně určuje rozmezí velikosti molekul, ve kterém může dojít k separaci.
Molekuly, které jsou tak malé, že mohou pronikat do všech pórů, jsou eluovány s celkovým permeačním objemem (V_t). Molekuly výrazně větší než maximální velikost pórů náplně se pohybují v koloně jen prostory mezi částicemi náplně bez zadržování a jsou eluovány s vylučovacím objemem (V_o). K separaci podle velikosti molekul dochází mezi vylučovacím a celkovým permeačním objemem, přičemž použitelná je obvykle separace v prvních dvou třetinách tohoto rozmezí.
Zařízení. Základem zařízení je chromatografická kolona vhodných rozměrů, v případě potřeby termostatovaná, naplněná separačním materiálem schopným dělení ve vhodném rozsahu velikosti molekul, kterou protéká konstantní rychlostí eluent. Jeden konec kolony je obvykle připojen ke vhodnému zařízení pro nástřik vzorku, jako je adaptér průtoku, septový dávkovač nebo nastřikovací ventil, a může být také připojen ke vhodnému čerpadlu pro kontrolu průtoku eluentu. Případně může být vzorek nastřikován přímo na vstup kolony (povrch náplně kolony zbavený kapaliny), nebo je-li vzorek hustší než eluent, může být převrstven eluentem. Výstup z kolony je obvykle připojen k vhodnému detektoru spojenému s automatickým zapisovačem, který umožňuje záznam relativních koncentrací separovaných složek vzorku. Detektory jsou většinou založeny na fotometrických, refraktometrických nebo luminiscenčních vlastnostech. V případě potřeby může být připojen automatický sběrač frakcí.
Náplní může být měkký nosič, jako je nabobtnalý gel, nebo tuhý nosič tvořený sklem, silikagelem nebo zesíťovaným organickým polymerem kompatibilním s rozpouštědlem. Tuhé nosiče obvykle vyžadují tlakovaný systém umožňující rychlejší separace. Mobilní fáze je volena podle typu vzorku, separačního prostředí a způsobu detekce.
Před provedením separace by měla být náplň upravena a naplněna do kolony tak, jak je popsáno v článku nebo podle návodu výrobce.
V případě potřeby jsou v článcích uvedeny postupy pro ověření způsobilosti systému. Účinnost kolony může být vyhodnocena z počtu teoretických pater (n), vypočteného ze vzorce:
$\text{5,54}{\frac{V_r}{b_{0,5}}}^2,$
v němž značí:
V_r - retenční objem v maximu píku,
b_0,5 - šířku píku v polovině jeho výšky vyjádřenou ve stejných jednotkách jako retenční objem.
Stanovení distribučního koeficientu K_D
Eluční charakteristika látky na určité koloně může být dána distribučním koeficientem, K_D, který se vypočte ze vzorce:
$\frac{V_r-V_0}{V_t-V_0}.$
Stanovení se provede měřením retenčních objemů nezadržované složky (V₀), jiné složky, která může pronikat do všech pórů nosiče, (V_t), a látky, jejíž rozdělovači koeficient je stanovován, ( V_r). Retenční objem se měří od nástřiku do maxima píku.
Stanovení poměrného složení směsi
Provede se separace podle článku. Je-li to možné, průběžně se zaznamenává eluce složek a měří se odpovídající plochy píků. Je-li zaznamenávána fyzikálně-chemická vlastnost a mají-li všechny stanovované složky vzorku stejnou odezvu (např. mají-li stejnou specifickou absorbanci), spočítá se relativní množství každé složky jako podíl příslušné plochy píku a součtu ploch píků všech stanovovaných složek. Nejsou-li detekční odezvy stanovovaných složek stejné, spočítá se obsah pomocí kalibračních křivek získaných s použitím kalibračních referenčních látek předepsaných v článku.
Stanovení molekulových hmotností
Vylučovací chromatografii lze použít pro stanovení molekulových hmotností po srovnání s vhodnými kalibračními referenčními látkami, specifikovanými v článku.
Do grafu se vynese závislost retenčních objemů kalibračních referenčních látek na logaritmu jejich molekulových hmotností. Křivka se obvykle blíží přímce mezi vylučovací mezí a mezí úplné permeace pro použité separační prostředí. Z kalibrační křivky se stanoví molekulové hmotnosti. Kalibrace pro molekulové hmotnosti je platná jen pro určitý makromolekulární systém látka/rozpouštědlo za daných experimentálních podmínek.
Stanovení distribuce velikosti molekul polymerů
Vylučovací chromatografii lze použít pro stanovení distribuce velikosti molekul polymerů. Avšak porovnání vzorků je možné jen s výsledky získanými za stejných experimentálních podmínek. Látky použité pro kalibraci a metody stanovení distribuce velikosti molekul polymerů jsou uvedeny v článku.

2.2.31 Elektroforéza
Elektroforéza je fyzikálně-analytická metoda založená na pohybu elektricky nabitých částic rozpuštěných nebo dispergovaných v roztoku elektrolytu v elektrickém poli.
Elektroforetická pohyblivost je rychlost pohybu nabitých částic v m/s v elektrostatickém poli o intenzitě 1 V/m. Vyjadřuje se v m².V^-1.s^-1. Z praktických důvodů se používá cm².V^-1.s^-1. Pohyblivost může být definována pouze pro daný elektrolyt za určitých experimentálních podmínek. Je ovlivněna mnoha faktory, např.:
- charakteristikou nabitých částic: druhem, velikostí, tvarem, elektrickým nábojem, koeficientem tření;
- charakteristikou kapaliny, ve které se nabité částice pohybují: rozpouštědlem, druhem a koncentrací elektrolytu, iontovou silou, pH, viskozitou roztoku.
Směr pohybu závisí na druhu elektrického náboje; nabité částice se pohybují k elektrodě s opačným nábojem.
Volná elektroforéza neboli elektroforéza s pohyblivým rozhraním
Tato metoda se hlavně užívá ke stanovení elektroforetické pohyblivosti, přičemž experimentální charakteristiky jsou přímo měřitelné a reprodukovatelné. Hlavně se používá u látek o vysoké relativní molekulové hmotnosti s nízkými difuzními koeficienty. Poloha rozhraní se na počátku stanoví fyzikálními metodami, jako jsou refraktometrie nebo konduktometrie. Po aplikaci daného elektrického pole se po přesně změřeném čase pozorují nová rozhraní a jejich vzájemná poloha. Je nutno volit takové pracovní podmínky, které zajistí vznik a určení tolika rozhraní, kolik je složek.
Zónová elektroforéza v nosiči
Tato metoda vyžaduje pouze malé množství vzorku.
Druh nosiče, jako je papír, agarový gel, acetat celulosy, škrob, agarosa, methakrylamid, směsný gel, zavádí množství dalších faktorů ovlivňujících elektroforetickou pohyblivost:
Rychlost pohybu potom závisí na čtyřech hlavních faktorech, zejména na pohyblivosti nabité částice, elektroendosmotickém proudění, na odpařování a intenzitě elektrického pole. Proto je nezbytné pracovat za zcela přesně definovaných experimentálních podmínek a používat, kdekoliv je to možné, referenčních látek.
Zařízení pro elektroforézu se skládá ze:
- zdroje stejnosměrné elektrické energie, jehož napětí může být regulováno a stabilizováno;
- elektroforetické komory, je obvykle pravoúhlá, vyrobená ze skla nebo pevného plastu se dvěma oddělenými prostory - anodickým a katodickým - obsahujícími roztok elektrolytu. V každém prostoru je ponořena elektroda, např. platinová nebo grafitová. Elektrody jsou propojeny vhodně izolovaným obvodem se zdrojem stejnosměrného proudu, čímž se vytvoří anoda a katoda. Hladina kapaliny v obou prostorech se udržuje na stejné úrovni, aby se předešlo vzájemnému přelévání.
Elektroforetická komora je uzavřena vzduchotěsným víkem, které udržuje vlhkostí nasycenou atmosféru během operace a tím snižuje odpařování rozpouštědla. Víko může být opatřeno bezpečnostním zařízením, které po jeho sejmutí vypne elektrický proud. Jestliže elektrický výkon překročí 10 W, doporučuje se chlazení nosiče;
- zařízení na upevnění nosiče:
Proužková elektroforéza. Proužek nosiče, předem navlhčený v používaném roztoku elektrolytu a ponořený na obou koncích do elektrodových prostorů, je vhodně napnutý a upevněný k vhodnému držáku nosiče, který zabrání difuzi elektrolytu. Držák může být vodorovný rámeček, podstavec ve tvaru obráceného V nebo podložka s vertikálně vyčnívajícími hroty umístěnými ve vhodných vzdálenostech;
Gelová elektroforéza. Zařízení se skládá ze skleněné desky (např. mikroskopické sklíčko), na jejíž celou plochu je nanesena pevně přilnavá vrstva gelu stejné tloušťky. Elektrické spojení mezi gelem a vodivým roztokem je zajištěno různými způsoby podle druhu použitého zařízení. Je třeba učinit preventivní opatření, aby bylo zabráněno kondenzaci vlhkosti nebo vysychání pevné vrstvy;
- měřicího nebo detekčního zařízení.
Pracovní postup. Roztok nosného elektrolytu se nalije do elektrodových prostorů. Nosič nasycený elektrolytem se umístí do komory způsobem vhodným pro dané zařízení. Vyznačí se místo startu a nanese se vzorek. Na předepsanou dobu se zapojí energetický zdroj. Po vypnutí zdroje se nosič vyjme z komory, vysuší se a vizuálně posoudí.
Elektroforéza na polyakrylamidovém gelu
Při tomto typu elektroforézy je stacionární fází (nosičem) gel připravený ze směsi akrylamidu a N,Nˊ -methylenbisakrylamidu. Gely se mohou připravit do trubiček 7,5 cm dlouhých a o vnitřním průměru 0,5 cm (trubičkové gely). V tomto případě se na jednu trubičku nanáší jeden roztok. Gely mohou být také připraveny mezi skleněnými deskami (deskový gel). Na takto připravený gel je možno nanášet více roztoků.
Zařízení. Skládá se ze dvou nad sebou umístěných nádobek na tlumivý roztok vyrobených z vhodného materiálu, jako je polymethylmethakrylát. Každá nádobka je vybavena platinovou elektrodou. Elektrody jsou připojeny ke zdroji umožňujícímu práci buď při konstantním proudu, nebo při konstantním napětí. Pro trubičkové gely je na dně horní nádobky několik držáků stejně vzdálených od elektrody. Pro deskové gely jsou k dispozici vyvíjecí komory umožňující dělení ve vertikální nebo horizontální poloze.
Postup stanovení. Před polymerací gelu by měly být roztoky odplyněny a gely používány okamžitě po přípravě.

a) Trubičkové gely
Připraví se směs gelu podle předpisu a nalije se do skleněných trubiček s uzavřeným dnem do stejné výšky asi 1 cm od horního okraje. Je nutno zajistit, aby v trubičce nezůstaly bublinky vzduchu. Směs gelu se převrství vodou R, aby se zamezilo přístupu vzduchu, a gel se nechá zpolymerovat. Tvorba gelu trvá asi 30 min a je ukončena, když se objeví ostré rozhraní mezi gelem a vrstvou vody. Vrstva vody se odstraní. Spodní nádobka se naplní předepsaným tlumivým roztokem a odstraní se uzávěry trubiček. Trubičky se upevní do držáků v horní nádobce tak, aby spodní část trubiček byla ponořena v tlumivém roztoku spodní nádobky. Trubičky se opatrně naplní předepsaným tlumivým roztokem. Připraví se zkoušený roztok a porovnávací roztok, které obsahují vhodné značkovací barvivo, a zahustí se např. sacharosou R. Tyto roztoky se nanášejí na povrch gelu jednotlivých trubiček, přičemž pro každý roztok se použije jiná trubička. Do horní nádobky se nalije stejný tlumivý roztok. Elektrody se připojí ke zdroji elektrické energie a elektroforéza se nechá probíhat za předepsané teploty a při předepsaném konstantním napětí nebo předepsané intenzitě proudu. Zdroj energie se vypne v okamžiku, kdy značkovací barvivo doputuje téměř ke spodní nádobce. Trubičky se okamžitě vyjmou ze zařízení a gel se z nich uvolní. Poloha jednotlivých zón se v elektroforeogramu deteguje předepsaným způsobem.

a) následkem porozity nosiče je naměřená migrační vzdálenost menší než skutečná dráha iontu,

b) Deskové gely
Gelová směs se připraví předepsaným způsobem a vpraví se do vhodné formy buď pomocí pumpy, nebo nalitím. Je nutno zajistit, aby v gelu nezůstaly bublinky vzduchu. Otvory pro vzorky se mohou v gelu vytvořit přímo pomocí vhodného plastikového hřebene. Po z polymerování gelu se uvolní dolní okraj desky, odřízne se nadbytečný polyakrylamid a odstraní se hřeben. Desky se upevní do komory a spodní nádobka se naplní předepsaným tlumivým roztokem. Otvory pro vzorky se opatrně naplní předepsaným tlumivým roztokem. Připraví se zkoušený roztok a porovnávací roztok, které obsahují vhodné značkovací barvivo, a zahustí se např. sacharosou R. Roztoky se odděleně nanesou do otvorů v horním okraji gelu. Horní nádobka se naplní předepsaným tlumivým roztokem. Elektrody se připojí ke zdroji elektrické energie a elektroforéza se nechá probíhat za předepsané teploty při předepsaném konstantním napětí nebo proudu. Zdroj energie se vypne v okamžiku, kdy značkovací barvivo doputuje k spodnímu okraji gelu. Desky se okamžitě vyjmou z aparatury a gel se uvolní. Poloha jednotlivých zón se deteguje v elektroforeogramu předepsaným způsobem.
Zaostřovací gel. Jestliže je v článku předepsáno použití zaostřovacího gelu, postupuje se, jak je uvedeno výše s následující modifikací. Směsí separačního gelu se naplní přibližně tři čtvrtiny celkové délky desky a nechá se z polymerovat. Odstraní se vrstva vody a deska se doplní druhou vrstvou zaostřovacího gelu připravenou způsobem předepsaným v článku. Jestliže je to potřebné, použije se plastikový hřeben k vytvoření otvorů pro nanesení vzorků a gel se nechá zpolymerovat. Na takto připraveném gelu by měla být vzdálenost mezi otvory pro vzorky a povrchem separačního gelu minimálně 1 cm až 2 cm.
V poslední době se používají stále více komerčně připravené polyakrylamidové gely, které zaručují lepší reprodukovatelnost výsledků.

b) některé nosiče nejsou elektroneutrální, a mohou tedy vyvolat významný elektroosmotický tok,

c) jakékoliv zahřívání může vlivem Jouleova efektu způsobit odpařování kapaliny z nosiče, což v důsledku kapilarity způsobí pohyb roztoku od krajů do středu. Iontová síla z tohoto důvodu má tendenci postupně vzrůstat.

2.2.32 Ztráta sušením
Ztráta sušením je ztráta hmotnosti vyjádřená ve hmotnostních procentech (m/m).
Postup zkoušky. Naváží se předepsané množství zkoušené látky do váženky předem vysušené za podmínek, předepsaných pro zkoušenou látku. Látka se vysuší do konstantní hmotnosti nebo se suší předepsanou dobu jedním z následujících postupů:
Pokud jsou předepsány jiné podmínky, postupuje se přesně tak, jak je předepsáno v jednotlivém článku.

a) "v exsikátoru". Sušení se provádí nad oxidem fosforečným R při atmosférickém tlaku vzduchu a při pokojové teplotě;

b) "ve vakuu". Sušení se provádí nad oxidem fosforečným R při tlaku 1,5 kPa až 2,5 kPa a při pokojové teplotě;

c) "ve vakuu při stanoveném teplotním rozmezí". Sušení se provádí nad oxidem fosforečným R při tlaku 1,5 kPa až 2,5 kPa a teplotním rozmezí předepsaném v článku;

d) "v sušárně" při stanoveném teplotním rozmezí. Sušení se provádí v sušárně při teplotním rozmezí předepsaném v článku;

e) "pod vysokým vakuem". Sušení se provádí nad oxidem fosforečným R při tlaku, který nepřekročí 0,1 kPa a teplotě předepsané v článku.

2.2.33 Nukleární magnetická rezonanční spektrometrie
Nukleární magnetická rezonanční (NMR) spektrometrie je založena na skutečnosti, že atomová jádra jako ¹H, ¹³C, ¹⁹F, ³¹P mají permanentní nukleární magnetický moment. Při vložení do vnějšího magnetického pole (hlavní pole) nabývají určitých, přesně definovaných orientací vzhledem ke směru tohoto pole, což odpovídá jednotlivým energetickým hladinám. Při dané intenzitě magnetické indukce dochází k přechodům mezi sousedními energetickými hladinami vlivem absorpce elektromagnetického záření charakteristických vlnových délek odpovídajících radiovým kmitočtům.
Tyto kmitočty lze určit buď postupným hledáním rezonančních podmínek (CW [continuouswave] spektrometrie), nebo současnou excitací všech přechodů multifrekvenčním impulzem a následnou počítačovou analýzou vyhasínání volné indukce, při kterém se excitovaný systém vrací do základního stavu (pulzní spektrometrie).
Spektrum protonové magnetické rezonance se jeví jako soubor signálů, které odpovídají protonům a jsou charakteristické pro jejich nukleární a elektronové okolí v molekule. Rozdíl mezi daným signálem a signálem referenční látky se nazývá chemický posun (δ) a vyjadřuje se v ppm (parts per milion). Charakterizuje druh protonu v závislosti na elektronovém okolí. Signály jsou často rozštěpeny do skupin vzájemně souvisejících píků nazývaných dublety, triplety, ... multiplety. Toto štěpení je způsobeno přítomností permanentních magnetických polí vytvářených sousedními jádry, zvláště protonů oddělených dvěma až pěti chemickými vazbami. Intenzita každého signálu se určí z plochy pod příslušným signálem a je úměrná počtu ekvivalentních protonů.
Přístroj. NMR-spektrometr pro CW-spektrometrii se skládá z magnetu, nízkofrekvenčního generátoru pro posun pole, držáku vzorku, radiofrekvenčního vysílače a přijímače, zapisovače a elektronického integrátoru. Pulzní spektrometr je dále vybaven pulzním vysílačem a počítačem pro sběr, uložení a matematickou transformaci dat na běžné spektrum.
Používá se NMR-spektrometr s kmitočtem minimálně 60 MHz pro ¹H. Pokud není předepsáno jinak, je třeba dodržovat instrukce výrobce přístroje. Před záznamem spektra je třeba ověřit, že:
CW-spektrometrie
Spektrometr se seřídí tak, aby pracoval pokud možno v čistě absorpčním modu a přitom nedošlo k saturaci signálů. Dále se nastaví tak, aby nejintenzivnější pík ve spektru zkoušené látky obsáhl téměř celý rozsah stupnice zapisovače a aby signál vnitřního standardu odpovídal chemickému posunu δ 0,00 ppm. Zaznamená se spektrum v požadovaném rozsahu, není-li uvedeno jinak, při rychlosti záznamu, která by neměla přesáhnout 2 Hz/s. Zaznamená se integrované spektrum ve stejném rozsahu a při vhodné rychlosti záznamu podle použitého přístroje. Kvantitativní měření se provede podle příslušného předpisu.
Pulzní spektrometrie
Akviziční parametry spektrometru (pulzní sklápěcí úhel, amplituda a délka pulzu, interval mezi pulzy, spektrální šířka, rozlišení a rychlost snímání) se nastaví podle instrukcí výrobce a shromáždí se nezbytný počet signálů vyhasínání volné indukce. Po matematické transformaci dat počítačem se nastaví fáze tak, aby se získalo pokud možno čisté absorpční spektrum, a provede se kalibrace spektra vzhledem k rezonanční frekvenci odpovídající chemickému posunu vnitřního standardu. Spektrum uložené v počítači se zaznamená na vhodném výstupním zařízení a pro kvantitativní měření se provede integrace podle vybavení přístroje.

1. Rozlišení je 0,5 Hz nebo méně při měření šířky píku v polovině výšky při použití přiměřeného rozsahu stupnice pro tyto píky:
- buď pík při δ 7,33 ppm nebo při δ 7,51 ppm symetrického multipletu u 20% roztoku (V/V) dichlorbenzenu R v deuterovaném acetonu R,
- nebo pík při δ 0,00 ppm pro 5% roztok (V/V) tetramethylsilanu R v deuterovaném chloroformu R,

2. Poměr signálu k šumu (S/N) měřený v rozmezí od δ 2 ppm do δ 5 ppm ve spektru 1% roztoku ethylbenzenu R v tetrachlormethanu R (V/V) je minimálně 25 : 1. Tento poměr se vypočte jako průměr z pěti stanovení podle vztahu:
$\text{S/N}=\text{2,5}\frac{A}{H},$
v němž značí:
A - amplitudu v mm největšího píku methylenového kvartetu ethylbenzenu při δ 2,65 ppm, amplituda se měří od základní čáry procházející středem šumu na každé straně tohoto kvartetu a ve vzdálenosti minimálně 1 ppm od jeho středu,
H - mezi vrcholovou amplitudu šumu základní čáry změřenou v mm mezi δ 4 ppm a δ 5 ppm;

3. Amplituda postranních rotačních pásů není větší než 2 % amplitudy píku vzorku v kyvetě rotující rychlostí běžnou pro daný spektrometr;

4. Pro kvantitativní měření se ověří reprodukovatelnost integrátoru za použití 5% roztoku ethylbenzenu R v tetrachlormetanu R (V/V). Provede se pět po sobě jdoucích stanovení protonů fenylových a ethylových skupin a vypočtou se průměrné hodnoty, žádná z jednotlivých hodnot se nemá lišit od průměru o více než 2,5 %.
Postup měření. Zkoumaná látka se rozpustí podle předpisu a roztok se zfiltruje. Roztok musí být čirý. Použije se vnitřní standard, kterým je obvykle roztok obsahující 0,5 % až 1 % tetramethylsilanu R (TMS) v deuterovaném organickém rozpouštědle (V/V) nebo roztok tetradeuteriotrimethyl-silylpropionanu sodného R 5 g/l až 10 g/l v oxidu deuteria R. Vezme se potřebné množství a zaznamená se spektrum.

2.2.34 Termogravimetrie
Termická analýza je skupina technik, při kterých je měřena změna fyzikální vlastnosti látky v závislosti na teplotě. Nejběžněji užívanými jsou techniky, při nichž se měří změny energie nebo hmotnosti látky.
Termogravimetrie je technika, při které je zaznamenávána hmotnost vzorku látky jako funkce programovaně se měnící teploty.
Přístroj. Základními složkami termovah jsou zařízení pro ohřev a chlazení látky podle zadaného teplotního programu, nosič vzorku v kontrolované atmosféře, elektrováha a zapisovač. Přístroj může být spojen se zařízením umožňujícím analýzu těkavých produktů.
Ověření teploty. Kontrola teplotní stupnice se provádí pomocí niklu nebo jiného vhodného materiálu dle pokynů výrobce.
Kalibrace elektrováhy. Vhodné množství šťavelanu vápenatého monohydrátu CRL se vloží do nosiče vzorku a zaznamená se jeho hmotnost. Nastaví se rychlost ohřevu podle pokynů výrobce a spustí se teplotní program. Zaznamenává se termogravimetrická křivka jako graf s teplotou na ose úseček stoupající zleva doprava a hmotností na ose pořadnic stoupající zdola nahoru. Ohřev se přeruší asi při 230 °C. Na grafu se změří vzdálenost mezi počáteční a konečnou hmotnostně teplotní prodlevou, která odpovídá úbytku hmotnosti. Deklarovaný úbytek hmotnosti pro šťavelan vápenatý monohydrát CRL je udán v označení na obalu.
Postup zkoušky. Stejně se postupuje v případě stanovení zkoumané látky, přičemž se respektují podmínky předepsané v článku. Úbytek hmotnosti stanovované látky se vypočte ze vzdálenosti změřené v získaném grafu. Úbytek hmotnosti se vyjádří v hmotnostních procentech.
Používá-li se zařízení častěji, provádí se kontrola teploty a kalibrace pravidelně. Jinak se tyto kontroly provádějí před každým měřením.

2.2.35 Osmolalita
Osmolalitou se stanovují prakticky všechny rozpuštěné látky, které se podílejí na osmotickém tlaku roztoku.
Přijatelná aproximace pro osmolalitu ξ_m určitého vodného roztoku je dána vztahem:
${\xi }_m=\mathrm{\upsilon m\varphi }.$
Není-li roztok ionizován, υ = 1. Jestliže roztok je ionizován, υ je celkový počet iontů přítomných v roztoku nebo vytvořených solvolýzou z jedné molekuly rozpuštěné látky.
m - molalita roztoku, což je počet molů rozpuštěné látky na kilogram rozpouštědla,
Φ - molální osmotický koeficient, který udává počet interakcí mezi ionty opačného náboje v roztoku. Je závislý na hodnotě m. Zvyšuje-li se složitost roztoku, hodnotu Φ je obtížné měřit.
Jednotkou osmolality je osmol na kilogram (osmol/kg), ale obyčejně se používá odvozená jednotka miliosmol na kilogram (mosmol/kg).
Není-li uvedeno jinak, stanovuje se osmolalita měřením snížení teploty tuhnutí. Mezi osmolalitou a snížením teploty tuhnutí ΔT platí následující vztah:
${\xi }_m=\frac{∆T}{\text{1,86}}·\text{1000}\mathrm{mosmol}/\mathrm{kg}.$
Přístroj. Přístroj (osmometr) se skládá ze:
- zařízení pro chlazení nádoby pro měření,
- systému pro měření teploty, obsahujícího elektrický odpor, citlivý na teplotu (termistor) a přístroje pro běžné měření proudu nebo měření rozdílu potenciálů, který má stupnici pro snížení teploty nebo přímo pro osmolalitu,
- zařízení pro míchání vzorku (obvykle součást přístroje).
Tab. 2.2.35-1 Porovnávací roztoky pro kalibraci osmometru

Obsah chloridu sodného R v g/kg vody R	Skutečná osmolalita (mosmol/kg)	Ideální osmolalita (mosmol/kg)	Molální osmotický koeficient	Kryoskopické snížení (° C)
3,087	100	105,67	0,9463	0,186
6,260	200	214,20	0,9337	0,372
9,463	300	323,83	0,9264	0,558
12,684	400	434,07	0,9215	0,744
15,916	500	544,66	0,9180	0,930
19,147	600	655,24	0,9157	1,116
22,380	700	765,86	0,9140	1,302

Pracovní postup. Připraví se požadované porovnávací roztoky, jak je uvedeno v tab. 2.2.35-1. Nastaví se nulová hodnota přístroje na vodu R. Pak se provede kalibrace přístroje pomocí porovnávacích roztoků. Do měřicí kyvety se dá 50 μl až 250 μl vzorku a zapne se chladicí systém. Přístroj má obvykle míchací systém naprogramovaný tak, aby pracoval při nižší teplotě, než je teplota očekávaná v průběhu kryoskopického snížení, aby nenastalo přechlazení. Vhodným zařízením se indikuje dosažení rovnováhy. Před každým měřením se nádobka vypláchne roztokem, který se pak měří.
Stejným způsobem se postupuje se zkoušenými vzorky. Osmolalita se odečte přímo na přístroji nebo se vypočítá ze snížení teploty tuhnutí. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že nalezená hodnota leží v intervalu daném kalibrační křivkou.

2.2.36 Potenciometrické stanovení koncentrace iontů pomocí iontově selektivních elektrod
Za ideálních podmínek závisí potenciál E iontové selektivní elektrody lineárně na logaritmu aktivity a_i příslušného iontu, což vyjadřuje Nernstova rovnice:
$E=E_0+2,303\frac{\mathrm{RT}}{z_{i}F}{\mathrm{loga}}_i,$
v níž značí:
E₀ - standardní elektrodový potenciál,
R - univerzální plynovou konstantu,
T - absolutní teplotu,
F - Faradayovu konstantu,
z₁ - náboj příslušného iontu včetně znaménka.
Při konstantní iontové síle platí vztah:
$E=E_0+\frac{k}{z_i}\log {\mathrm{fC}}_i,$
v němž značí:
C_i - molární koncentraci příslušného iontu,
f - aktivitní koeficient (a_i = fC_i),
$k=\frac{\mathrm{RT}}{F}.$
Tab. 2.2.36-1 Hodnoty k při různých teplotách

Teplota (°C)	k
20	0,0582
25	0,0592
30	0,0602

Jestliže označíme $E_0+\frac{k}{z_i}\log f=E_0^{\text{'}}aS=\frac{k}{z_i},$
kde S je směrnice lineární části kalibrační křivky této elektrody, pak platí následující rovnice:
$E=E_0^{\text{'}}+S\log C_i$.
Je-li $-\log C_i={\mathrm{pC}}_i$, pak lze psát: $E=E_0^{ˊ}-{\mathrm{SpC}}_i$.
Potenciometrické stanovení koncentrace příslušného iontu se provádí měřením potenciálního rozdílu mezi dvěma vhodnými elektrodami ponořenými do zkoušeného roztoku. Indikační elektroda je selektivní pro iont, který má být stanoven, druhá elektroda je referenční.
Zařízení. Použije se voltmetr umožňující měření s přesností na 0,1 milivoltů (mV), jehož vstupní impedance je alespoň stokrát větší než impedance použitých elektrod.
Iontově selektivní elektrody mohou být elektrody s krystalickou či nekrystalickou membránou nebo s vhodnou tuhou matricí (např. skleněné elektrody) nebo elektrody s nabitými (pozitivně či negativně) či nenabitými pohyblivými nosiči náboje či tzv. senzitivované elektrody (enzym-substrát elektrody, plynové indikační elektrody). Srovnávací elektrodou je zpravidla argentchloridová nebo kalomelová elektroda, případně se solným můstkem naplněným vhodným neinterferujícím roztokem.
Postup měření. Měření se provádí při konstantní teplotě ±0,5 °C, přičemž se bere v úvahu změna směrnice části kalibrační křivky elektrody s teplotou (viz tab. 2.2.36-1). Upraví se iontová síla a případně i pH roztoku, který má být analyzován použitím tlumivých roztoků popsaných v článku, a elektroda se uvede do rovnovážného stavu ponořením do analyzovaného roztoku za pomalého a rovnoměrného míchání, dokud se měřená hodnota neustálí.
Je-li elektrodový systém často používán, kontroluje se pravidelně opakovatelnost a stabilita odezvy a linearita kalibrační křivky či výpočtový algoritmus v koncentračním rozmezí zkoušeného roztoku. Není-li systém používán často, provede se tato zkouška před každou sérií měření. Odezva elektrody může být považována za lineární, pokud je směrnice S kalibrační křivky přibližně rovna k/z_i na jednotku pC_i.
Metoda I - Přímá kalibrace
Změří se alespoň třikrát za sebou potenciál nejméně tří porovnávacích roztoků pokrývajících očekávanou koncentraci ve zkoušeném roztoku. Vypočte se kalibrační křivka nebo se vynese do grafu střední hodnota získaného potenciálu E proti koncentraci stanovovaného iontu vyjádřené jako -log C_i nebo pC_i.
Připraví se zkoušený roztok, jak je předepsáno v článku. Změří se třikrát příslušný potenciál a z jeho průměrné hodnoty se určí pomocí kalibrační křivky koncentrace stanovovaného iontu.
Metoda II - Vícenásobný standardní přídavek
Připraví se zkoušený roztok, jak je předepsáno v článku. Změří se rovnovážný potenciál E_T tohoto roztoku o objemu V_T, který obsahuje neznámou koncentraci _TC stanovovaného iontu. Provedou se alespoň tři následné přídavky porovnávacího roztoku o koncentraci C_s, která leží uvnitř lineární části kalibrační křivky, a o objemu V_s, který je zanedbatelný ve srovnání s V_T (V_s ≤ 0,01 V_T). Po každém přídavku se změří potenciál a vypočítá se potenciální rozdíl ΔE mezi tímto změřeným potenciálem a E_T.
Mezi ΔE a koncentrací stanovovaného iontu platí vztah:
$\mathrm{\Delta E}=\text{S log}1+\frac{C_s{V}_s}{C_T{V}_T}$
nebo
${10}^{\frac{\mathrm{\Delta E}}{S}}=1+\frac{C_s{V}_s}{C_T{V}_T},$
v němž značí:
V_T - objem zkoušeného roztoku,
C_T - koncentraci stanovovaného iontu ve zkoušeném roztoku,
V_s - přidaný objem porovnávacího roztoku,
C_s - koncentraci stanovovaného iontu v porovnávacím roztoku,
S - směrnici kalibrační křivky elektrody. Směrnice se stanovuje experimentálně při konstantní teplotě měřením rozdílu mezi potenciály získanými pomocí dvou porovnávacích roztoků, jejichž koncentrace se liší desetkrát a leží v oblasti, kde je kalibrační křivka lineární.
Vynese se do grafu závislost ${10}^{\frac{\Delta E}{S}}$(osa pořadnic - y) proti V_s(osa úseček - x) a extrapoluje se získaná závislost (přímka), aby protnula osu x. V tomto průsečíku je koncentrace C_T stanovovaného iontu ve zkoušeném roztoku dána rovnicí:
$C_T=\frac{C_s{V}_s}{V_T}.$
Metoda III - Jeden standardní přídavek
K objemu V_T zkoušeného roztoku připraveného tak, jak je předepsáno v článku, se přidá objem V_s porovnávacího roztoku obsahujícího takové množství stanovovaného iontu, o němž je známo, že poskytuje odezvu v lineární části kalibrační křivky. Za stejných podmínek se připraví slepá zkouška. Změří se alespoň třikrát potenciály zkoušeného roztoku a slepé zkoušky před a po přidání porovnávacího roztoku. Vypočte se koncentrace C_Tstanovovaného iontu pomocí následující rovnice a provede se nezbytná korekce na slepou zkoušku:
$C_T=\frac{C_s{V}_s}{{10}^{\frac{\mathrm{\Delta E}}{S}}{V}_T+V_s-V_T},$
v níž značí:
V_T - objem zkoušeného roztoku nebo slepé zkoušky,
C_T - koncentraci stanovovaného iontu ve zkoušeném roztoku,
V_s - přidaný objem porovnávacího roztoku,
C_s - koncentraci stanovovaného iontu v porovnávacím roztoku,
ΔE - rozdíl mezi průměrnými hodnotami potenciálů měřenými před a po přidání V_s,
S - směrnici kalibrační křivky elektrody stanovenou experimentálně při konstantní teplotě proměřením rozdílu mezi potenciály získanými pomocí dvou porovnávacích roztoků, jejichž koncentrace se liší desetkrát a které jsou v koncentračním rozmezí, v němž je kalibrační závislost lineární.

2.2.37 Rentgenová fluorescenční spektrometrie³)
Rentgenová (vlnově disperzní) fluorescenční spektrometrie je metoda, která používá měření intenzity fluorescenčního záření emitovaného prvky s atomovým číslem mezi 11 a 92 excitovanými primárním rentgenovým zářením. Intenzita fluorescence emitovaná daným prvkem závisí na koncentraci tohoto prvku ve vzorku a také na absorpci dopadajícího a fluorescenčního záření matricí vzorku. Při stopových koncentracích, kde je kalibrační křivka lineární, intenzita fluorescenčního záření emitovaného prvkem v dané matrici při dané vlnové délce je úměrná koncentraci tohoto prvku a nepřímo úměrná hmotnostnímu absorpčnímu koeficientu matrice při této vlnové délce.
Postup stanovení. Seřízení a použití přístroje se provádí podle pokynů uvedených výrobcem. Tekuté vzorky se umístí přímo do přístroje, pevné vzorky se nejprve slisují do tablet, někdy po smíchání s vhodným pojivem.
Ke stanovení koncentrace prvku ve vzorku je nezbytné změřit četnost impulzů (po odečtení pozadí), produkovaných jednou nebo několika standardními látkami obsahujícími známá množství tohoto prvku v dané matrici, a vypočítat nebo změřit hmotnostní absorpční koeficient matrice analyzovaného vzorku.
Kalibrace. Z kalibračního roztoku nebo řady naředěných roztoků analyzovaného prvku v různých matricích se stanoví směrnice kalibrační křivky b₀ z následujícího vztahu:
$b_0\frac{1}{{\mu }_M}=\frac{I_C^N}{C},$
v němž značí:
μ_M - absorpční koeficient matrice M, vypočítaný nebo změřený,
$I_C^N$ - četnost impulzů po odečtení pozadí (dále jen četnost impulzů),
C - koncentrace stanovovaného prvku ve standardní látce.
Hmotnostní absorpční koeficient matrice vzorku. Jestliže je empirický vzorec analyzovaného vzorku známý, vypočítá se jeho hmotnostní absorpční koeficient ze známého prvkového složení a tabelovaných hmotnostních absorpčních koeficientů prvků. Není-li prvkové složení známé, stanoví se hmotnostní absorpční koeficient matrice vzorku změřením intenzity rozptýleného rentgenového záření I_U (Comptonův rozptyl) z následujícího vztahu:
$\frac{1}{{\mu }_{\mathrm{MP}}}=a+{\mathrm{bI}}_U,$
v němž značí:
μ_MP - hmotnostní absorpční koeficient vzorku,
I_U - intenzitu rozptýleného rentgenového záření.
Stanovení četnosti impulzů stanovovaného prvku ve vzorku. Vypočítá se četnost impulzů $I_{\mathrm{EP}}^N$ stanovovaného prvku ze změřené intenzity fluorescenční linie a intenzity linie (linií) pozadí.
Výpočet stopového obsahu. Jestliže koncentrace prvku se nachází v lineární části kalibrační křivky, může být vypočítána s použitím následujícího vztahu:
$C=\frac{I_{\mathrm{EP}}^N}{b_0\frac{1}{{\mu }_{\mathrm{MP}}}}·f,$
v němž značí:
f - faktor zředění.

2.2.38 Měrná elektrická vodivost
Měrná elektrická vodivost (konduktivita), dále jen měrná vodivost roztoku (к), je definována jako převrácená hodnota měrného odporu (rezistivity) (ρ), který je definován jako podíl intenzity elektrického pole a proudové hustoty. Elektrický odpor (rezistance) R (Ω) vodiče o průřezu S (cm²) a délce l (cm) je vyjádřen vztahem:
$R=\rho \frac{l}{S}\mathrm{nebo}R=\frac{1}{\kappa }·\frac{l}{S},\mathrm{kde}\kappa =\frac{1}{R}·\frac{l}{S}.$
Mezinárodní jednotkou (SI) měrné vodivosti je siemens na metr (S.m^-1); obvykle se měrná vodivost roztoku vyjadřuje v S.cm^-1, mS.cm^-1 nebo μS.cm^-1. Jednotkou měrného odporu je Ω.m, obvykle se užívá Ω.cm. Pokud není uvedeno jinak, je referenční teplota pro měření měrné vodivosti a měrného odporu 20 °C.
Zařízení. Používaný přístroj (konduktometr nebo přístroj na měření odporu - ohmmetr) měří odpor kapaliny mezi elektrodami vodivostní sondy ponořené do měřené kapaliny. Přístroj je vybaven zařízením na kompenzaci teploty nebo přesným teploměrem. Aby nedocházelo k polarizaci elektrod vodivostní sondy, používá se při měření měrné vodivosti kapalin střídavý elektrický proud.
Vodivostní sonda je tvořena dvěma paralelními platinovými elektrodami vzdálenými od sebe l a pokrytými platinovou černí, z nichž každá má plochu povrchu S. Elektrody jsou chráněny skleněnou trubicí, která umožňuje dobrou výměnu mezi roztokem a elektrodami.
Konstanta vodivostní sondy (K) je dána v cm^-1 podle následujícího vzorce:
$K=\alpha \frac{l}{S},$
v němž značí:
α - bezrozměrný číselný koeficient charakteristický pro konstrukci vodivostní sondy.
Zkoumadla. Připraví se tři standardní roztoky chloridu draselného R obsahující 0,7455 g, 0,0764 g a 0,0149 g chloridu draselného R na 1000 g roztoku s použitím vody prosté oxidu uhličitého R připravené z vody destilované R, jejíž měrný odpor nepřesahuje 2 μS.cm^-1.
Měrný odpor a měrná vodivost těchto tří roztoků při 20 °C je uvedena v tabulce 2.2.38-1.
Tab. 2.2.38-1 Měrný odpor a měrná vodivost standardních roztoků chloridu draselného při 20 °C

Koncentrace v g/1000,0 g roztoku	Měrná vodivost μS.cm-1	Měrný odpor Ω.cm
0,7455	1330	752
0,0746	133,0	7519
0,0149	26,6	37594

Pokud stanovení nemůže být provedeno při 20 °C, použije se ke korekci měrné elektrické vodivosti roztoků chloridu draselného uvedených v předcházející tabulce následující vzorec, který je platný pouze pro teploty v rozsahu (20 ± 5) °C:
${\kappa }_T={\kappa }_{20}1+0,021T-20,$
v němž značí:
T - teplotu měření předepsanou v článku,
κ_T - měrnou vodivost roztoku KC1 při teplotě T,
κ₂₀ - měrnou vodivost roztoku KC1 při 20 °C.
Stanovení konstanty vodivostní sondy
Vybere se vodivostní sonda, která je vhodná pro měření měrné vodivosti zkoušeného roztoku. Čím je vyšší očekávaná hodnota měrné vodivosti, tím je třeba použít vodivostní sondy o vyšší konstantě (nízké ρ), aby změřená hodnota R byla co největší pro použitý přístroj. Běžně používané vodivostní sondy mají konstanty řádově 0,1 cm^-1, 1 cm^-1 a 10 cm^-1. Použije se standardní roztok chloridu draselného R, který je vhodný pro měření. Sonda se opláchne několikrát vodou prostou oxidu uhličitého R, která byla připravena z vody destilované R, a nejméně dvakrát standardním roztokem chloridu draselného použitým ke stanovení konstanty vodivostní sondy. Změří se elektrická vodivost (konduktance) nebo elektrický odpor (rezistance) vodivostní sondy při (20 ± 0,1) °C nebo při teplotě předepsané v článku. Konstanta K (v cm^-1) je dána vztahem:
$K=\frac{{\kappa }_{\mathrm{KC}1}}{G_{\mathrm{KC}1}}\mathrm{nebo}K=R_{\mathrm{KCl}}·{\kappa }_{\mathrm{KC}1},$
v nichž značí:
K_KCl - tabulkovou měrnou vodivost použitého standardního roztoku chloridu draselného R (μS.cm^-1)
G_KCl - elektrickou vodivost použitého standardního roztoku chloridu draselného R změřenou za stejných podmínek jako u zkoušeného vzorku (μS),
R_KCl - odpor standardního roztoku chloridu draselného R (MΩ).
Změřená konstanta K vodivostní sondy se může lišit o 5 % od dané hodnoty.
Poznámka: K některým konduktometrům je dodávána pouze jedna vodivostní sonda. Její konstanta (K) se stanoví za použití standardního roztoku chloridu draselného R, který je vhodný pro vlastní měření.
Stanovení měrné vodivostí vody nebo zkoušeného roztoku
Po kalibraci přístroje jedním ze standardních roztoků se opláchne vodivostní sonda několikrát vodou prostou oxidu uhličitého R připravenou z vody destilované R a nejméně dvakrát zkoušenou vodou nebo zkoušeným roztokem při (20 ± 0,1) °C nebo při teplotě předepsané v článku. Provedou se postupná měření, jak je předepsáno v článku.

2.2.39 Stanovení distribuce molekulových hmotností v dextranu
Distribuce (zastoupení) jednotlivých molekulových hmotností v dextranu se stanoví metodou vylučovací chromatografie (2.2.30).
Zkoušený roztok. 0,200 g zkoušené látky se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 10 ml.
Značkovací roztok. 5 mg glukosy R a 2 mg dextranu V₀ CRL se rozpustí v 1 ml mobilní fáze.
Kalibrační roztoky. Odděleně se rozpustí vždy v 1 ml mobilní fáze 15 mg kalibračního dextranu 4 CRL, 15 mg kalibračního dextranu 10 CRL, 20 mg kalibračního dextranu 40 CRL, 20 mg kalibračního dextranu 70 CRL a 20 mg kalibračního dextranu 250 CRL.
Roztok pro test způsobilosti systému. Rozpustí se buď 20 mg testovacího dextranu 40 CRL (pro dextran 40), nebo 20 mg testovacího dextranu 60/70 CRL (pro dextran 60 a dextran 70) v 1 ml mobilní fáze.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- kolony délky 0,3 m a vnitřního průměru 10 mm, naplněné agarosou síťovanou pro chromatografii R, nebo do série spojených kolon délky 0,3 m a vnitřního průměru 10 mm naplněných gelem hydroxylovaného polyetheru pro chromatografii R,
- mobilní fáze připravené ze 7 g síranu sodného bezvodého R a 1 g chlorbutanolu R v 1 l vody R při průtokové rychlosti 0,5 ml/min až 1,0 ml/min udržované v konstantním rozmezí ±1 %/h,
- diferenčního refraktometru jako detektoru,
- dávkovacího zařízení se smyčkou 100 μl až 200 μl.
Teplota systému se udržuje konstantní (±0,1 °C).
Kalibrace chromatografického systému. Nastříkne se opakovaně zvolený objem značkovacího roztoku. Chromatogram ukáže dva píky, z nichž první odpovídá dextranu V₀ CRL a druhý glukose R. Z elučního objemu píku dextranu V₀ se počítá volný objem V₀ a z elučního objemu píku glukosy se spočítá celkový objem V_i.
Nastříkne se zvolený objem každého z kalibračních roztoků. Zakreslí se pečlivě základní linie všech chromatogramů. Každý chromatogram se rozdělí na ρ (nejméně šedesát) stejně velkých vertikálních úseků (odpovídajících stejným elučním objemům). V každém úseku i odpovídajícím elučnímu objemu V_i se změří výška linie chromatogramu y nad základní linií a vypočítá se distribuční koeficient K_i za použití výrazu:
$\frac{V_i-V_0}{V_t-V_0},\text{(1)}$
v němž značí:
V₀ - volný objem kolony stanovený pomocí píku dextranu V₀ CRL na chromatogramu značkovacího roztoku,
V_t - celkový objem kolony stanovený pomocí píku glukosy R na chromatogramů značkovacího roztoku,
V_i - eluční objem úseku i na chromatogramu jednotlivých kalibračních roztoků.
Provede se kalibrace za použití některé z následujících metod.
Kalibrace grafická. S použitím výrazu (1) se vypočítá pro každý kalibrační dextran CRL distribuční koeficient K_max odpovídající maximální výšce linie chromatogramů. Hodnoty se vynesou do grafu na semilogaritmický papír (na osu x) proti deklarované molekulové hmotnosti odpovídající maximální výšce linie chromatogramu (M_max) každého z kalibračních dextranů a glukosy. Získanými body se proloží první kalibrační křivka, přičemž se extrapoluje z bodu K_max vypočítaného pro kalibrační dextran 250 CRL k nejnižší vypočítané hodnotě K získané pro tento CRL (viz obr. 2.2.39-1). S využitím této první kalibrační křivky se pro každý chromatogram transformují všechny hodnoty K_i na odpovídající molekulové hmotnosti M_i, čímž se získá distribuce molekulových hmotností. Pro každý kalibrační dextran se pomocí rovnice (3) uvedené níže vypočítá průměrná molekulová hmotnost M_w Jestliže se vypočítané hodnoty M_w neliší o více než 5 % od hodnot deklarovaných pro každý kalibrační dextran a průměrný rozdíl je v rozmezí ±3 %, kalibrační křivka může být použita pro stanovení distribuce molekulových hmotností. V opačném případě se výše popsaný postup opakuje, až se vypočítané a deklarované hodnoty M_w neliší o více než 5 %.
Kalibrace výpočtem křivky. Z rovnic (2) a (3) uvedených níže se použitím vhodné metody⁴) vypočítají hodnoty pro b₁, b₂, b₃, b₄ a b₅ tak, aby se hodnoty M_w pro kalibrační dextrany lišily nejvýše o 5 % od hodnot deklarovaných a M_w glukosy činila 180 ± 2:
$M_i=b_5+e^{b_4+b_1{K}_i+b_2{K}_i^2+b_3{K}_i^3}\text{(2)}$
${\stackrel{-}{M}}_W=\frac{\sum _{i=1}^p{y}_i{M}_i}{\sum _{i=1}^p{y}_i},3$
kde značí:
p - počet úseků dělících chromatogramy,
y_i - výšku chromatografické linie nad základní linií v úseku i,
M_i - molekulovou hmotnost v úseku i.
Zkouška způsobilosti systému. Nastříkne se zvolený objem roztoku pro zkoušku způsobilosti systému.
Průměrná molekulová hmotnost testovacího dextranů CRL. Vypočítá se průměrná molekulová hmotnost M_w způsobem popsaným v odstavci "Kalibrace chromatografického systému" za použití buď kalibrační křivky, nebo hodnot b₁, b₂, b₃, b₄ a b₅, získaných výše uvedeným způsobem. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že M_w je:
- 41 000 až 47 000 (testovací dextran 40 CRL),
- 67 000 až 75 000 (testovací dextran 60/70 CRL).

Obr. 2.2.39-1 Příklad kalibrační křivky
Tečkovaná čára odpovídá extrapolované části křivky. Vodorovné přímky ve spodní části obrázku znázorňují šířku a polohu chromatografické linie každého z kalibračních dextranů.
Průměrná molekulová hmotnost 10% vysoké frakce dextranu. Pro 10% vysokou frakci dextranů eluovanou v úseku chromatogramu n se vypočítá M_w podle vzorce:
${\stackrel{-}{M}}_W=\frac{\sum _{i=1}^n{y}_i{M}_i}{\sum _{i=1}^n{y}_i},4$
kde n je dáno výrazy:
$\sum _{i=1}^n{y}_i\le 0,1\sum _{i=1}^p{y}_{i}5$
$\sum _{i=1}^{n+1}{y}_i\ge 0,1\sum _{i=1}^p{y}_i,6$
v nichž značí:
p - počet úseků dělících chromatogram,
y_i - výšku linie chromatogramu nad základní linií v úseku i,
M_i - molekulovou hmotnost v úseku i.
Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že M_w je:
- 110 000 až 130 000 (testovací dextran 40 CRL),
- 190 000 až 230 000 (testovací dextran 60/70 CRL).
Průměrná molekulová hmotnost 10% nízké frakce dextranu. Pro 10% nízkou frakci dextranu eluovanou v úseku m a před ním se vypočítá M_w podle vzorce:
$M_W=\frac{\sum _{i=m}^p{y}_i{M}_i}{\sum _{i=m}^p{y}_i},7$
kde m je dáno výrazy:
$\sum _{i=m}^p{y}_i\le 0,1\sum _{i=1}^p{y}_{i}8$
$\sum _{i=m-1}^p{y}_i>0,1\sum _{i=1}^p{y}_i,9$
v nichž značí:
p - počet úseků dělících chromatogramy,
y_i - výšku linie chromatogramu nad základní linií v úseku i,
M_i - molekulovou hmotnost v úseku i.
Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že M_w 10% nízké frakce dextranu je:
- 6000 až 8500 (testovací dextran 40 CRL),
- 7000 až 11 000 (testovací dextran 60/70 CRL).
Distribuce molekulových hmotností zkoušeného dextranu. Nastříkne se zvolený objem zkoušeného roztoku a vypočítají se M_w pro celkovou distribuci molekulových hmotností, M_w pro 10% vysokou frakci dextranu a M_w pro 10% nízkou frakci dextranu způsobem popsaným v odstavci "Zkouška způsobilosti systému".

2.2.40 Spektrometrie v blízké infračervené oblasti
Spektrometrie v blízké infračervené oblasti je metoda, která se uplatňuje zejména při identifikaci organických látek. Přestože jsou spektra omezena na pásy kombinačních vibrací a overtonů fundamentálních vibrací C-H, N-H, O-H a S-H, mají obvykle vysokou informační hodnotu. Spektra však jsou závislá na mnoha parametrech, jako jsou velikost částic, polymorfismus, zbytková rozpouštědla, vlhkost ap., které nemohou být vždy kontrolovány. Proto není obvykle možné přímo porovnat spektrum zkoušené látky s referenčním spektrem a je nutno provést vhodné, validované matematické zpracování naměřených dat.
Přístroje. Spektrometry pro měření spekter v blízké infračervené oblasti mají tyto části:
- filtr, mřížku nebo interferometr vhodné pro měření v oblasti elektromagnetického záření přibližně 780 nm až 2500 nm (12821 cm^-1 až 4000 cm^-1),
- zařízení na sběr a měření intenzity prošlého nebo odraženého záření (transmise nebo reflexe), jako jsou integrační koule, sonda s optickým vláknem ap., ve spojení s vhodným detektorem,
- prostředky pro matematické zpracování naměřených spektrálních dat.
Příprava vzorku
Pro transmisní měření. Tato metoda se používá převážně pro měření kapalin, zředěných nebo nezředěných, a pro roztoky pevných látek.
Vzorky se měří buď v kyvetě vhodné tloušťky (obvykle 0,5 mm až 4 mm) propustné v blízké infračervené oblasti, nebo po ponoření vhodné sondy s optickým vláknem, která umožňuje změření spektra v oblasti odpovídající specifikacím přístroje.
Při měření spekter kapalin v blízké infračervené oblasti je třeba brát v úvahu vliv teploty a ostatní možné fyzikální vlivy vyvolávající změny ve spektrech.
Ve všech případech je třeba provést kompenzaci rušivých vlivů pozadí způsobem, který odpovídá optickému uspořádání přístroje, např. se odečte referenční spektrum vzduchu (u kapalin) nebo rozpouštědla (u roztoků) od spektra zkoušené látky.
Pro měření difuzním odrazem. Tato metoda se používá převážně pro měření pevných látek.
Vzorky se měří ve vhodném zařízení. Při měřeních s optickou sondou je nutno zajistit konstantní polohu sondy během měření spekter a maximální možnou reprodukovatelnost podmínek měření pro jednotlivé vzorky.
Ve všech případech je třeba provést kompenzaci rušivých vlivů pozadí způsobem, který odpovídá optickému uspořádání přístroje, např. je třeba odečíst referenční spektrum vnitřního nebo vnějšího reflexního standardu od spektra zkoušené látky.
Rovněž je nutno věnovat pozornost vlivu velikosti částic, dále stavu hydratace nebo solvatace.
Pro měření transflektance. Používá se převážně pro měření kapalin, zředěných nebo nezředěných, a pro pevné látky v roztoku nebo v suspenzi.
Vzorek se měří v kyvetě, do které se ve vhodné koncentraci vpraví inertní látky neabsorbující v blízké infračervené oblasti (např. kovové částice nebo oxid titaničitý). Měření se provádí způsobem popsaným v odstavcích "Pro transmisní měření" a "Pro měření difuzním odrazem".
Kontrola správné funkce přístroje
Přístroj nutno používat podle pokynů výrobce a v pravidelných intervalech provádět předepsaná ověřování.
Ověření stupnice vlnových délek (neprovádí se u přístrojů s filtrem). Pro ověření použité stupnice vlnových délek (obvykle v rozsahu 780 nm až 2500 nm) se použije vhodný standard (nebo několik standardů), který má charakteristická maxima v oblasti vlnových délek, v níž se provádí měření, např. polystyren nebo oxidy vzácných zemin.
Ověření reprodukovatelnosti měření vlnových délek (neprovádí se u přístrojů s filtrem). Pro ověření reprodukovatelnosti vlnových délek se použije vhodný standard (nebo několik standardů), např. polystyren nebo oxidy vzácných zemin. Směrodatná odchylka vlnových délek odpovídá specifikaci přístroje.
Ověření opakovatelností odezvy detektoru. Pro ověření opakovatelnosti odezvy detektoru se použije vhodný standard (nebo několik standardů), např. reflexní termoplastické pryskyřice, k nimž byly přidány saze. Směrodatná odchylka maxima odezvy musí odpovídat specifikaci přístroje.
Ověření fotometrického šumu. Pro měření šumu se použije vhodný reflexní standard, např. bílá keramická destička nebo termoplastické pryskyřice. Změří se v rozsahu spektra 100% linie tohoto standardu dle návodu výrobce a vypočte se šum buď jako mezivrcholová hodnota signálu, nebo jako směrodatná odchylka odezev pro danou vlnovou délku. Hodnota šumu musí odpovídat specifikaci přístroje.
Vytvoření knihovny referenčních spektrálních dat
Zaznamenají se spektra vhodného počtu šarží substance ověřených způsobem předepsaným v článku a vykazujících změny typické pro zkoušenou látku (např. výrobce, velikost částic ap.). Sada spekter představuje informaci, která definuje hranici podobnosti pro danou látku a je vstupním údajem do spektrální databáze používané pro identifikaci této látky. Počet látek v databázi závisí na dané aplikaci.
Soubor spekter uložených v databázi může mít různou formu v závislosti na matematickém zpracování použitém při identifikaci spektra. Mohou to být:
- jednotlivá spektra reprezentující substanci,
- průměrná spektra každé substance s popisem variability.
Během validačního procesuje nutno ověřit schopnost databáze selektivně identifikovat danou látku, a naopak vyloučit ostatní látky v databázi. Tato selektivita musí být pravidelně ověřována, aby bylo zajištěno trvání platnosti databáze; to je obzvláště důležité v případech, kdy dojde k nějakým větším změnám, např. ke změně dodavatele nebo výrobního procesu zkoušené látky.
Databáze je pak platná pouze pro měření na přístroji, na kterém byla vytvořena, a použije-li se pro měření na jiném přístroji, je nutno ověřit, zda přenesená databáze zůstává platná.
Postup stanovení. Vzorek zkoušené látky se připraví stejným způsobem jako pro vytvoření databáze. Spektrum vzorku i referenční spektra změřená v log (1/T) nebo log (1/R) je někdy výhodnější porovnávat po matematické úpravě, např. lze použít druhou derivaci spekter nebo korekci na násobný rozptyl.
Porovnání takovýchto spekter a knihovny referenčních spekter vyžaduje užití vhodné chemometrické klasifikační techniky.