2.2.39 Stanovení distribuce molekulových hmotností v dextranu
Distribuce (zastoupení) jednotlivých molekulových hmotností v dextranu se stanoví metodou vylučovací chromatografie (2.2.30).
Zkoušený roztok. 0,200 g zkoušené látky se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 10 ml.
Značkovací roztok. 5 mg glukosy R a 2 mg dextranu V₀ CRL se rozpustí v 1 ml mobilní fáze.
Kalibrační roztoky. Odděleně se rozpustí vždy v 1 ml mobilní fáze 15 mg kalibračního dextranu 4 CRL, 15 mg kalibračního dextranu 10 CRL, 20 mg kalibračního dextranu 40 CRL, 20 mg kalibračního dextranu 70 CRL a 20 mg kalibračního dextranu 250 CRL.
Roztok pro test způsobilosti systému. Rozpustí se buď 20 mg testovacího dextranu 40 CRL (pro dextran 40), nebo 20 mg testovacího dextranu 60/70 CRL (pro dextran 60 a dextran 70) v 1 ml mobilní fáze.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- kolony délky 0,3 m a vnitřního průměru 10 mm, naplněné agarosou síťovanou pro chromatografii R, nebo do série spojených kolon délky 0,3 m a vnitřního průměru 10 mm naplněných gelem hydroxylovaného polyetheru pro chromatografii R,
- mobilní fáze připravené ze 7 g síranu sodného bezvodého R a 1 g chlorbutanolu R v 1 l vody R při průtokové rychlosti 0,5 ml/min až 1,0 ml/min udržované v konstantním rozmezí ±1 %/h,
- diferenčního refraktometru jako detektoru,
- dávkovacího zařízení se smyčkou 100 μl až 200 μl.
Teplota systému se udržuje konstantní (±0,1 °C).
Kalibrace chromatografického systému. Nastříkne se opakovaně zvolený objem značkovacího roztoku. Chromatogram ukáže dva píky, z nichž první odpovídá dextranu V₀ CRL a druhý glukose R. Z elučního objemu píku dextranu V₀ se počítá volný objem V₀ a z elučního objemu píku glukosy se spočítá celkový objem V_i.
Nastříkne se zvolený objem každého z kalibračních roztoků. Zakreslí se pečlivě základní linie všech chromatogramů. Každý chromatogram se rozdělí na ρ (nejméně šedesát) stejně velkých vertikálních úseků (odpovídajících stejným elučním objemům). V každém úseku i odpovídajícím elučnímu objemu V_i se změří výška linie chromatogramu y nad základní linií a vypočítá se distribuční koeficient K_i za použití výrazu:
$\frac{V_i-V_0}{V_t-V_0},\text{(1)}$
v němž značí:
V₀ - volný objem kolony stanovený pomocí píku dextranu V₀ CRL na chromatogramu značkovacího roztoku,
V_t - celkový objem kolony stanovený pomocí píku glukosy R na chromatogramů značkovacího roztoku,
V_i - eluční objem úseku i na chromatogramu jednotlivých kalibračních roztoků.
Provede se kalibrace za použití některé z následujících metod.
Kalibrace grafická. S použitím výrazu (1) se vypočítá pro každý kalibrační dextran CRL distribuční koeficient K_max odpovídající maximální výšce linie chromatogramů. Hodnoty se vynesou do grafu na semilogaritmický papír (na osu x) proti deklarované molekulové hmotnosti odpovídající maximální výšce linie chromatogramu (M_max) každého z kalibračních dextranů a glukosy. Získanými body se proloží první kalibrační křivka, přičemž se extrapoluje z bodu K_max vypočítaného pro kalibrační dextran 250 CRL k nejnižší vypočítané hodnotě K získané pro tento CRL (viz obr. 2.2.39-1). S využitím této první kalibrační křivky se pro každý chromatogram transformují všechny hodnoty K_i na odpovídající molekulové hmotnosti M_i, čímž se získá distribuce molekulových hmotností. Pro každý kalibrační dextran se pomocí rovnice (3) uvedené níže vypočítá průměrná molekulová hmotnost M_w Jestliže se vypočítané hodnoty M_w neliší o více než 5 % od hodnot deklarovaných pro každý kalibrační dextran a průměrný rozdíl je v rozmezí ±3 %, kalibrační křivka může být použita pro stanovení distribuce molekulových hmotností. V opačném případě se výše popsaný postup opakuje, až se vypočítané a deklarované hodnoty M_w neliší o více než 5 %.
Kalibrace výpočtem křivky. Z rovnic (2) a (3) uvedených níže se použitím vhodné metody⁴) vypočítají hodnoty pro b₁, b₂, b₃, b₄ a b₅ tak, aby se hodnoty M_w pro kalibrační dextrany lišily nejvýše o 5 % od hodnot deklarovaných a M_w glukosy činila 180 ± 2:
$M_i=b_5+e^{b_4+b_1{K}_i+b_2{K}_i^2+b_3{K}_i^3}\text{(2)}$
${\stackrel{-}{M}}_W=\frac{\sum _{i=1}^p{y}_i{M}_i}{\sum _{i=1}^p{y}_i},3$
kde značí:
p - počet úseků dělících chromatogramy,
y_i - výšku chromatografické linie nad základní linií v úseku i,
M_i - molekulovou hmotnost v úseku i.
Zkouška způsobilosti systému. Nastříkne se zvolený objem roztoku pro zkoušku způsobilosti systému.
Průměrná molekulová hmotnost testovacího dextranů CRL. Vypočítá se průměrná molekulová hmotnost M_w způsobem popsaným v odstavci "Kalibrace chromatografického systému" za použití buď kalibrační křivky, nebo hodnot b₁, b₂, b₃, b₄ a b₅, získaných výše uvedeným způsobem. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že M_w je:
- 41 000 až 47 000 (testovací dextran 40 CRL),
- 67 000 až 75 000 (testovací dextran 60/70 CRL).

Obr. 2.2.39-1 Příklad kalibrační křivky
Tečkovaná čára odpovídá extrapolované části křivky. Vodorovné přímky ve spodní části obrázku znázorňují šířku a polohu chromatografické linie každého z kalibračních dextranů.
Průměrná molekulová hmotnost 10% vysoké frakce dextranu. Pro 10% vysokou frakci dextranů eluovanou v úseku chromatogramu n se vypočítá M_w podle vzorce:
${\stackrel{-}{M}}_W=\frac{\sum _{i=1}^n{y}_i{M}_i}{\sum _{i=1}^n{y}_i},4$
kde n je dáno výrazy:
$\sum _{i=1}^n{y}_i\le 0,1\sum _{i=1}^p{y}_{i}5$
$\sum _{i=1}^{n+1}{y}_i\ge 0,1\sum _{i=1}^p{y}_i,6$
v nichž značí:
p - počet úseků dělících chromatogram,
y_i - výšku linie chromatogramu nad základní linií v úseku i,
M_i - molekulovou hmotnost v úseku i.
Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že M_w je:
- 110 000 až 130 000 (testovací dextran 40 CRL),
- 190 000 až 230 000 (testovací dextran 60/70 CRL).
Průměrná molekulová hmotnost 10% nízké frakce dextranu. Pro 10% nízkou frakci dextranu eluovanou v úseku m a před ním se vypočítá M_w podle vzorce:
$M_W=\frac{\sum _{i=m}^p{y}_i{M}_i}{\sum _{i=m}^p{y}_i},7$
kde m je dáno výrazy:
$\sum _{i=m}^p{y}_i\le 0,1\sum _{i=1}^p{y}_{i}8$
$\sum _{i=m-1}^p{y}_i>0,1\sum _{i=1}^p{y}_i,9$
v nichž značí:
p - počet úseků dělících chromatogramy,
y_i - výšku linie chromatogramu nad základní linií v úseku i,
M_i - molekulovou hmotnost v úseku i.
Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, že M_w 10% nízké frakce dextranu je:
- 6000 až 8500 (testovací dextran 40 CRL),
- 7000 až 11 000 (testovací dextran 60/70 CRL).
Distribuce molekulových hmotností zkoušeného dextranu. Nastříkne se zvolený objem zkoušeného roztoku a vypočítají se M_w pro celkovou distribuci molekulových hmotností, M_w pro 10% vysokou frakci dextranu a M_w pro 10% nízkou frakci dextranu způsobem popsaným v odstavci "Zkouška způsobilosti systému".