2.2.30 Vylučovací chromatografie
Vylučovací chromatografie (s organickou mobilní fází je známá jako gelová chromatografie a s vodnou mobilní fází se používá název gelová filtrace) je chromatografická technika, která rozděluje molekuly v roztoku podle jejich velikosti. Vzorek je vnesen na kolonu naplněnou gelem nebo náplní s porézními částicemi a je nesen mobilní fází kolonou. K separaci podle velikosti dochází opakovanou výměnou rozpuštěných molekul (rozpuštěné látky) mezi rozpouštědlem v mobilní fázi a týmž rozpouštědlem v nepohyblivé kapalné fázi (stacionární fázi), která je v pórech náplně. Rozmezí velikosti pórů náplně určuje rozmezí velikosti molekul, ve kterém může dojít k separaci.
Molekuly, které jsou tak malé, že mohou pronikat do všech pórů, jsou eluovány s celkovým permeačním objemem (V_t). Molekuly výrazně větší než maximální velikost pórů náplně se pohybují v koloně jen prostory mezi částicemi náplně bez zadržování a jsou eluovány s vylučovacím objemem (V_o). K separaci podle velikosti molekul dochází mezi vylučovacím a celkovým permeačním objemem, přičemž použitelná je obvykle separace v prvních dvou třetinách tohoto rozmezí.
Zařízení. Základem zařízení je chromatografická kolona vhodných rozměrů, v případě potřeby termostatovaná, naplněná separačním materiálem schopným dělení ve vhodném rozsahu velikosti molekul, kterou protéká konstantní rychlostí eluent. Jeden konec kolony je obvykle připojen ke vhodnému zařízení pro nástřik vzorku, jako je adaptér průtoku, septový dávkovač nebo nastřikovací ventil, a může být také připojen ke vhodnému čerpadlu pro kontrolu průtoku eluentu. Případně může být vzorek nastřikován přímo na vstup kolony (povrch náplně kolony zbavený kapaliny), nebo je-li vzorek hustší než eluent, může být převrstven eluentem. Výstup z kolony je obvykle připojen k vhodnému detektoru spojenému s automatickým zapisovačem, který umožňuje záznam relativních koncentrací separovaných složek vzorku. Detektory jsou většinou založeny na fotometrických, refraktometrických nebo luminiscenčních vlastnostech. V případě potřeby může být připojen automatický sběrač frakcí.
Náplní může být měkký nosič, jako je nabobtnalý gel, nebo tuhý nosič tvořený sklem, silikagelem nebo zesíťovaným organickým polymerem kompatibilním s rozpouštědlem. Tuhé nosiče obvykle vyžadují tlakovaný systém umožňující rychlejší separace. Mobilní fáze je volena podle typu vzorku, separačního prostředí a způsobu detekce.
Před provedením separace by měla být náplň upravena a naplněna do kolony tak, jak je popsáno v článku nebo podle návodu výrobce.
V případě potřeby jsou v článcích uvedeny postupy pro ověření způsobilosti systému. Účinnost kolony může být vyhodnocena z počtu teoretických pater (n), vypočteného ze vzorce:
$\text{5,54}{\frac{V_r}{b_{0,5}}}^2,$
v němž značí:
V_r - retenční objem v maximu píku,
b_0,5 - šířku píku v polovině jeho výšky vyjádřenou ve stejných jednotkách jako retenční objem.
Stanovení distribučního koeficientu K_D
Eluční charakteristika látky na určité koloně může být dána distribučním koeficientem, K_D, který se vypočte ze vzorce:
$\frac{V_r-V_0}{V_t-V_0}.$
Stanovení se provede měřením retenčních objemů nezadržované složky (V₀), jiné složky, která může pronikat do všech pórů nosiče, (V_t), a látky, jejíž rozdělovači koeficient je stanovován, ( V_r). Retenční objem se měří od nástřiku do maxima píku.
Stanovení poměrného složení směsi
Provede se separace podle článku. Je-li to možné, průběžně se zaznamenává eluce složek a měří se odpovídající plochy píků. Je-li zaznamenávána fyzikálně-chemická vlastnost a mají-li všechny stanovované složky vzorku stejnou odezvu (např. mají-li stejnou specifickou absorbanci), spočítá se relativní množství každé složky jako podíl příslušné plochy píku a součtu ploch píků všech stanovovaných složek. Nejsou-li detekční odezvy stanovovaných složek stejné, spočítá se obsah pomocí kalibračních křivek získaných s použitím kalibračních referenčních látek předepsaných v článku.
Stanovení molekulových hmotností
Vylučovací chromatografii lze použít pro stanovení molekulových hmotností po srovnání s vhodnými kalibračními referenčními látkami, specifikovanými v článku.
Do grafu se vynese závislost retenčních objemů kalibračních referenčních látek na logaritmu jejich molekulových hmotností. Křivka se obvykle blíží přímce mezi vylučovací mezí a mezí úplné permeace pro použité separační prostředí. Z kalibrační křivky se stanoví molekulové hmotnosti. Kalibrace pro molekulové hmotnosti je platná jen pro určitý makromolekulární systém látka/rozpouštědlo za daných experimentálních podmínek.
Stanovení distribuce velikosti molekul polymerů
Vylučovací chromatografii lze použít pro stanovení distribuce velikosti molekul polymerů. Avšak porovnání vzorků je možné jen s výsledky získanými za stejných experimentálních podmínek. Látky použité pro kalibraci a metody stanovení distribuce velikosti molekul polymerů jsou uvedeny v článku.