B.39. TEST NEPLÁNOVANÉ SYNTÉZY DNA V SAVČÍCH JATERNÍCH BUŇKÁCH IN VIVO

1. METODA
Metoda je replikací OECD TG 486, Unscheduled DNA Synthesis (UDS) Test with Mammalian Liver Cells In Vivo (1997).

1.1 ÚVOD
Účelem testu neplánované syntézy DNA (unscheduled DNA synthesis, UDS) v savčích jaterních buňkách in vivo je určit látky, vyvolávající reparaci DNA v jaterních buňkách pokusných zvířat (1) (2) (3) (4).
Tento test in vivo představuje metodu pro zjišťování genotoxických účinků chemických látek v játrech. Výsledek testu indikuje poškození DNA v jaterních buňkách a její následnou reparaci. Játra jsou obvykle hlavním místem metabolismu absorbovaných sloučenin; jsou proto vhodným objektem pro detekci poškození DNA in vivo.
Existují-li doklady o tom, že se testovaná látka do cílové tkáně nedostane, není tento test vhodný.
Výsledek neplánované syntézy DNA (UDS) se hodnotí tak, že se stanoví absorpce značených nukleosidů v buňkách, které neprocházejí plánovanou (S-fáze) syntézou DNA. Nejběžnější je metoda, při které se autoradiograficky stanoví thymidin značený tritiem (3H-TdR). Pro testy UDS in vivo se nejčastěji používají potkaní játra. Jiné tkáně než játra se sice také mohou použít, nejsou však předmětem této metody.
Detekce odpovědi závisí na počtu bází DNA, jež jsou v místě poškození odstraněny a nahrazeny. Proto je metoda UDS zvláště vhodná k detekci látek indukujících „longpatch repair“ (20 – 30 bází), zatímco pro látky indukující „shortpatch repair“ (1 – 3 báze) je méně citlivá. Dále může docházet k mutacím v důsledku neopravení, chybného opravení nebo chybné replikace lézí DNA. Rozsah odpovědi UDS neříká nic o přesnosti procesu reparace. Mimoto je možné, že mutagen bude sice s DNA reagovat, ale poškození DNA není opraveno excizním reparačním procesem. To, že UDS test neposkytuje o mutagenní aktivitě specifické informace, je vyváženo jeho potenciální citlivostí, protože poskytuje výsledek v celém genomu.

1.2 DEFINICE
Buňky v reparaci: net nuclear grain (NNG) vyšší než určitá, předem stanovená hodnota, kterou zdůvodní laboratoř provádějící test.
Net nuclear grains (NNG): kvantitativní míra UDS aktivity buněk při autoradiografických testech UDS, vypočtená jako rozdíl mezi počtem zrn v jádře (NG) a průměrným počtem zrn v cytoplasmě (CG): NNG = NG – CG. Počty NNG se vypočítávají pro jednotlivé buňky a následně přepočítány na buňky v kultuře, v paralelních kulturách apod.
Neplánovaná syntéza DNA (unscheduled DNA synthesis, UDS): opravná syntéza DNA po excizi a odstranění úseku DNA obsahujícího oblast poškození vyvolaného chemickou látkou nebo fyzikálním činidlem.

1.3 PRINCIP METODY
Test UDS v savčích jaterních buňkách in vivo indikuje reparační syntézu DNA po excizi a odstranění segmentu DNA obsahujícího oblast poškození vyvolaného chemickou látkou nebo fyzikálním působením. Test vychází obvykle z inkorporace 3H-TdR do DNA jaterních buněk, charakteristických nízkým počtem buněk v S-fázi buněčného cyklu. Inkorporace 3H-TdR se obvykle stanoví autoradiograficky, protože tato technika není tak náchylná k interferenci s buňkami v S-fázi, jako je např. scintilační metoda.

1.4 POPIS METODY

1.4.1 Příprava
Běžně se používají potkani, lze ovšem použít jakýkoliv vhodný savčí druh. Používají se běžné laboratorní kmeny mladých zdravých dospělých jedinců. Hmotnostní rozdíly by při zahájení studie měly být minimální a u každého pohlaví nemají přesahovat ± 20 % průměrné hmotnosti.

1.4.1.1 Výběr živočišného druhu

1.4.2 Podmínky chovu
Všeobecné podmínky chovu jsou uvedeny ve Všeobecném úvodu v části B.
Vlhkost by měla být 50 – 60 %.

1.4.2.1 Příprava zvířat
Zdraví mladí dospělí jedinci se náhodně rozdělí do kontrolní a experimentální skupiny. Jedinci se jednoznačně označí a po dobu minimálně pěti dní se zvířata aklimatizují v laboratorních podmínkách. Klece je třeba uspořádat tak, aby se minimalizovaly případné vlivy toho, jak a kde jsou klece umístěny.

1.4.2.2 Testovaná látka/příprava
Je-li testovaná látka v pevném stavu a je-li to možné, látka se před podáním zvířatům rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu. Kapalné testované látky se mohou podávat přímo nebo se před podáváním ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stálosti (stabilitě) prokazují, že skladování ji neovlivní.

1.4.3 Podmínky testu

1.4.3.1 Rozpouštědlo / vehikulum
Rozpouštědlo / vehikulum v používaných dávkách nesmí vyvolávat toxické účinky a nesmí s testovanou látkou chemicky reagovat. Používá-li se ne příliš známé rozpouštědlo, musí být jeho použití podpořeno údaji o kompatibilitě s testovanou látkou. Doporučuje se, aby kde je to možné, bylo na prvním místě použito vodné rozpouštědlo / vehikulum.

1.4.3.2 Kontroly
Do každého testu je třeba pro každé pohlaví zařadit souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly. Je třeba zacházet se zvířaty ve všech skupinách stejně.
Pozitivní kontroly by měly indukovat UDS při dávkách kdy lze očekávat jejich detekovatelné zvýšení nad spontánní úroveň. Pozitivní kontroly vyžadující metabolickou aktivaci se používají v dávkách vedoucích ke středně vysoké odezvě (4). Dávky při pozitivní kontrole se volí tak, aby byly účinky patrné, ale přitom nenapovídaly hodnotiteli totožnost zakódovaného preparátu. Mezi látky pro pozitivní kontrolu patří například:

Doba odběru vzorkuLátkaCASEINECS
odběr v intervalu (2 – 4 hodiny)N-nitrosodimethylamin62-75-9200-249-8
odběr v intervalu (12 – 16 hodin)N-2-fluorenylacetamid (2-AAF)53-96-3200-188-6

Je možno použít i jiné vhodné látky. Je možná aplikace pozitivní kontroly jinou cestou, než je podávána testovaná látka.

1.5 POSTUP

1.5.1 Počet a pohlaví zvířat
V každé skupině musí být minimálně tři analyzovatelní jedinci. Pokud existuje historická databáze, pak pro souběžné skupiny negativní a pozitivní kontroly postačují jeden, nebo dva jedinci.
Pokud v době, kdy se studie provádí, existují údaje ze studií s týmž živočišným druhem využívajících týž expozičních cest, prokazující, že mezi oběma pohlavími nejsou v toxicitě podstatné rozdíly, je možné provést testování pouze na jednom pohlaví, nejlépe na samcích. Tam, kde humánní expozice testovaným látkám může být pohlavně specifická, jak je tomu například u některých farmaceutických přípravků, provádí se test na zvířatech odpovídajícího pohlaví.

1.5.2 Dávkovací schéma
Testovaná látka se obvykle podává jednorázově.

1.5.3 Dávkování
Obvykle se používají dvě různé dávky. Nejvyšší dávka je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že při vyšší dávce ve stejném režimu by se očekával letální účinek. Nižší dávka představuje obecně 50–25 % dávky vyšší.
Látky, jež v nízkých netoxických dávkách vykazují specifickou biologickou aktivitu, jako jsou hormony nebo mitogeny, mohou představovat výjimky z těchto kritérií pro stanovení dávek a vyhodnocují se případ od případu. Provádí-li se studie ke zjištění rozpětí toxicity, protože potřebné údaje nejsou k dispozici, je třeba ji realizovat v téže laboratoři a za použití stejného živočišného druhu, kmene, pohlaví a pokusného režimu, jaké se pak použijí v hlavní studii.
Jako nejvyšší dávku lze také definovat dávku vyvolávající určité známky toxicity v játrech (např. pyknotická jádra).

1.5.4 Limitní test
Jestliže test při dávce minimálně 2 000 mg/kg hmotnosti podané v jedné dávce nebo ve dvou dávkách v jeden den nevyvolává žádné pozorovatelné toxické účinky a jestliže se na základě údajů o strukturně příbuzných látkách neočekává genotoxicita, nemusí se provést úplná studie. Podle očekávané humánní expozice může být použita v limitním testu vyšší dávka.

1.5.5 Aplikace látky
Testovaná látka se obvykle vpravuje žaludeční sondou. V odůvodněných případech mohou být přijatelné i jiné expoziční cesty. Intraperitoneální aplikace se však nedoporučuje, protože by se tím mohla játra vystavit působení testované látky přímo, nikoli krevním oběhem. Maximální objem kapaliny, která se dá sondou nebo injekcí najednou vpravit, závisí na velikosti pokusného zvířete a nemá překročit 2 ml/100 g hmotnosti organismu; vyšší dávky musí být zdůvodněné. S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, jež normálně vykazují při vyšších koncentracích horší účinky, je třeba upravit koncentrace látky tak, aby objem byl ve všech dávkových úrovních stejný a minimalizovala se tak objemová variabilita.

1.5.6 Příprava jaterních buněk
Jaterní buňky se z pokusných zvířat zpracovávají obvykle 12 – 16 hodin po podání dávky testované látky. Obvykle je zapotřebí ještě další odběr (obvykle 2 - 4 hodiny po podání látky), ledaže je po 12 – 16 hodinách pozitivní reakce zjevná. Je ovšem možno použít i jiné časy odběru vzorků, je-li to odůvodněné na základě toxokinetických údajů.
Krátkodobé kultury savčích jaterních buněk se obvykle zakládají perfuzí jater in situ kolagenázou. Je třeba zajistit, aby se čerstvě disociované jaterní buňky mohly přichytit ke vhodnému povrchu. Jaterní buňky ze zvířat z negativní kontroly mají mít minimálně 50 % životaschopnost (5).

1.5.7 Stanovení UDS
Čerstvě izolované savčí jaterní buňky se po vhodnou dobu (např. 3 – 8 hodin) obvykle inkubují v médiu obsahujícím 3H-TdR. Po inkubaci se médium odstraní; buňky se potom mohou inkubovat v médiu obsahujícím nadbytek neznačeného thymidinu, aby se snížila neinkorporovaná radioaktivita (tzv. „cold chase“). Buňky se pak promyjí, fixují a vysuší. Při delších inkubačních intervalech nemusí se „cold chase“ provádět. Sklíčka s preparáty se ponoří do autoradiografické emulze, exponují ve tmě (např. po dobu jednoho nebo dvou týdnů v chladničce), vyvolají, obarví a počítají se exponovaná stříbrná zrna. Z každého jedince se připraví dva nebo tři preparáty.

1.5.8 Analýza
Mikroskopické preparáty musí obsahovat dostatečný počet buněk s normální morfologií, aby bylo možno UDS vyhodnotit. Mikroskopicky se hodnotí zjevné známky cytotoxicity (např. pyknóza, snížená úroveň radioaktivního značení).
Preparáty se před počítáním zrn zakódují. Vždy na minimálně dvou preparátech z každého jedince se obvykle hodnotí 100 buněk; pokud je buněk méně než 100 na jednoho jedince, musí to být zdůvodněné. Při počítání zrn se nevyhodnocují jádra v S-fázi, ale podíl buněk v S-fázi se registruje.
Vhodnou metodou se stanoví stupeň inkorporace 3H-TdR do jader a cytoplazmy v morfologicky normálních buňkách, zjištěných podle depozice stříbrných zrnek.

2. ÚDAJE

2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
Výsledky zahrnují údaje z jednotlivých preparátů a zvířat. Mimoto se všechna data shrnou v tabelární formě. Pro každou buňku, každého jedince a každou dávku a čas se stanoví čistý počet „nuclear grain“ (NNG) odečtením počtu CG od počtu NG. Počítají-li se „buňky v opravě“, musí být kritéria, kterými se tyto buňky určují, zdůvodněna a podložena daty z historických nebo souběžných negativních kontrol.
Numerické výsledky se mohou vyhodnotit statistickými metodami; pokud se statistické testy použijí, je třeba je vybrat a zdůvodnit ještě před započetím studie.

2.2 VYHODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Kritéria pro pozitivní / negativní reakci zahrnují:

pozitivní(I)hodnoty NNG nad předem stanoveným prahem, zdůvodněným na základě historických dat dané laboratoře
nebo(II)hodnoty NNG významně vyšší než u souběžné kontroly
negativní(I)hodnoty NNG na úrovni/pod úrovní historického prahu u kontrol
nebo(II)hodnoty NNG nejsou signifikantně vyšší než souběžná kontrola

Je třeba uvážit biologickou významnost získaných dat, což znamená, že je třeba vzít v úvahu parametry, jako jsou variabilita mezi jednotlivými jedinci, vztah dávka-odpověď a cytotoxicita. Při vyhodnocování výsledků lze použít statistické metody; statistická významnost by však neměla být pro pozitivní reakci rozhodujícím faktorem.
Většina experimentů poskytuje jednoznačné pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech však nelze ze získaného souboru dat vyvodit o aktivitě testované látky definitivní závěr. Výsledky mohou být stále nejednoznačné nebo problematické, i když se experiment několikrát opakuje.
Pozitivní výsledek testu UDS se savčími jaterními buňkami in vivo ukazuje, že testovaná látka vyvolává v savčích jaterních buňkách in vivo poškození DNA, které lze opravit neplánovanou syntézou DNA in vitro. Negativní výsledek ukazuje, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka nevyvolává takové poškození DNA, jež je tímto testem zjistitelná.
Je třeba vzít v úvahu, jaká je pravděpodobnost, že testovaná látka dosáhne širokého použití nebo je specifická pro určitou cílovou tkáň (např. systémová toxicita).

3. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
ZPRÁVA O PRŮBĚHU POKUSU
Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
Rozpouštědlo / vehikulum:
– zdůvodnění volby vehikula
– rozpustnost a stabilita testované látky v rozpouštědle/vehikulu, pokud je známa.
Pokusná zvířata:
– použitý živočišný druh/kmen,
– počet, věk a pohlaví jedinců,
– původ, chovné podmínky, strava apod.,
– hmotnost jednotlivých zvířat na počátku testu, včetně hmotnostního rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek pro jednotlivé skupiny.
Podmínky pokusu:
– pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly,
– údaje ze studie pro určení rozpětí, byla-li provedena,
– zdůvodnění volby i dávek,
– podrobnosti o přípravě testované látky,
– podrobnosti o podávání testované látky,
– zdůvodnění způsobu podávání,
– případné metody k ověření, že se látka dostala do krevního oběhu nebo do cílové tkáně,
– případný převod koncentrace látky v potravě/pitné vodě (ppm) na faktickou dávku (mg/kg hmotnosti /den ),
– podrobnosti o kvalitě potravy a vody,
– podrobné schéma podávání testované látky a odběru vzorků,
– metody zjišťování toxicity,
– metoda přípravy a kultivace jaterních buněk,
– použitá autoradiografická metoda,
– počet připravených preparátů a počet hodnocených buněk,
– kritéria analýzy,
– kritéria, jimiž se studie hodnotí jako pozitivní, negativní nebo nejednoznačná.
Výsledky:
– průměrné hodnoty počtů stříbrných zrn v jádrech, cytoplazmě a „net nuclear grains“ pro jednotlivé preparáty, zvířata a skupiny,
– vztah dávka-odpověď, pokud je k dispozici,
– statistické hodnocení, bylo-li provedeno,
– známky toxicity,
– údaje ze souběžných negativních (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivních kontrol,
– historické údaje z negativních (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivních kontrol včetně rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek,
– počet „buněk v opravě“, byl-li stanoven,
– počet buněk v S-fázi, byl-li stanoven,
– životaschopnost buněk.
Diskuse výsledků.
Závěry.