I. 6 VŠEOBECNÉ POSTUPY A PŘÍPRAVY
Obecné podmínky pro zkoušky jsou přehledně uvedeny v tabulce 2. Aparatury a další experimentální podmínky, specifické pro jednotlivé metody, jsou popsány dále v kapitolách pro tyto příslušné metody.

I. 6. 1 Zřeďovací voda
Používá se deionizovaná nebo destilovaná voda, prostá inhibujících koncentrací toxických látek (např. iontů Cu^-). Voda smí obsahovat nejvýše 10 % obsahu organického uhlíku, vneseného zkoušenou látkou. Aby se vyloučily vysoké hodnoty ve slepých pokusech je nutná vysoká čistota vody pro zkoušky. Ke kontaminaci může dojít přítomnými nečistotami ze studované látky a z iontoměnných pryskyřic a rozkladnými látkami z bakterií a řas. Pro každou sérii měření je třeba používat pouze jednu šarži vody, která byla předem překontrolována analýzou DOC. Tato kontrola není nutná u zkoušky v uzavřených lahvičkách, spotřeba kyslíku vodou však musí být nízká.
Tabulka 2: Experimentální podmínky v jednotlivých zkouškách

Zkouška	Úbytek DOC	Uvolňování CO2	Manometrická respirometrie	Modifikovaná vyhledávací OECD zkouška	Uzavřené lahvičky	Zkouška MITI (I)
	C 4. - A	C 4. - C	C 4. - D	C 4. - B	C 4. - E	C 4. - F
Koncentrace zkoušené látky:
mg.l-1			100		2 - 10	100
mg DOC.l-1	10 - 40	10 - 20		10 - 40
mg ThOD.l-1			50 - 100		5 - 10
Koncentrace inokula	≤ 30 mg.-1l SL nebo ≤ 100 ml výtoku.l-1			0,5 ml sekund. výtoku.l-1	≤ 5 ml výtoku.l-1	30 mg.l-1 SL
(buňky.l-1)		(107 - 108)		(105)	(104 - 106)	(107 - 108)
Koncentrace prvku v minerálním médiu (mg.l-1)
P	116				11,6	29
N	1,3				0,13	1,3
Na	86				8,6	17,2
K	122				12,2	36,5
Mg	2,2				2,2	6,6
Ca	9,9				9,9	29,7
Fe	0,05 - 0,1				0,05 - 0,1	0,15
pH	7,4 ± 0,2					nejlépe 7,0
teplota	22 ± 2 °C					25±1 °C
DOC = rozpuštěný organický uhlík			SL = suspendované látky
ThOD = teoretická spotřeba kyslíku

I. 6. 2 Zásobní roztoky minerálních složek
Pro přípravu zkušebních roztoků se připravují zásobní roztoky o vhodných koncentracích minerálních složek. Níže uvedené zásobní roztoky je možné použít (při různých zřeďovacích faktorech) pro metody úbytku DOC, pro modifikovanou vyhledávací metodu OECD, pro metodu uvolňování CO₂, pro manometrickou respirometrii a pro uzavřené láhvičky.
Zřeďovací faktory a specifická příprava minerálního media pro zkoušku MITI jsou uvedeny v kapitolách pro jednotlivé zkoušky.
Zásobní roztoky:
Zásobní roztoky se připravují s použitím činidel analytické čistoty.
Poznámka: Aby nebylo nutné připravovat tento roztok bezprostředně před použitím, přidá se jedna kapka koncentrované kyseliny chlorovodíkové nebo 0,4 g disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) na 1 litr.

(a) dihydrogenorthofosforečnan draselný, KH₂PO₄ 8,50 g
monohydrogenorthofosforečnan didraselný, K₂ HPO₄, 21,75 g
dihydrátmonohydrogenorthofosforečnan disodný Na₂HPO ₄ .2H₂O 33,40 g
chlorid amonný, NH₄Cl 0,50 g
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. pH roztoku musí být 7,4.

(b) chlorid vápenatý bezvodý, CaCl ₂ 27,50 g
nebo dihydrát chloridu vápenatého, CaCl ₂.2H₂O 36,40 g
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

(c) heptahydrát síranu hořečnatého, MgSO₄.7H₂O 22,50 g
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

(d) hexahydrát chloridu železitého, FeCl₃.6H₂O 0,25 g
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

I. 6. 3 Zásobní roztoky chemických látek
Pokud je rozpustnost vyšší než 1 g.l^-1, rozpustí se například 1 - 10 g (podle potřeby) zkoušené nebo referenční látky v deionizované vodě a doplní se na 1 litr. Jinak se připravují zásobní roztoky v minerálním médiu, nebo se chemická látka přidá přímo do minerálního média. Pokud se týká práce s méně rozpustnými chemickými látkami, viz přílohu 3. Ve zkoušce MITI (metoda IV-F) nelze používat ani rozpouštědla, ani emulgační činidla.

I. 6. 4 Inokula
Inokulum je možné získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod (nechlorovaných), z povrchových vod a půd, nebo jako jejich směsi. Používá-li se aktivovaný kal ve zkoušce úbytku DOC, uvolňování CO₂ a manometrické respirometrie, je třeba jej odebírat z čistírny nebo z laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. U inokulí z jiných zdrojů byl zjištěn větší rozptyl výsledků. V modifikované vyhledávací zkoušce OECD a ve zkoušce v uzavřených lahvičkách je třeba zředěnější inokulum bez vloček kalu. Nejvhodnějším zdrojem je voda z druhého stupně čistírny domovních odpadních vod nebo z laboratorní jednotky. Pro zkoušku MITI se inokulum získává ze směsi zdrojů a je popsáno v kapitole o této zkoušce.

I. 6. 4. 1 Inokulum z aktivovaných kalů
Je třeba odebrat čerstvý vzorek aktivovaného kalu z aerační nádrže čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. Je-li třeba, odstraní se hrubé částice filtrací jemným sítem a kal se udržuje v aerobních podmínkách.
Alternativním způsobem je odsazení nebo zcentrifugování (např. při 1 100 g po dobu 10 min.) po odstranění hrubých částic. Voda nad usazeninou se slije. Kal je možno promýt minerálním médiem. Koncentrovaný kal se suspenduje v minerálním médiu na koncentraci 3 - 5 g suspendovaných tuhých látek na litr a provzdušňuje se až do použití.
Kal je třeba odebrat z dobře pracující konvenční čistírny. Je-li nutné kal odebrat z čistírny s vysokým prosazením nebo předpokládá-li se, že obsahuje inhibitory, je třeba jej promýt. Znovu suspendovaný kal se po důkladném promíchání nechá usadit nebo se zcentrifuguje, voda nad usazeninou se slije a promytý kal se opět suspenduje v nové dávce minerálního média. Tento postup se opakuje, až se kal považuje za prostý přebytečného substrátu nebo inhibitoru.
Po dokonalém suspendování nebo z neupravovaného kalu se odebere těsně před použitím vzorek pro stanovení sušiny suspendovaných tuhých látek.
Další alternativou je homogenizace aktivovaného kalu (3 - 5 g suspendovaných látek v litru). Kal se zpracuje v mechanickém mísiči po dobu 2 min. při střední rychlosti. Promíchaný kal se nechá usadit po dobu 30 min nebo v případě potřeby déle a kapalina se slije pro použití jako inokulum v koncentraci 10 ml.l^-1 minerálního média.

I. 6. 4. 2. Jiné zdroje inokula
Inokulum je možné získat z výstupu druhého stupně čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky, pracujících převážně s domovními odpadními vodami. Odebere se čerstvý vzorek a během přepravy se udržuje v aerobních podmínkách. Nechá se po dobu 1 hodiny usadit nebo se zfiltruje přes hrubý filtrační papír a slitá kapalina nebo filtrát se udržuje v aerobních podmínkách až do použití. Tohoto typu inokula je možné použít až 100 ml na 1 litr média. Dalším zdrojem inokula je povrchová voda. V tomto případě se odebere vzorek vhodné povrchové vody, např. říční nebo jezerní, a uchovává se v aerobních podmínkách až do použití. V případě potřeby se inokulum zkoncentruje filtrací nebo zcentrifugováním.

I. 6. 5 Předběžné kondiciování inokula
Inokula je možné předběžně kondicionovat na experimentální podmínky, ale ne předběžně adaptovat na zkoušenou látku. Předběžná kondicionace spočívá v aeraci aktivovaného kalu v minerálním médiu nebo výstupu z druhého stupně čistírny po dobu 5 - 7 dní při teplotě zkoušky. Předběžné kondicionování někdy zlepší přesnost zkušebních metod snížením hodnot ze slepých pokusů. Předběžně kondicionovat inokulum MITI se nepovažuje za nutné.

I. 6. 6 Abiotické kontrolní zkoušky
V případě potřeby se kontroluje možný abiotický rozklad zkoušené látky stanovením úbytku DOC, příjmu kyslíku nebo tvorby oxidu uhličitého ve sterilních kontrolních pokusech bez inokula. Sterilizace se provádí filtrací membránou (0,2 - 0,45 µm) nebo přidáním vhodné toxické látky v příslušné koncentraci. Používá-li se membránové filtrace, odebírají se vzorky asepticky za účelem zachování sterility. Pokud nebyla předem vyloučena adsorpce zkoušené látky, musí zkoušky, kterými se sleduje biologický rozklad podle úbytku DOC, zejména při použití inokula z aktivovaného kalu, zahrnovat abiotický kontrolní pokus, který byl naočkován a intoxikován.

I. 6. 7 Počet nasazených baněk
Počet použitých nádob (nasazených pokusů) v typické zkoušce je uveden v kapitolách pro jednotlivé zkoušky.
Lze používat tyto typy nasazených nádob:
Zkoušená suspenze: obsahuje zkoušenou látku a inokulum
Slepá zkouška s inokulem: obsahuje pouze inokulum
Kontrola postupu: obsahuje referenční látku a inokulum
Abiotická sterilní kontrola: sterilní, obsahuje zkoušenou látku (viz 1.6.6)
Kontrola pro adsorpci: obsahuje zkoušenou látku, inokulum a sterilizační činidlo
Kontrola toxicity: obsahuje zkoušenou látku, referenční látku a inokulum
Stanovení ve zkoušené suspenzi a slepý pokus s inokulem se musí povinně provádět souběžně. Stanovení v ostatních nádobách se doporučuje provádět rovněž souběžně.
To však nemusí být vždy možné. Je třeba zajistit, aby se odebíral dostatečný počet vzorků nebo se prováděl dostatečný počet odečtů pro vyhodnocení procenta úbytku v 10-denním okénku.