ISO 8692 - Kvalita vody - Růstová inhibiční zkouška na sladkovodních řasách Scenedesmus subspicatus uvádí výsledky mezilaboratorních zkoušek dichromanu draselného provedených 16 laboratořemi.

	Průměry (mg.l-1)	Rozsah (mg.l-1)
ErC50 (0 - 72 hod)	0,84	0,60 - 1,03
EbC50 (0 - 72 hod)	0,53	0,20 - 0,75

IV. A ZKOUŠKA ÚBYTKU DOC

II. 1 PRINCIP METODY
Změřený objem naočkovaného minerálního média, obsahujícího známou koncentraci zkoušené látky (10 - 40 mg DOC.l^-1 ) jako jmenovitý jediný zdroj organického uhlíku, se provzdušňuje v temnu nebo v difúzním světle při 22 ± 2 °C.
Rozklad se sleduje v častých intervalech během 28-denního období analýzou DOC. Stupeň biologického rozkladu se vypočítá tak, že se koncentrace rozloženého DOC (opravená na koncentraci v kontrolní zkoušce s inokulem) vyjádří jako procento koncentrace přítomné na začátku. Stupeň primárního biologického rozkladu je rovněž možné vypočítat z doplňkové chemické analýzy, provedené na začátku a na konci inkubace.

II. 2 POPIS METODY

II. 2. 1 Aparatura

(a) Erlenmeyerovy baňky, např. od 250 ml do 2 l, podle objemu potřebného pro analýzu DOC.

(b) Třepačka pro umístění Erlenmeyerových baněk, buď s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostatečným výkonem pro udržení aerobních podmínek ve všech baňkách.

(c) Filtrační aparatura s vhodnými membránami.

(d) Analyzátor DOC.

(e) Přístroj pro stanovení rozpuštěného kyslíku.

(f) Odstředivka.

II. 2. 2 Příprava minerálního média
Příprava zásobních roztoků viz I. 6. 2.
Smísí se 10 ml roztoku (a) s 800 ml zřeďovací vody, přidá se 1 ml roztoků (b) až (d) a doplní se na 1 l zřeďovací vodou.

II. 2. 3 Příprava a předběžná kondicionace inokula
Inokulum je možné získat z řady zdrojů: aktivovaný kal; splaškové odpadní vody; povrchové vody; půda nebo směs z uvedených typů.
Viz I. 6. 4, I. 6. 4. 1, I. 6. 4. 2 a I. 6. 5.

II. 2. 4 Příprava baněk
Je například možné naplnit podíly po 800 ml minerálního média do 2 l Erlenmeyerových baněk a do jednotlivých baněk přidat dostatečná množství zásobních roztoků zkoušné a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 - 40 mg DOC.l^-1. Zkontrolují se hodnoty pH a případně se upraví na 7,4. Baňky se naočkují aktivovaným kalem nebo jiným zdrojem inokula (viz I. 6. 4), aby se získala výsledná koncentrace nejvýše 30 mg suspendovaných tuhých látek na litr. Připraví se rovněž kontrolní zkoušky s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkoušené nebo referenční látky.
V případě potřeby se použije jedna nádoba ke kontrole možného inhibičního efektu zkoušené látky naočkováním roztoku, který v minerálním médiu obsahuje srovnatelná množství jak zkoušené tak referenční látky.
Je-li třeba, použije se rovněž další, sterilní, baňka s roztokem dané chemické látky bez inokula (viz I. 6. 6) ke kontrole zda je zkoušená chemická látka rozkládána abioticky.
Existuje-li dále podezření, že se zkoušená látka významně adsorbuje na skle, kalu apod., provede se předběžný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce a tím vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulku 1). Použije se baňka obsahující zkoušenou látku, inokulum a sterilizační činidlo.
Obsah všech baněk se doplní minerálním médiem na 1 l a po promíchání se z každé baňky odebere vzorek pro stanovení počáteční koncentrace DOC (viz příloha 2, odst.4). Ústí baněk se zakryjí např. hliníkovou fólií tak, aby byla možná volná výměna vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Pak se nádoby umístí do třepačky a zahájí se zkouška.

II. 2. 5 Počet baněk v typické zkoušce
Baňka 1 a 2: Zkoušená suspenze
Baňka 3 a 4: Slepý pokus s inokulem
Baňka 5: Kontrola postupu
Pokud možno a je-li třeba:
Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola
Baňka 7: Kontrola adsorpce
Baňka 8: Kontrola toxicity
Viz také bod I. 6. 7.

II. 2. 6 Provedení zkoušky
Během zkoušky se ve známých časových intervalech stanoví dvojmo koncentrace DOC v každé baňce, a to dostatečně často, aby bylo možné určit začátek 10-denního okénka a procentní úbytek na konci 10-denního okénka. Pro každé stanovení je třeba odebírat pouze minimální nutné množství zkoušené suspenze.
Před odběrem vzorků se případně nahradí ztráty odpařováním z baněk přidáním potřebného množství zřeďovací vody (I. 6. 1). Před odběrem vzorků je třeba kultivační médium dobře promíchat a zajistit, aby látky ulpělé na stěnách nádob přešly do roztoku nebo suspenze. Ihned po odběru je třeba vzorky zfiltrovat přes membránu nebo zcentrifugovat (viz přílohu 2.4). Zfiltrované resp. zcentrifugované vzorky je třeba analyzovat týž den, jinak je možné je přechovávat nejdéle 48 hodin při 2 - 4 °C nebo po delší dobu při teplotě nižší než - 18 °C.

II. 3 VÝSLEDKY A ZPRÁVA

II. 3. 1 Zpracování výsledků
Procentní rozklad v čase t se vypočte, jak je uvedeno v bodě I. 7. 1. (stanovení DOC) nebo případně v bodě I. 7. 2. (specifická analýza).
Všechny výsledky se uvedou na přiložených přehledech dat.

II. 3. 2 Platnost výsledků
Viz bod I. 5. 2.

II. 3. 3 Protokol o zkoušce
Viz bod I. 8.

II. 4 PŘEHLED DAT
Příklad přehledu výsledků může být následující:
ZKOUŠKA ÚBYTKU DOC

1. LABORATOŘ

2. DATUM POČÁTKU ZKOUŠKY

3. ZKOUŠENÁ LÁTKA
Název:
Koncentrace zásobního roztoku: mg.l^-1 jako chemická látka
Počáteční koncentrace v médiu, t_o: mg.l^-1 jako chemická látka

4. INOKULUM
Zdroj:
Provedená úprava:
Předběžná kondicionace, pokud byla provedena:
Koncentrace suspendovaných tuhých látek v reakční směsi: mg.l^-1

5. STANOVENÍ UHLÍKU

	Baňka č.		DOC po n dnech (mg.l-1)
			0	n1	n2	n3	nx
Zkoušená láka a inokulum	1	a1
		a2
		a, průměr Ca(t)
	2	b1
		b2
		b, průměr Cb(t)
Čisté inokulum bez zkoušené látky	3	c1
		c2
		c, průměr Cc(t)
	4	d1
		d2
		d, průměr Cd(t)
	$C_{\mathrm{bl}t}=\frac{C_{ct}+C_{dt}}{2}$

6. VYHODNOCENÍ NAMĚŘENÝCH ÚDAJŮ

Baňka č.		% rozkladu po n dnech
		0	n1	n2	n3	nx
1	$D_1=1-\frac{C_{at}-C_{\mathrm{bl}t}}{C_{a0}-C_{\mathrm{bl}0}}.100$	0
2	$D_2=1-\frac{C_{bt}-C_{\mathrm{bl}t}}{C_{b0}-C_{\mathrm{bl}0}}.100$	0
Průměr*	$D=\frac{D_1-D_2}{2}$	0

* D1 a D2 nesmí být průměrovány,pokud je mezi nimi významný rozdíl.

7. ABIOTICKÁ KONTROLA (NEPOVINNÁ)

	Doba (dny)
	0	t
DOC (mg/l) ve sterilní kontrole	CS(o)	CS(t)

8. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA (NEPOVINNÁ)

	Zbývající množství zkoušené chemikálie na konci zkoušky(mg.l-1)	% primárního rozkladu
Sterilní kontrola	Sb
Neočkované zkušební médium	Sa	$\frac{S_b-S_a}{S_b}.100$

IV. B MODIFIKOVANÁ VYHLEDÁVACÍ ZKOUŠKA OECD

III. 1 PRINCIP METODY
Změřený objem minerálního média, obsahujícího známou koncentraci zkoušené látky (10 - 40 mg DOC.l^-1) jako výhradně jediného zdroje organického uhlíku, se naočkuje 0,5 ml přečištěné odpadní vody na 1 litr média. Směs se provzdušňuje v temnu nebo v difůzním světle při 22 ± 2 °C.
Rozklad se sleduje analýzou DOC v častých intervalech během 28-denního období. Stupeň biologického rozkladu se vypočítá tak, že se koncentrace odstraněného DOC (korigovaná na koncentraci ve slepém pokusu s inokulem) vyjádří jako procento koncentrace přítomné na začátku. Stupeň primárního biologického rozkladu je rovněž možné vypočítat z doplňkové chemické analýzy, provedené na začátku a na konci inkubace.

III. 2 POPIS METODY

III. 2. 1 Aparatura

(a) Erlenmeyerovy baňky, např. od 250 ml do 2 l, podle objemu potřebného pro analýzu DOC;

(b) Třepačka - pro umístění Erlenmeyerových baněk, buď s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostatečným výkonem pro udržení aerobních podmínek ve všech baňkách;

(c) Filtrační aparatura s vhodnými membránami;

(d) Analyzátor DOC;

(e) Přístroj pro stanovení rozpuštěného kyslíku;

(f) Odstředivka.

III. 2. 2 Příprava minerálního média
Příprava zásobních roztoků viz I. 6. 2.
Smísí se 10 ml roztoku (a) s 80 ml zřeďovací vody, přidá se 1 ml roztoků (b) až (d) a doplní na 1 l zřeďovací vodou.
Tato metoda používá jako inokulum pouze 0,5 ml přečištěné odpadní vody a proto je nutné médiu dodat stopové prvky a růstové faktory. Toho se dosáhne přidáním 1 ml každého z dále uvedených roztoků na 1 litr výsledného média:
Roztok stopových prvků:

Tetrahydrát síranu manganatého, MnSO4.4H2O	39,9 mg
Kyselina boritá, H3BO3	57,2 mg
Heptahydrát síranu zinečnatého, ZnSO4.7H2O	42,8 mg
Heptamolybdenan amonný, (NH4)6Mo7O24	34,7 mg
Chelát Fe (FeCl3 s ethylendiamintetraoctovou kyselinou)	100,0 mg

Rozpustí se ve zřeďovací vodě a doplní se na 1000 ml.
Vitaminový roztok:
Kvasničný extrakt 15,7 mg
Kvasničný extrakt se rozpustí ve 100 ml vody. Sterilizuje se průchodem membránou 0,2 µm, nebo se připraví čerstvě.

III. 2. 3 Příprava a předběžná kondicionace inokula
Inokulum se získá z výstupu druhého stupně čistírny nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody.
Viz I. 6. 4. 2 a I. 6. 5.

III. 2. 4 Příprava baněk
Je například možné naplnit podíly po 800 ml minerálního média do 2 l Erlenmeyerových baněk a do jednotlivých baněk přidat dostatečná množství zásobních roztoků zkoušené a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 - 40 mg DOC.l^-1. Zkontrolují se hodnoty pH a případně se upraví na 7,4. Baňky se naočkují výtokem z druhého stupně čištění odpadních vod (viz I. 6. 4. 2). Připraví se rovněž kontrolní pokusy s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkoušené nebo referenční látky.
V případě potřeby se použije jedna baňka ke kontrole možného inhibičního efektu zkoušené látky naočkováním roztoku, který v minerálním médiu obsahuje srovnatelné koncentrace jak zkoušené, tak referenční látky.
Je-li třeba, použije se rovněž další, sterilní, baňka ke kontrole, zda je zkoušená chemická látka rozkládána abioticky, pomocí roztoku dané chemické látky bez inokula (viz I. 6. 6).
Existuje-li důvodné podezření, že se zkoušená látka významně adsorbuje na skle, kalu apod., provede se předběžný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce a tím vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulka 1). Použije se baňka obsahující zkoušenou látku, inokulum a sterilizační činidlo.
Obsah všech baněk se doplní minerálním médiem na 1 l a po promíchání se z každé baňky odebere vzorek pro stanovení počáteční koncentrace DOC (viz příloha 2.4). Ústí baněk se zakryjí např. hliníkovou fólií tak, aby byla možná volná výměna vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Pak se nádoby umístí do třepačky čímž se zahájí zkouška.

III. 2. 5 Počet baněk v typické zkoušce
Baňka 1 a 2: Zkoušená suspenze
Baňka 3 a 4: Slepý pokus s inokulem
Baňka 5: Kontrola postupu
Pokud možno a je-li třeba:
Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola
Baňka 7: Kontrola adsorpce
Baňka 8: Kontrola toxicity
Viz také bod I. 6. 7.

III. 2. 6 Provedení zkoušky
Během zkoušky se ve známých časových intervalech stanoví dvojmo koncentrace DOC v každé baňce, a to dostatečně často, aby bylo možno určit začátek 10-denního okénka a procentní úbytek na konci 10-denního okénka. Pro každé stanovení je třeba odebírat pouze minimální nutné množství zkoušené suspenze.
Před odběrem vzorků se případně nahradí ztráty odpařováním z baněk přidáním potřebného množství zřeďovací vody (I. 6. 1). Před odběrem vzorků je třeba kultivační médium dobře promíchat a zajistit, aby látky ulpělé na stěnách nádob přešly do roztoku nebo suspenze. Ihned po odběru je třeba vzorky zfiltrovat přes membránu nebo zcentrifugovat (viz přílohu 2. 4). Zfiltrované resp. zcentrifugované vzorky je třeba analyzovat týž den, jinak je možné je přechovávat nejdéle 48 hodin při 2 - 4 °C nebo po delší dobu při teplotě nižší než - 18 °C.

III. 3 DATA A PROTOKOL

III. 3. 1 Zpracování výsledků
Procentní rozklad v čase t se vypočte, jak je uvedeno v bodě I. 7. 1. (stanovení DOC) nebo případně v bodě I. 7. 2. (specifická analýza).
Všechny výsledky se uvedou na přiložených přehledech dat.

III. 3. 2 Platnost výsledků
Viz bod I. 5. 2.

III. 3. 3 Protokol
Viz bod I. 8.

III. 4 PŘEHLED ZÍSKANÝCH VÝSLEDKŮ
Příklad přehledu výsledků:
MODIFIKOVANÁ VYHLEDÁVACÍ ZKOUŠKA OECD

1. LABORATOŘ

2. DATUM POČÁTKU ZKOUŠKY

3. ZKOUŠENÁ LÁTKA
Název:
Koncentrace zásobního roztoku: mg.l^-1 jako chemická látka
Počáteční koncentrace v médiu, to: mg.l^-1 jako chemická látka

4. INOKULUM
Zdroj:
Provedená úprava:
Předběžná kondicionace, pokud byla provedena:
Koncentrace suspendovaných tuhých látek v reakční směsi: mg.l^-1

5. STANOVENÍ UHLÍKU

	Baňka č.		DOC po n dnech (mg.l-1)
			0	n1	n2	n3	nx
Zkoušená láka a inokulum	1	a1
		a2
		a, průměr Ca(t)
	2	b1
		b2
		b, průměr Cb(t)
Čisté inokulum bez zkoušené látky	3	c1
		c2
		c, průměr Cc(t)
	4	d1
		d2
		d, průměr Cd(t)
	$C_{\mathrm{bl}t}=\frac{C_{ct}+C_{dt}}{2}$

6. VYHODNOCENÍ NAMĚŘENÝCH ÚDAJŮ

Baňka č.		% rozkladu po n dnech
		0	n1	n2	n3	nx
1	$D_1=1-\frac{C_{at}-C_{\mathrm{bl}t}}{C_{a0}-C_{\mathrm{bl}0}}.100$	0
2	$D_2=1-\frac{C_{bt}-C_{\mathrm{bl}t}}{C_{b0}-C_{\mathrm{bl}0}}.100$	0
Průměr*	$D=\frac{D_1-D_2}{2}$	0

* D1 a D2 nesmí být průměrovány,pokud je mezi nimi významný rozdíl.
Poznámka: obdobný vzor může být použit i pro referenční látku a pro kontrolu toxicity.

7. ABIOTICKÁ KONTROLA (nepovinná)

	Doba (dny)
	0	t
DOC (mg.l-1) ve sterilní kontrole	Cs(o)	Cs(t)

8. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA (nepovinná)

	Zbývající množství zkoušené chemikálie na konci zkoušky (mg.l-1)	% primárního rozkladu
Sterilní kontrola	Sb
Neočkované zkušební medium	Sa	$\frac{S_b-S_a}{S_b}.100$

IV. C ZKOUŠKA UVOLŇOVÁNÍ OXIDU UHLIČITÉHO

IV. 1 PRINCIP METODY
Odměřený objem inokulovaného minerálního média se známou koncentrací zkoušené látky (10 - 20 mg.l^-1), která je jediným zdrojem uhlíku je provzdušňovan ve tmě nebo v difusním světle řízeným proudem vzduchu prostého CO₂. Rozklad je sledován po dobu 28 dnů podle množství prokukovaného CO₂ jímaného v roztoku hydroxidu sodného nebo barnatého, kde je titračně stanoven jako anorganický uhlík. Množství uvolněného CO₂, po korekci na slepý pokus, je vyjadřováno jako % TCO₂. Stupeň biologického rozkladu může být také stanoven podle DOC stanoveného na začátku a na konci pokusu.

IV. 2 POPIS METODY

IV. 2. 1 Aparatura

a) baňky 2 - 5 l vybavené vzduchovací trubicí, která dosahuje až ke dnu nádoby, a výpustí;

b) magnetická míchačka pro zkoušení špatně rozpustných látek;

c) absorpční nádobky;

d) zařízení pro řízení a měření množství vzduchu;

e) zařízení pro praní vzduchu, pro přípravu CO₂ prostého vzduchu, případně akternativně směšovací zařízení na směs CO₂ prostého kyslíku a CO₂ prostého dusíku z lahví. Má se používat správný poměr 20 % kyslíku a 80 % dusíku;

f) zařízení na stanovení CO₂ buď titračně nebo pomocí analyzátorů anorganického uhlíku;

g) zařízení pro membránovou filtraci (nepovinně);

h) analyzátor DOC (nepovinně).

IV. 2. 2 Příprava minerálního média
Příprava zásobních roztoků je popsána v části I. 6. 2..
Roztok (a) v množství 10 ml se smíchá s 800 ml zřeďovací vody, přidá se 1 ml roztoků (b) až (d) a doplní do 1 l zřeďovací vodou.

IV. 2. 3 Příprava a předúprava inokula
Inokulum má pocházet z různých zdrojů: aktivovaný kal, odtok z městské čistírny, povrchová voda, půdy či směs z uvedených.
Viz. část I. 6. 4, I. 6. 4. 1, I. 6. 4. 2 a I. 6. 5.

IV. 2. 4 Příprava baněk
Jako příklad je uváděno uspořádání pro 5 l baňky s obsahem 3 l suspenze.
V případě použití jiných objemů se hodnoty úměrně upraví tak, aby se zajistilo přesné měření vytvořeného CO₂.
Do každé 5 l baňky se vnese 2400 ml minerálního média. Přidá se vhodné množství připraveného inokula (viz I. 6. 4. 1 a I. 6. 5) tak, aby koncentrace aktivovaného kalu byla 30 mg.l^-1 v konečném objemu 3 l inokulované směsi. Alternativně lze zředit kal tak, aby se získala suspenze 500 - 1000 mg.l^-1 v minerálním médiu a to ještě před přídavkem alikvotní části do 5 l baňky k dosažení koncentrace 30 mg.l^-1. Tento postup zajišťuje větší přesnost. Mohou být použita i jiná inokula (viz I. 6. 4. 2).
Inokulovaná směs se přes noc probublává vzduchem prostým CO₂ k odstranění absorbovaného CO₂.
Přidá se známý objem zásobního roztoku zkoušené látky a referenční látky, čímž se vytvoří dvojice baněk se živnou koncentrací ze zkoušené a referenční látky v rozmezí 10 až 20 mg.^l-1 DOC nebo TOC. Některé lahve se nasazují jako kontrola a to bez chemikálií. Špatně rozpustné látky se přidávají přímo do baněk na hmotnostní nebo objemové bázi nebo se postupuje podle přílohy 3.
Jestliže je to požadováno, použije se 1 sterilní baňka bez inokula ke zjištění abiotického rozkladu (viz I. 6. 6). Sterilizace se provádí pomocí vhodné koncentrace toxické látky.
Ve všech baňkách se upraví objem na 3 l přídavkem minerálního média prostého CO₂. Mohou se odebrat vzorky pro stanovení DOC (viz příloha 2) a/nebo specifickou analýzu. Pak se připojí absorpční nádobky.
V případě použití hydroxidu barnatého se spojují 3 nádobky, každá s obsahem 100 ml 0,0125 mol.l^-1 Ba(OH)₂ v sérii pro každou 5 l baňku. Roztok musí být prostý sraženiny síranu a uhličitanu barnatého a bezprostředně před použitím musí být stanovena jeho koncentrace. V případě použití hydroxidu sodného spojují se 2 jednotky, z nichž druhá slouží jako kontrola, že všechen CO₂ byl absorbován v první nádobce. Jako uzávěry absorpčních nádobek jsou vhodné sérové uzávěry. Do každé nádobky se přidá po 200 ml 0,05 mol NaOH, což je dostatečné k absorpci veškerého CO₂, který se uvolní při úplném rozkladu látky. Roztok hydroxidu sodného i když je čerstvě připraven, obsahuje stopy uhličitanů, což se koriguje odečtením slepého pokusu.

IV. 2. 5 Počet baněk v typickém pokusu
Baňka č. 1 a 2: Zkoušená suspenze
Baňka č. 3 a 4: Slepý pokus inokula
Baňka č. 5: Kontrola postupu
a dále s výhodou a když je to potřebné:
Baňka č. 6: Abiotická sterilní kontrola
Baňka č. 7: Kontrola toxicity
Viz. také část I. 6. 7.

IV. 2. 6 Provedení zkoušky
Zkouška se zahajuje probubláváním suspenze vzduchem prostým CO₂ rychlostí 30 - 100 ml.min^-1. Pravidelně se odebírají a analyzují vzorky absorbátu CO₂. Doporučuje se, aby v průběhu prvních 10 dnů byly analýzy prováděny každý druhý až třetí den a dále každý pátý den až do 28. dne, což umožňuje určení periody.10 denního okna.
Na konci pokusu, 28. den, může být odebrán vzorek na stanovení DOC a/nebo na specifickou analýzu, změří se pH suspenze a pak se do každé baňky přidá 1 ml koncentrované HCl. Provzdušňuje se přes noc k odstranění v suspenzi přítomného CO₂. Poslední analýza CO₂ se provede 29. den.
Ve dnech, kdy se měří CO₂ se odpojuje ten absorbér, který je nejblíže baňce a roztok hydroxidu se titruje 0,05 mol HCl na fenolftalein. Zbývající absorbér se posune o jedno místo blíže k lahvi a nový absorbér se 100 ml čerstvě připraveného 0,0125 mol.l^-1 hydroxidu barnatého se zapojí na místě posunutého, na konec série. Potřebné titrace se provádí tehdy, je-li pozorována sraženina v prvním absorbéru a před tím než je pozorovatelná ve druhém, nebo nejméně jednou týdně. Alternativně, v případě použití NaOH jako absorbentu, se pomocí injekční stříkačky odebere z absorbéru, který je nejblíže baňce malý vzorek, který se nastříkne přímo do analyzátoru uhlíku.
Druhý absorbér se analyzuje pouze na konci zkoušky, aby se tak mohl korigovat únik CO₂.

IV. 3 VÝSLEDKY A ZPRÁVA

IV. 3. 1 Zpracování výsledků
Množství CO₂ zachyceného v absorbéru je při titraci dáno:
mg CO₂ = (100.C_B - 0,5.V.C_A).44
kde
V = spotřeba HCl pro titraci 100 ml v absorbéru
C_B = koncentrace roztoku Ba(OH)₂ v mol.l^-1
C_A = koncentrace HCl v mol.l^-1
V případě, že C_B je 0,0125 mol a C_A 0,05 mol je spotřeba pro titraci 100 ml roztoku Ba(OH)₂ 50 ml a hmotnost CO₂ je dána:
$\frac{\mathrm{0,05}}{2}.44.mlHCl=\mathrm{1,1}.mlHCl$
Tedy, v tomto případě se hmotnost produkovaného CO₂ získá násobením spotřeby HCl faktorem 1,1.
Vypočítá se hmotnost CO₂ vyprodukovaného samotným inokulem, inokulem se zkoušenou látkou s použitím příslušných výsledků titrace. Jejich rozdíl je hmotnost CO₂, který byl vyprodukován samotnou zkoušenou látkou.
Např. když samotné inokulum poskytuje titrací 48 ml a inokulum se zkoušenou látkou 45 ml,
CO₂ z inokula = 1,1. (50 - 48) = 2,2 mg
CO₂ z inokula a zkoušené látky = 1,1.(50 - 45) = 5,5 mg
a z toho hmotnost CO₂ vyprodukovaná zkoušenou látkou je 3,3 mg.
Procentní biologická rozložitelnost se vypočítá z:
% rozkladu = (mg CO₂. 100)/(TCO₂. mg zkoušené látky)
nebo
% rozkladu = (mg CO₂. 100)/(mg TOC.3,67)
kde 3,67 je přepočítací koeficient 44/12 pro uhlík na CO₂.
Takto se postupuje pro každé měření jež se provádělo po celou dobu zkoušky vždy s dosazením TCO₂ spočítané pro každý den..
Při absorpci do NaOH se vypočítá hmotnost produkovaného CO₂, vyjádřeného jako anorganický uhlík, vynásobením této koncentrace objemem absorpčního roztoku.
Procento rozkladu se vypočítá ze vztahu:
% TCO₂ = [( mg IC ze zk. b. - mg IC ze sl. p.) / mg TOC ve zk. 1]. 100
kde
IC = anorganický uhlík,
sl.p. = slepý pokus,
zk. b. = zkušební baňka
zk. l. = zkoušená látka.
Úbytek DOC se může spočítat podle části I. Všechny výsledky se zapisují do sestavy dat.

IV. 3. 2 Platnost výsledků
Počáteční hmotnost anorganického uhlíku ve zkušební suspenzi v minerálním médiu nesmí být na počátku pokusu větší než 5 % celkového uhlíku. Celkové množství CO₂ vyvinutého v inokulovaném slepém pokusu nesmí překročit na konci pokusu 40 mg na litr média. V případě, že se získají hodnoty větší než 70 mg CO₂. l^-1, měly by se experimentální postup i výsledky kriticky posoudit.
Viz také I. 5. 2.

IV. 3. 3 Zpráva o výsledcích
Viz část I. 8.

IV. 4 Přehled získaných výsledků
Příklad přehledu výsledků:.
ZKOUŠKA VÝVINU OXIDU UHLIČITÉHO

1. LABORATOŘ

2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

3. ZKOUŠENÁ LÁTKA
Název:
Koncentrace zásobního roztoku: mg látky na litr
Počáteční koncentrace v médiu: mg látky v mediu
Množství celkového uhlíku nasazeného do baňky: mg C
TCO₂: mg CO₂

4. INOKULUM
Zdroj:
Způsob úpravy:
Předúprava: pokud byla
Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg CO₂

5. TVORBA OXIDU UHLIČITÉHO A ROZLOŽITELNOST
Metoda: Ba(OH)₂ / NaOH/ jiná

Čas (dny)	mg CO2 vyvinutého ve zkoušce			mg CO2 vyvinutého ve slepém pokuse			kumulatívní množství vyvinutého CO2 (průměr ve zkoušce mínus průměr		TCO2 kumulatívní CO2.100 TCO2
	1	2	průměr	3	4	průměr	1	2	1	2	průměr
()
n1
n2
n3
28

Poznámka: podobné uspořádání lze použít i pro referenční látku a pro kontrolu toxicity.

6. ANALÝZA UHLÍKU (nepovinně)
Analyzátor uhlíku

Čas (den)	Slepý pokus. mg.l-1	Zkoušená látka, mg.l-1
0	Cb(o)	Co
20 (*)	Cb(t)	C(t)
(*) nebo na konci inkubace

$\%odstr.DOC=1-\frac{C_t-C_{b\left(t\right)}}{C_o-C_{b\left(o\right)}}.100$

7. ABIOTICKÝ ROZKLAD (nepovinně)
% abiot. rozkladu = (produkce mg CO₂ ve steril. podm. po 28 dnech / TCO₂).100

IV. D MANOMETRICKÁ RESPIROMETRICKÁ ZKOUŠKA

V. 1 PRINCIP METODY
Změřený objem inokulovaného minerálního média, jež obsahuje známou koncentraci zkoušené látky (100 mg.l^-1 látky, jež poskytují nejméně 50-100 mg.l^-1 TSK) jako jediný zdroj uhlíku je míchán v uzavřené nádobě při konstantní teplotě (± 1 °C nebo lepší) po dobu 28 dnů. Spotřeba kyslíku se stanovuje jednak měřením množství elektrolyticky produkovaného kyslíku, který je potřebný k udržení konstantního objemu plynu v respirační nádobce nebo ze změn objemu nebo tlaku nebo obou v aparatuře. Vyvinutý CO₂ je absorbován v roztoku KOH nebo v jiném vhodném absorbentu. Množství kyslíku, jenž je zkoušenou látkou spotřebován, korigované o spotřebu slepého pokusu jenž běží paralelně se vyjadřuje jako procento TSK nebo CHSK. Případně může být z doprovodné specifické chemické analýzy provedené na začátku a na konci inkubace počítána primární biologická rozložitelnost a z analýzy DOC úplný rozklad.

V. 2 POPIS METODY

V. 2. 1 Zařízení

a) vhodný respirometr,

b) regulátor teploty s přesností ± 1 °C nebo lepší,

c) aparatura pro membránovou filtraci,

d) analyzátor DOC (nepovinně),

V. 2. 2 Příprava minerálního média
Příprava zásobních roztoků je popsána v části I. 6. 2
Smíchá se 10 ml roztoku (a) s 800 ml zřeďovací vody a přidá se po 1 ml roztoků (b) až (d) a doplní se do 1 l zřeďovací vodou.

V. 2. 3 Příprava a předúprava inokula
Inokulum má být získáno z různých zdrojů: aktivovaný kal, vyčištěná městská odpadní voda, povrchová voda a půda nebo jejich směs.
Viz část I. 6. 4, I. 6. 4. 2 a I. 6. 5.

V. 2. 4 Příprava nádobek
S použitím zásobních roztoků se připraví roztoky zkoušené a referenční látky v minerálním médiu, koncentračně ekvivalentní 50 - 100 mg.l^-1 TSK.
V případech, kdy lze vyloučit nitrifikaci vypočítá se TSK za předpokladu tvorby amoniových solí, v opačném případě na bázi tvorby dusičnanů (viz příloha 2.2)
Změří se pH a v případě potřeby se upraví na 7,4 ± 0,2.
Špatně rozpustné látky se přidávají v pozdějším stádiu (viz dále).
Má-li se stanovit toxicita zkoušené látky připraví se další roztok v minerálním médiu, jenž obsahuje referenční a zkoušenou látku dohromady a to ve stejných koncentracích jako v individuálních roztocích.
Je-li požadováno stanovení fyzikálně-chemické spotřeby kyslíku, připraví se roztok zkoušené látky při obvyklé koncentraci 100 mg TSK.l^-1 sterilizovaný přídavkem vhodné toxické látky (viz I. 6. 6)
Připravené roztoky zkoušené a referenční látky se vnesou, nejméně v duplikátech, do nádobek. Do dalších nádobek se vnese pro kontrolu inokula pouze minerální médium a v případě, že je to požadováno, směs zkoušené látky a referenční látky a sterilní roztok.
V případě, že je zkoušená látka špatně rozpustná, přidává se v této fázi přímo navážením nebo odměřením objemu nebo se postupuje podle přílohy 3. Do absorbéru CO₂ se přidá KOH, pelety NaOH nebo jiný absorbent.

V. 2. 5 Počet nádobek v typické zkoušce
Nádobka č. 1 a 2: zkoušená suspenze
Nádobka č. 3 a 4: slepý pokus
Nádobka č. 5: kontrola postupu
když je to potřebné:
Nádobka č. 6: sterilní kontrola
Nádobka č. 7: kontrola toxicity
Viz část I. 6. 7.

V. 2. 6 Provedení zkoušky
Po vytemperování nádobek na zvolenou teplotu se do vybraných nádobek přidá inokulum tak, aby se ustavila koncentrace suspendovaných látek ne větší než 30 mg.l^-1. Nádobka se zkompletuje, přezkouší na těsnost, pustí se míchání a zahájí se měření spotřeby kyslíku. Obvykle není potřebné věnovat pokusu žádnou jinou pozornost vyjma denních odečtů a kontroly teploty a míchání.
Vypočítá se spotřeba kyslíku z pravidelných a občasných odečtů postupem, jenž doporučuje výrobce přístroje. Na konci inkubace, obvykle po 28 dnech, se změří pH v nádobkách a to zvláště tehdy, je-li spotřeba kyslíku malá nebo větší než TSK počítaná na vznik amoniaku (platí pro látky s obsahem dusíku).
Je-li to požadováno, odebírá se vzorek z nádobek ke stanovení DOC nebo specifickou analýzu - viz příloha 2. Při prvním odběru z nádobky je nutné znát zbývající objem v nádobce. V případě zkoušky s dusíkatými látkami stanovuje se přírůstek koncentrací dusičnanů a dusitanů v průběhu 28 dnů a z nich se počítá korekce spotřeby kyslíku podle příohy 5.

V. 3. VÝSLEDKY A ZPRÁVA

V. 3. 1. Zpracování výsledků
Spotřeba kyslíku zkoušenou látkou po zvoleném času a po korekci na slepý pokus se dělí hmotností zkoušené látky v nádobce. To poskytuje BSK vyjádřenou jako mg.mg^-1:
$BSK=\frac{{SK}_{ZL-}{SK}_0}{m}(mg.{mg}^{-1})$
kde
SK_ZL = spotřeba kyslíku zkoušenou látkou (mg),
SK₀ = spotřeba kyslíku ve slepém pokusu (mg),
m = hmotnost zkoušené látky v nádobce.
Procentní biologický rozklad se vypočte z rovnice
$\%biologickéhorozkladu=\%TSK=\frac{BSK}{TSK}.100$
nebo ze vztahu
$\%CHSK=\frac{BSK}{CHSK}.100$
Je nutné poznamenat, že obě metody nemusí poskytovat stejné hodnoty; upřednostňuje se použití první metody.
Pro látky, jež obsahují dusík se používá vhodné TSK (pro NH₄ nebo NO₃) podle toho co je známo nebo odhadováno o výskytu nitrifikace (příloha 2). Jestliže se nitrifikace vyskytuje, ale není úplná, koriguje se spotřeba kyslíku podle změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha 5).
V případě, že se stanovuje organický uhlík a /nebo se provedla specifická analýza, počítá se stupeň rozkladu podle odstavce I. 7.
Všechny výsledky se zapisují do tabulkových sestav.

V. 3. 2 Platnost zkoušky
Normální spotřeba kyslíku inokulem je 20 - 30 mg.l^-1 a nemá být větší než 60 mg.l^-1 v průběhu 28 dnů. Hodnoty větší než 60 mg.l^-1 vyžadují kritické hodnocení výsledků a experimentální techniky.
V případě, že pH je mimo rozsah 6 - 8,5 a spotřeba kyslíku zkoušenou látkou je menší než 60 % je nutno zkoušku opakovat s nižší koncentrací zkoušené látky.
Viz odst. I.

V. 3. 3 Protokol o zkoušce
Dále je uveden příklad protokolu.
MANOMETRICKÁ RESPIROMETRICKÁ ZKOUŠKA

1. LABORATOŘ

2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

3. ZKOUŠENÁ LÁTKA
Název:
Koncentrace zásobního roztoku:
Počáteční koncentrace v médiu:
Objem v nádobce:
TSK nebo CHSK v mg.mg^-1 zkoušené látky (NH₄, NO₃):

4. INOKULUM
Zdroj:
Provedená úprava:
Předúprava, pokud byla provedena:
Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi:

5. TABULKA SPOTŘEB KYSLÍKU

		Čas (dny)
		0		7		14			21			28
spotřeba kyslíku (mg) zkoušenou látkou	1
	2
	a, průměr
spotřeba kyslíku (mg) ve slepém pokuse	3
	4
	b, průměr
opravená BSK (mg)	(a1 - bm)
BSK na zkoušené látky	(a2 - bm)
	$\frac{(a_1-b_m)}{C_{0}V}$
	$\frac{(a_2-b_m)}{C_{0}V}$
% rozkladu (BSK/TKS).100	D1 (a1)
	D2 (a2)
	průměr*

* pokud je mezi D₁ a D₂ výrazný rozdíl nemůže být počítán jejich průměr
Poznámka: Obdobný formulář může být použit pro referenční látku a pro kontrolu toxicity.

6. OPRAVA NA NITRIFIKACI (Viz příloha 5)

Den	0	28	Rozdíl
(i) Koncentrace dusičnanů (mg N.l-1)			(N)
(ii) Kyslíkový ekvivalent (4,57.N.V) (mg)	-	-
(iii) Koncentrace dusitanů (mg N.l-1)			(N)
(iv) Kyslíkový ekvivalent (3,43.N.V) (mg)	-	-
(ii + iv) Celkový kyslíkový ekvivalent	-	-

7. ANALÝZA UHLÍKU (nepovinná)
Analyzátor uhlíku:

Čas (dny)	Slepý pokus (mg.l-1)	Zkoušená látka (mg.l-1)
0	(CSPO)	(C0)
28*	(CSPt)	(Ct)
* nebo na konci inkubace

$\%odstr.DOC=1-\frac{C_t-C_{SPt}}{C_0-C_{SP0}}.100$

8. ROZKLAD VÝCHOZÍ LÁTKY (nepovinně)
S_b = koncentrace ve fyzikálně - chemické kontrole (sterilní) po 28 dnech
S_a = koncentrace v inokulované nádobě po 28 dnech
$\%BR=\frac{S_b-S_a}{S_b}.100$
kde
% BR = biologický rozklad výchozí látky vyjádřený v %.

9. ABIOTICKÝ ROZKLAD
a = spotřeba kyslíku ve sterilní kontrole po 28 dnech, (mg)
$spotřebakyslíkunamgchemickélátky=\frac{a}{C_{c}V}$
(viz část 1 a 3)
$\%abiotickéhorozkladu=\frac{a.100}{C_{0}V.TSK}$

IV. E ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH

VI. 1. PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY
Roztok zkoušené látky, obvykle 2 - 5 mg.l^-1 v minerálním médiu, se inokuluje malým množstvím směsné kultury a udržuje se ve zcela naplněných uzavřených lahvích, bez přístupu světla, při konstantní teplotě.
Rozklad se sleduje analýzou rozpuštěného kyslíku v průběhu 28 dnů. Množství spotřebovaného kyslíku po korekci na slepý pokus, který se provádí paralelně, se vyjadřuje jako procento TSK nebo CHSK.

VI. 2 POPIS METODY

VI. 2. 1 Přístroje

a) BSK lahvičky se sponkami, 250 - 300 ml.

b) Vodní lázeň nebo inkubátor, ve kterých se lahvičky udržují při konstantní teplotě (± 1 °C nebo lepší) za nepřístupu světla.

c) Velké skleněné lahve 2 - 5 l pro přípravu média a pro naplnění lahviček.

d) Kyslíková elektroda a oximetr nebo vybavení a chemikálie pro Winklerovu metodu.

VI. 2. 2 Příprava minerálního média
Zásobní roztoky se připravují podle I. 6. 2.
Smíchá se 1 ml roztoků (a) až (d) a doplní se do 1 l zřeďovací vodou.

VI. 2. 3 Příprava inokula
Inokulum se běžně získává z odtoku z biologické čistírny nebo z laboratorní jednotky, které čistí převážně komunální odpadní vody. Alternativním zdrojem inokula může být povrchová voda. Běžně se užívá jedna kapka až 5 ml filtrátu na 1 l média. Vhodné množství inokula se musí vyzkoušet (viz. I. 6. 4. 2 a I. 6. 5)

VI. 2. 4 Příprava lahví
Minerální médium se silně provzdušňuje po dobu 20 minut. V jedné zkoušce je nutné použít jedno minerální médium. Obecně je médium připraveno pro práci po 20 h stání při pracovní teplotě. Pro kontrolu se stanoví obsah kyslíku v médiu. Jeho obsah by měl být okolo 9 mg.l^-1 při 20 °C. Všechny operace s médiem nasyceným vzduchem se provádí tak, aby nevznikly bublinky, např. se použije sifon.
Připravují se paralelní skupiny BSK lahviček pro simultánní měření zkoušené látky a referenční látky. Připraví se dostatečný počet lahviček, včetně slepých pokusů tak, aby v každém zvoleném časovém intervalu např. 0, 7, 14, 21 a 28 dnů byly k dispozici vždy alespoň 2 lahvičky. K tomu, aby bylo možné určit 10 denní okno je potřeba více lahviček.
Do velkých lahví se do 1/3 naplní provzdušněné médium, pak se přidá zásobní roztok zkoušené látky a referenční látky do zvláštní lahve tak, aby konečná koncentrace látek byla max. 10 mg.l^-1. Slepý pokus se nasazuje bez zkoušené a referenční látky.
Ke zjištění, zda aktivita inokula není limitující, nesmí koncentrace kyslíku v lahvičkách klesnout pod 0,5 mg.l^-1. Toto omezuje koncentraci zkoušené látky na 2 mg.l^-1. Ovšem pro látky těžce rozpustné ve vodě a s nízkou TSK lze použít koncentraci 5 - 10 mg.l^-1. V některých případech lze doporučit provádět paralelně měření při 2 koncentracích studované látky např 2 a 5 mg.l^-1. Běžně se TSK počítá pro tvorbu amonných solí, ale v případech, kdy se předpokládá nitrifikace, počítá se TSK pro tvorbu dusičnanů (viz příloha 2). V případech, kdy nitrifikace není úplná, počítá se korekce z analytických koncentrací dusičnanů.
V případě, že zkoušená látka je toxická (např. v případě dříve zjištěné nízké biologické rozložitelnosti), musí se nasadit nové série lahviček.
Nasazuje se za stejných podmínek jako v předchozím případě.
Roztok ve velkých lahvích se inokuluje odtokem z biologické čistírny (1 kapka až 5 ml) nebo jiným inokulem jako např. říční vodou (viz I. 6. 4. 2). Nakonec se lahve doplní na objem provzdušněným médiem a s pomocí hadičky, která sahá na dno, se připraví homogenní roztok.

VI. 2. 5 Počet lahviček běžného pokusu
V běžném pokusu se používají následující lahvičky:
nejméně 10 se zkoušenou látkou a inokulem,
nejméně 10 jen s inokulem,
nejméně 10 s obsahem referenční látky a inokulem
a dále, je-li to zapotřebí 6 lahviček obsahujících zkoušenou látku, referenční látku a inokulum (kontrola toxicity). Pro zjištění 10 denního okna je zapotřebí dvojnásobný počet lahviček.

VI. 2. 6 Provedení zkoušky
Připravený roztok se ihned po přípravě plní do příslušné skupiny lahviček a to ze spodní čtvrtiny lahve (nikoliv ze dna), tak, aby se všechny lahvičky úplně naplnily. Jemně se poklepe, aby se odstranily bublinky. Lahvičky určené pro počátek pokusu se ihned analyzují na obsah kyslíku Winklerovou metodou nebo pomocí oximetru. Obsah lahviček lze konzervovat pro pozdější analýzu přídavkem síranu manganatého a hydroxidu sodného. Takto fixované lahvičky, které obsahují hnědě zbarvené hydratované oxidy Mn³⁺ se skladují na temném místě při teplotě 10 - 20 °C nejdéle po dobu 24 h. Zbývající lahvičky se uzavřou (bez bublinek) a inkubují se při 20 °C ve tmě. Každá série musí být doprovázena slepým pokusem, který kontroluje inokulum.
V duplicitních lahvičkách se nejméně 1x týdně stanovuje kyslík a to po celou dobu 28 dnů.
Týdenní vzorky umožňují stanovení 14 denního okna, kdežto vzorky každé 3 - 4 dny dovolují stanovit 10 denní okno, což vyžaduje dvojnásobný počet lahviček.
Pro látky, které obsahují dusík se musí provést korekce na nitrifikaci. To se provádí tak, že se změří kyslík pomocí oximetru a pak se stanoví dusičnany a dusitany. Spotřeba kyslíku na tuto oxidaci se počítá podle přílohy 5.

VI. 3 VÝSLEDKY A ZPRÁVA

VI. 3. 1 Zpracování výsledků
Nejprve se vypočte BSK po každé časové periodě tak, že se odečte spotřeba kyslíku v mg.l^-1 slepého pokusu od spotřeby se zkoušenou látkou. Takto získaný výsledek se dělí koncentrací zkoušené látky a tím se získá specifická BSK v mg kyslíku na mg látky. Pak se vypočítá procentní biologická rozložitelnost jako podíl specifické BSK a specifické TSK (počítané podle přílohy 2. 2) nebo CHSK (stanovené analyticky podle přílohy 2. 3).
$BSK=\frac{mg{O}_{2}zk.l.-mg{O}_{2}sl.p.=mgkyslíkunamglatky}{mgzk.l.vlahvi}$
$\%rozkladu=\frac{BSKmgkyslíkunamgzk.l.}{TSKmgkyslíkunamgzk.l.}.100$
nebo
$\%rozkladu=\frac{BSK(mgkyslíkunamgzk.l.)}{CHSK(mgkyslíkunamgzk.l.)}.100$
kde
zk. l. = zkoušená látka,
sl. p. = slepý pokus.
Je potřeba podotknout, že tyto dvě metody neposkytují nezbytně stejné výsledky. Upřednostnit by se měla metoda s použitím TSK.
Pro zkoušenou látku obsahující dusík se používá vhodná TSK (NH₄ nebo NO₃) podle toho, co se ví nebo očekává o výskytu nitrifikace (viz příloha 5). V případě, že se nitrifikace vyskytuje, ale není úplná, koriguje se spotřeba kyslíku podle analytických koncentrací dusitanů a dusičnanů.

VI. 3. 2 Platnost výsledků
Spotřeba kyslíku ve slepých pokusech nesmí být vyšší než 1,5 mg.l^-1 po 28 dnech. Vyšší hodnoty vyžadují prozkoumání použité experimentální techniky. Zbytková koncentrace kyslíku v lahvičkách nesmí být nižší než 0,5 mg.l^-1 v jakémkoliv časovém úseku zkoušky. Tyto kyslíkové hladiny jsou platné jen v případě, že metoda, jíž se stanovuje kyslík, je schopná tyto koncentrace přesně měřit.
Viz také část I.5.2.

VI. 3. 3 Závěrečná zpráva
Viz I.8.

VI. 4 PŘEHLED VÝSLEDKŮ
Příklad uspořádání výsledků může být následující:
ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH

1. LABORATOŘ

2. DATUM ZAČÁTKU ZKOUŠKY

3. ZKOUŠENÁ LÁTKA
Název:
Koncentrace zásobního roztoku: mg.l^-1
Počáteční koncentrace v lahvičce: mg.l^-1
TSK nebo CHSK: mg O₂.mg zkoušené látky^-1

4. INOKULUM
Zdroj:
Úprava:
Předúprava v případě, že byla použita:
Koncentrace v reakční směsi: mg/l

5. PROVEDENÁ STANOVENÍ
Metoda: Winkler / oximetr

			Stanoveno (mg.l-1)
			0	n1	n2
Slepý pokus	1	C1
	2	C2
Průměr	$m_b=\frac{C_1+C_2}{2}$
Zkoušená látka	1	a1
	2	a2
Průměr	$m_t=\frac{a_1+a_2}{2}$

Poznámka: Podobný vzor může být použit i pro referenční látku a pro kontrolu toxicity.

6. OPRAVA NA NITRIFIKACI

Doba inkubace	0	n1	n2	n3
(i) Koncentrace dusičňanů (mg N.l-1)
(ii) Změna koncentrace dusičňanů (mg N.l-1)
(iii) Kyslíkový ekvivalent (mg N.l-1)
(iv) Koncentrace dusitanů (mg N.l-1)
(v) Změna v koncentraci dusitanů (mg N.l-1)
(vi) Kyslíkový ekvivalent (mg N.l-1)
(iii + vi) Celkový kyslíkový ekvivalent (mg N.l-1)

7. DOSAŽENÉ ODSTRANĚNÍ: % ROZKLADU

	Odstranění po n dnech (mg.l-1)
	n1	n2	n3
Lahev 1: (mto - mtx) - (mbo - mbx)
Lahev 2: (mto - mtx) - (mbo - mbx)
Lahev 1: $\%D_1=\frac{m_{\mathrm{to}}-m_{\mathrm{tx}}-m_{\mathrm{bo}}-m_{\mathrm{bx}}.100}{\mathrm{konc}.\mathrm{ve}\mathrm{zk}·\mathrm{TSK}}$
Lahev 2: $\%D_2=\frac{m_{\mathrm{to}}-m_{\mathrm{tx}}-m_{\mathrm{bo}}-m_{\mathrm{bx}}.100}{\mathrm{konc}\mathrm{ve}\mathrm{zk}.·\mathrm{TSK}}$
$\%D\mathrm{prùm}.=\frac{D_1+D_2}{2}$

Průměr nelze počítat v případě velkých diferencí replikátů.
m_to = hodnota ve zkušební lahvičce v čase 0
m_x = hodnota ve zkušební lahvičce v čase x
m_bo = hodnota slepého pokusu v čase 0
m_bx = hodnota slepého pokusu v čase x
Uplatní se všechny korekce na nitrifikaci iii + vi z části 6.

8. SPOTŘEBA KYSLÍKU VE SLEPÉM POKUSU
Spotřeba kyslíku ve slepém pokusu je (mb_o - mb₂₈) v mg.l^-1. Tato spotřeba je důležitá pro platnost zkoušky. Měla by být menší než 1,5 mg.l^-1.

IV. F ZKOUŠKA MITI

VII. 1 PRINCIP METODY
Měření spotřeby kyslíku míchaného roztoku nebo suspenze zkoušené látky v minerálním médiu, které je inokulováno speciální kulturou neadaptovaných mikroorganismů je prováděno automaticky po dobu 28 dnů ve stíněném uzavřeném respirometru při 25 ± 1 °C. Uvolněný CO₂ je absorbován v hydroxidu sodném. Biologická rozložitelnost je vyjádřena jako procentický úbytek kyslíku (korigovaný slepým pokusem) teoretické spotřeby kyslíku (TSK). Procento primární biologické rozložitelnosti lze také počítat z doprovodné chemické analýzy provedené na začátku a na konci inkubace, případně podle analýzy DOC.

VII. 2. POPIS METODY

VII. 2. 1 Přístroje

a) automatický elektrolytický měřič BSK nebo respirometr vybavený 6 baňkami, každá objemu 300 ml s uzávěry, které umožňují absorbci CO₂,

b) místnost s konstatní teplotou nebo vodní lázeň s teplotou 25 ± 1 ° C,

c) zařízení pro filtraci s membránovými filtry (nepovinně),

d) analyzátor CO₂ (nepovinně).

VII. 2. 2 Příprava minerálního média
Vždy 3 ml dále uvedených roztoků a, b, c, a d se doplní deionizovanou vodou na objem 1000 ml.

a)	Hydrogenfosforečnan draselný K2HPO4						21,75 g,
	dihydrogenfosforečnan draselný KH2PO4						8,50 g,
	dodekahydrát hydrogenfosforečnanu sodného Na2HPO4. 12 H2O						44,60 g,
	chlorid amonný NH4Cl se rozpustí v 1000 ml vody. Hodnota pH by měla být 7,2.						1,70 g
b)	Heptahydrát síranu hořečnatého MgSO4. 7 H2O se rozpustí v 1000 ml vody.						22,50 g
c)	Chlorid vápenatý CaCl2 se rozpustí v 1000 ml vody.						27,50 g
d)	hexahydrát chloridu železitého FeCl3 . 6H2O se rozpustí v 1000 ml vody.						0,25 g

VII. 2. 3 Příprava inokula
Odeberou se vzorky z nejméně deseti lokalit, kde se používají a vypouštějí různé chemikálie. Z míst jako jsou čistírny městských a průmyslových odpadních vod, řek, jezer a moří se odebírá l litr kalu, povrchových půd, vody a j., které se pečlivě smíchají. Po odstranění vyflotovaných látek a odstátí se pH supernatantu upraví na 7 ± 1 hydroxidem sodným nebo kyselinou fosforečnou. Do práce se bere vhodný objem tohoto filtrovaného supernatantu a naplní se jím nádoba, která se 23,5 h provzdušňuje. Třicet minut po ukončení provzdušňování se odlije 1/3 objemu a doplní stejným objemem rozoku, který obsahuje vždy po 0,1 % glukosy, peptonu a hydrogenfosforečnanu draselného a obnoví se provzdušňování. Tento postup se opakuje jednou denně. Kalová jednotka musí být provozovaná podle zásad dobré laboratorní praxe: odtok musí být čirý, teplota musí být udržovaná při 25 ± 2 °C, pH má být 7 ± 1, kal má dobře sedimentovat, provzdušňování musí být dostatečné za všech okolností, mají být přítomni provoci a aktivita kalu se má kontrolovat pomocí referenční látky nejméně každé 3 měsíce. Takto získané inokulum se nepoužívá dříve než po 1 měsíci kultivace a déle než po čtyřech měsících. Proto je nutné odebírat vzorky ze zvolených 10 míst každé 3 měsíce.
K udržení stejné aktivity čerstvého a starého kalu se filtrovaný supernatant starého kalu smíchává se stejným objemem nového kalu a směs se kultivuje podle popsaného postupu. Do práce se kal bere 18 - 24 h po přídavku živin.

VII. 2. 4 Příprava baněk
Připravuje se 6 baněk podle schematu:
č. 1 zkoušená látka ve zřeďovací vodě 100 mg.l^-1
č. 2, 3, 4 zkoušená látka v minerálním médiu 100 mg.l^-1
č. 5 referenční látka (např. anilin) v minerálním médiu 100 mg.l^-1
č. 6 minerální médium
Málo rozpustné látky se přidávají přímo odvážením nebo odměřením objemu nebo se zpracují jak je uvedeno v příloze č. 3, s výjimkou těch, u kterých nemohou být použita rozpouštědla nebo emulgátory. Do speciálních uzávěrů lahví se přidá absorbent oxidu uhličitého. pH v baňkách č. 2, 3 a 4 se upraví na 7,0.

VII. 2. 5 Provedení zkoušky
Baňky č. 2, 3, 4 (zkušební suspenze), č. 5 (kontrola aktivity), č. 6 (slepý pokus) se inokulují malým množstvím inokula tak, aby výsledná koncentrace kalu byla 30 mg.l^-1. Láhev č. 1 je bez inokula, čímž se získává abiotická kontrola.Nasadí se zátka, zkontroluje se těsnost, zapnou se míchadla a započne se s měřením úbytku kyslíku za stíněných podmínek. Denně se kontroluje teplota, míchání, zapisovač spotřeby kyslíku a zaznamenávají se všechny změny barvy obsahu láhve. Při využití 6 křivkového zapisovače se získává přímo křivka BSK. Na konci inkubace, která je obvykle 28 dní, měří se pH v láhvi a stanovuje zbytková koncentrace zkoušené látky a jejich metabolitů a v případě zkoušení látek rozpustných ve vodě také DOC (postup podle přílohy 2). V případě těkavých látek se používá speciální postup. V případě výskytu nitrifikace se stanovují, jestliže je to možné, dusičnany a dusitany.

VII. 3. DATA A ZPRÁVA

VII. 3. 1 Zpracování výsledků
Spotřeba kyslíku zkoušenou látkou za daný čas v mg, korigovaná slepým pokusem za stejnou dobu, se dělí hmotností zkoušené látky v pokusu. Tento postup poskytuje výsledek vyjádřený jako spotřeba kyslíku v mg.mg^-1 zkoušené látky, což je:
$BSK=\frac{mg{0}_{2}zk.l.-mg{O}_2(sl.p.)}{mgzk.l.}=mg{O}_2/mgzk.l.$
kde
zk. l. = zkoušená látka,
sl. p. = slepý pokus,
m = hmotnost zkoušené látky.
Procentický biologický rozklad se získá ze vztahu:
$\%biol.rozkladu=\%TSK=\frac{BSK}{TSK}.100$
Pro směsi se TSK vypočítává z elementární analýzy, tak jako pro jednoduché látky. Dosazuje se odpovídající TSK pro NH₄ a NO₃ podle toho, zda se úplná nitrifikace vyskytuje či ne. V případě neúplné nitrifikace se vychází ze změn koncentrace NO₃ a NO₂ podle přílohy 5.
Spočítá se procento primárního biologického rozkladu z úbytku původní chemické látky (viz I.7.2)
$D_t=\frac{S_b-S_a}{S_b}.100\%$
V případě, že se v lahvi č. 1 zjistí fyzikálně-chemický úbytek původní látky zaznamená se tento jev a za koncentraci zkoušené látky (S_b) po 28 dnech se dosadí tato koncentrace.
V případě stanovení DOC (nepovinné) se úplná procentická biologická rozložitelnost počítá ze vztahu:
$D_t=1-\frac{C_t-C_{bt}}{C_0-C_{bo}}.100$
Jestliže byl zjištěn úbytek DOC v láhvi č. 1, která měří abiotický rozklad, pak se do výpočtu dosazuje koncentrace DOC zjištěná v této láhvi.
Všechny výsledky se zaznamenají do souhrnu, jehož vzor je přiložen.

VII. 3. 2 Platnost výsledků
Slepý pokus mívá spotřebu kyslíku inokulem 20 - 30 mg.l^-1 a neměl by být větší než 60 mg.l^-1 v průběhu 28 dnů. Hodnoty větší než 60 mg.l^-1 vyžadují kritické vyhodnocení získaných dat a experimentální techniky. V případě, že pH je mimo rozsah 6 - 8,5 a spotřeba kyslíku zkoušenou látkou je menší než 60 %, zkouška by měla být opakována s nižší koncentrací látky.
Viz také I.5.2.
V případě, že rozklad anilinu, vypočítaný ze spotřeby kyslíku, nedosáhne 40 % po 7 dnech a 65 % po 14 dnech, je nutné zkoušku považovat za neplatnou.

VII. 3. 3 Zpráva
Viz I.8.

VII. 4 PŘEHLED VÝSLEDKŮ
Příklad uspořádání je uveden dále:
MITI (I) ZKOUŠKA

1. LABORATOŘ

2. DATUM ZAHÁJENÍ POKUSU

3. ZKOUŠENÁ LÁTKA
Název:
Koncentrace zásobního roztoku: mg.l^-1 jako látka
Počáteční koncentrace v médiu, Co: mg.l^-1 jako látka
Objem reakční směsi, V: ml
TSK: mg O₂.l^-1

4. INOKULUM

Lokality, odkud byly získány vzorky:
1) ...	6) ...
2) ...	7) ...
3) ...	8) ...
4) ...	9) ...
5) ...	10) ...

Koncentrace suspendovaných látek v aktivovaném kalu po aklimatizaci na syntetické splašky = ... mg.l^-1.
Objem aktivovaného kalu v konečném médiu = . . . ml
Koncentrace kalu v konečném médiu = . . . mg.l^-1

5. SPOTŘEBA KYSLÍKU: BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST
Typ použitého respirometru:

			Čas (dny)
			0	7	14	21	28
spotřeba kyslíku (mg) zkoušenou látkou	a1
	a2
	a3
spotřeba kyslíku (mg) ve slepém pokuse	b
opravená spotřeba kyslíku (mg)	(a1 - b) (a2 - b) (a3 - b)
BSK na mg zkoušené látky	$\frac{a-b}{C_{o}V}$	Lahev 1
		Lahev 2
		Lahev 3
% rozkladu		1
		2
$\frac{\mathrm{BSK}}{\mathrm{TSK}}.100$		3
		průměr*

Poznámka: Podobný vzor může být použit pro referenční látku
* neprůměrovat, jestliže jsou mezi jednotlivými měřeními velké rozdíly

6. ANALÝZA UHLÍKU (nepovinně)
Analyzátor uhlíku:

Baňka	DOC				% odstraněného DOC	Průměr
	Změřeno		Opraveno
Voda + zkoušená látka	a				-	-
Kal + zkoušená látka	b1		b1 - c
Kal + zkoušená látka	b2		b2 - c
Kal + zkoušená látka	b3		b3 - c
Slepý pokud	c				-	-

7. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA

	Zbytek zkoušené chemikálie na konci zkoušky	% rozkladu
slepý pokus	Sb
inokulované medium	Sa1
	Sa1
	Sa3

% rozkladu = [(S_b- S_a)/S_b].100
Počítá se pro lahve č. a1, a2, a3.

8. POZNÁMKY
Je-li k dispozici, může být připojena křivka BSK v závislosti na čase.

IV STANOVENÍ SNADNÉ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI

I OBECNÉ ÚVAHY

I. 1 ÚVOD
Je popsáno šest zkušebních metod, které umožňují vyhledávací posouzení snadné biologické rozložitelnosti chemických látek v aerobním vodním prostředí:
Obecné a společné úvahy pro všech šest zkoušek jsou uvedeny v části I metody. Specifické body jednotlivých metod jsou uvedeny v částech II až VII. Přílohy obsahují definice, vzorce a orientační poznámky.
Mezilaboratorní srovnávací pokus OECD, provedený v roce 1988, ukázal, že uvedené metody poskytují shodné výsledky. V závislosti na fyzikálním charakteru zkoušené látky však může být v daném případě nejvhodnější určitá konkrétní metoda.

(A) Úbytek rozpuštěného organického uhlíku (DOC)

(B) Modifikovaná vyhledávací zkouška OECD - úbytek DOC

(C) Uvolňování oxidu uhličitého (CO₂) (modifikovaná Sturmova zkouška)

(D) Manometrická respirometrie

(E) Zkouška v uzavřených lahvičkách

(F) Zkouška MITI (Ministerstvo zahraničního obchodu a průmyslu - Japonsko)

I. 2 VÝBĚR VHODNÉ METODY
Pro volbu nejvhodnější metody jsou nezbytné informace o rozpustnosti, o tenzi par a o adsorpční charakteristice dané chemické látky. Pro výpočet teoretických hodnot a ověření naměřených hodnot parametrů, např. TSK, TCO₂ , DOC, TOC, CHSK (viz přílohy 1 a 2) je nutné znát chemickou strukturu nebo vzorec.
Zkoušené chemické látky, jejichž rozpustnost ve vodě činí alespoň 100 mg.l_-1, je možné zkoušet všemi metodami za předpokladu, že jsou netěkavé a neadsorbují se. Pro látky málo rozpustné ve vodě, těkavé nebo adsorbovatelné jsou vhodné metody uvedeny v tabulce 1. Způsob, kterým je třeba zacházet s látkami málo rozpustnými ve vodě a těkavými, je popsán v příloze 3. Mírně těkavé látky je možné zkoušet metodou úbytku DOC, pokud ve zkušebních nádobách (které musí být vhodně uzavřeny) existuje dostatečně velký prostor pro plyn. V tomto případě musí být provedena abiotická kontrola pro podchycení případné fyzikální ztráty.
Pro interpretaci získaných výsledků, zejména pokud jsou výsledky nízké nebo marginální, se vyžadují informace o čistotě nebo relativních podílech hlavních složek zkoušeného materiálu.
Pro volbu vhodných koncentrací pro zkoušku mohou být velmi užitečné informace o toxicitě zkoušené chemické látky pro bakterie (příloha 4). Tyto informace mohou mít zásadní význam pro správnou interpretaci nízkých hodnot biologického rozkladu.
Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod

Zkušební metoda	Analytická metoda	Vhodnost pro látky
		málo rozpustné	těkavé	absorbující
IV - A	DOC	-	-	+/-
IV - B	DOC	-	-	+/-
IV - C	Respirometrie: vývin CO2	+	-	+
IV - D	Manometrická respirometrie: vývin CO2	+	+/-	+
IV - E	Respirometrie: rozpuštěný kyslík	+/-	+	+
IV - F	Respirometrie: spotřeba kyslíku	+	+/-	+

I. 3 REFERENČNÍ LÁTKY
Pro ověření postupu se zkoušejí souběžně se studovanou látkou referenční chemické látky, které splňují kritéria snadné biologické rozložitelnosti.
Vhodnými chemickými látkami jsou anilin (čerstvě předestilovaný), octan sodný a benzoan sodný. Tyto referenční chemické látky se uvedenými metodami všechny rozkládají i když se záměrně nepřidá žádné inokulum.
Bylo navrženo hledat referenční chemickou látku, která by byla pohotově rozložitelná, avšak vyžadovala by přidání inokula. Byl navržen hydrogenftalát draselný. O této látce je třeba ještě získat více údajů, než ji bude možné přijmout jako referenční látku.
V respirometrických zkouškách mohou příjem kyslíku ovlivnit látky obsahující dusík v důsledku nitrifikace (viz přílohy 2 a 5).

I. 4 PRINCIP ZKUŠEBNÍCH METOD
Roztok nebo suspenze zkoušené látky v minerálním prostředí se naočkuje a inkubuje v aerobních podmínkách v temnu nebo v difúzním světle. Množství DOC připadající ve zkoušeném roztoku na inokulum je třeba udržovat ve srovnání s DOC připadajícím na zkoušenou látku co nejnižší. Endogenní aktivita inokula se zohlední na základě paralelní slepé zkoušky s inokulem, avšak bez zkoušené látky. Přitom endogenní aktivita buněk v přítomnosti zkoušené látky neodpovídá přesně aktivitě v endogenní kontrolní zkoušce. Za účelem kontroly postupu se provádí souběžně zkouška s referenční látkou.
Obecně řečeno po rozkladu následuje stanovení parametrů jako DOC, tvorba CO₂ a příjem kyslíku. Měření se provádí v dostatečně častých intervalech, aby bylo možné identifikovat začátek a konec biologického rozkladu. Měření automatickými respirometry je kontinuální. Někdy se měří doplňkově k jinému parametru DOC, avšak obvykle pouze na začátku a na konci zkoušky. Je rovněž možné použít specifickou chemickou analýzu, kterou se vyhodnotí primární rozklad zkoušené látky nebo se stanoví koncentrace kteréhokoli vzniklého meziproduktu (ve zkoušce MITI povinné).
Zkouška normálně trvá 28 dní. Měření je však možné ukončit před uplynutím 28 dní, tj. jakmile křivka biologického rozkladu dosáhla na základě nejméně tří stanovení fáze vodorovného průběhu. Měření je také možné prodloužit i po 28 dnech, vyplývá-li z křivky, že biologický rozklad začal, avšak že v 28. den nebylo ještě dosaženo vodorovné části křivky.

I. 5 KRITÉRIA KVALITY

I. 5. 1 Reprodukovatelnost
Vzhledem k charakteru biologického rozkladu a směsných populací bakterií používaných jako inokula je nutné provádět stanovení nejméně dvojmo.
Je běžnou zkušeností, že čím vyšší je koncentrace mikroorganizmů přidaných na počátku do zkušebního média, tím menší jsou rozdíly mezi replikovanými měřeními. Okružní zkoušky rovněž ukázaly, že mezi výsledky získanými různými laboratořemi mohou být velké rozdíly, avšak u snadno biologicky rozložitelných sloučenin se obvykle dosahuje dobré shody.

I. 5. 2 Platnost zkoušky
Zkouška se považuje za platnou, je-li rozdíl krajních hodnot výsledků replikovaných měření rozkladu zkoušené látky na vodorovné části křivky, buď na konci zkoušky nebo na konci 10-denního okénka, podle toho, která z těchto eventualit přichází v úvahu, menší než 20 %, a dosáhl-li procentuální stupeň rozkladu referenční látky úrovně snadné biologické rozložitelnosti do 14 dní. Není-li splněna kterákoli z těchto podmínek, je nutné měření opakovat. Vzhledem k náročnosti metod neznamenají nízké hodnoty nutně, že studovaná látka není v podmínkách životního prostředí biologicky rozložitelná, ale ukazují, že k zajištění biologického rozkladu je třeba více práce.
Jestliže ve zkoušce toxicity, zahrnující jak studovanou látku, tak referenční chemickou látku, došlo během 14 dnů k méně než 35 % rozkladu (na bázi DOC) nebo k méně než 25 % rozkladu (na bázi TSK nebo TCO₂), je možné zkoušené chemické látky považovat za inhibující (viz také přílohu 4. Sérii měření je třeba opakovat, pokud možno s nižší koncentrací studované chemické látky a (nebo) vyšší koncentrací inokula, avšak ne s koncentrací vyšší než 30 mg tuhých látek v litru.

I. 6 VŠEOBECNÉ POSTUPY A PŘÍPRAVY
Obecné podmínky pro zkoušky jsou přehledně uvedeny v tabulce 2. Aparatury a další experimentální podmínky, specifické pro jednotlivé metody, jsou popsány dále v kapitolách pro tyto příslušné metody.

I. 6. 1 Zřeďovací voda
Používá se deionizovaná nebo destilovaná voda, prostá inhibujících koncentrací toxických látek (např. iontů Cu^-). Voda smí obsahovat nejvýše 10 % obsahu organického uhlíku, vneseného zkoušenou látkou. Aby se vyloučily vysoké hodnoty ve slepých pokusech je nutná vysoká čistota vody pro zkoušky. Ke kontaminaci může dojít přítomnými nečistotami ze studované látky a z iontoměnných pryskyřic a rozkladnými látkami z bakterií a řas. Pro každou sérii měření je třeba používat pouze jednu šarži vody, která byla předem překontrolována analýzou DOC. Tato kontrola není nutná u zkoušky v uzavřených lahvičkách, spotřeba kyslíku vodou však musí být nízká.
Tabulka 2: Experimentální podmínky v jednotlivých zkouškách

Zkouška	Úbytek DOC	Uvolňování CO2	Manometrická respirometrie	Modifikovaná vyhledávací OECD zkouška	Uzavřené lahvičky	Zkouška MITI (I)
	C 4. - A	C 4. - C	C 4. - D	C 4. - B	C 4. - E	C 4. - F
Koncentrace zkoušené látky:
mg.l-1			100		2 - 10	100
mg DOC.l-1	10 - 40	10 - 20		10 - 40
mg ThOD.l-1			50 - 100		5 - 10
Koncentrace inokula	≤ 30 mg.-1l SL nebo ≤ 100 ml výtoku.l-1			0,5 ml sekund. výtoku.l-1	≤ 5 ml výtoku.l-1	30 mg.l-1 SL
(buňky.l-1)		(107 - 108)		(105)	(104 - 106)	(107 - 108)
Koncentrace prvku v minerálním médiu (mg.l-1)
P	116				11,6	29
N	1,3				0,13	1,3
Na	86				8,6	17,2
K	122				12,2	36,5
Mg	2,2				2,2	6,6
Ca	9,9				9,9	29,7
Fe	0,05 - 0,1				0,05 - 0,1	0,15
pH	7,4 ± 0,2					nejlépe 7,0
teplota	22 ± 2 °C					25±1 °C
DOC = rozpuštěný organický uhlík			SL = suspendované látky
ThOD = teoretická spotřeba kyslíku

I. 6. 2 Zásobní roztoky minerálních složek
Pro přípravu zkušebních roztoků se připravují zásobní roztoky o vhodných koncentracích minerálních složek. Níže uvedené zásobní roztoky je možné použít (při různých zřeďovacích faktorech) pro metody úbytku DOC, pro modifikovanou vyhledávací metodu OECD, pro metodu uvolňování CO₂, pro manometrickou respirometrii a pro uzavřené láhvičky.
Zřeďovací faktory a specifická příprava minerálního media pro zkoušku MITI jsou uvedeny v kapitolách pro jednotlivé zkoušky.
Zásobní roztoky:
Zásobní roztoky se připravují s použitím činidel analytické čistoty.
Poznámka: Aby nebylo nutné připravovat tento roztok bezprostředně před použitím, přidá se jedna kapka koncentrované kyseliny chlorovodíkové nebo 0,4 g disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) na 1 litr.

(a) dihydrogenorthofosforečnan draselný, KH₂PO₄ 8,50 g
monohydrogenorthofosforečnan didraselný, K₂ HPO₄, 21,75 g
dihydrátmonohydrogenorthofosforečnan disodný Na₂HPO ₄ .2H₂O 33,40 g
chlorid amonný, NH₄Cl 0,50 g
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. pH roztoku musí být 7,4.

(b) chlorid vápenatý bezvodý, CaCl ₂ 27,50 g
nebo dihydrát chloridu vápenatého, CaCl ₂.2H₂O 36,40 g
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

(c) heptahydrát síranu hořečnatého, MgSO₄.7H₂O 22,50 g
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

(d) hexahydrát chloridu železitého, FeCl₃.6H₂O 0,25 g
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

I. 6. 3 Zásobní roztoky chemických látek
Pokud je rozpustnost vyšší než 1 g.l^-1, rozpustí se například 1 - 10 g (podle potřeby) zkoušené nebo referenční látky v deionizované vodě a doplní se na 1 litr. Jinak se připravují zásobní roztoky v minerálním médiu, nebo se chemická látka přidá přímo do minerálního média. Pokud se týká práce s méně rozpustnými chemickými látkami, viz přílohu 3. Ve zkoušce MITI (metoda IV-F) nelze používat ani rozpouštědla, ani emulgační činidla.

I. 6. 4 Inokula
Inokulum je možné získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod (nechlorovaných), z povrchových vod a půd, nebo jako jejich směsi. Používá-li se aktivovaný kal ve zkoušce úbytku DOC, uvolňování CO₂ a manometrické respirometrie, je třeba jej odebírat z čistírny nebo z laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. U inokulí z jiných zdrojů byl zjištěn větší rozptyl výsledků. V modifikované vyhledávací zkoušce OECD a ve zkoušce v uzavřených lahvičkách je třeba zředěnější inokulum bez vloček kalu. Nejvhodnějším zdrojem je voda z druhého stupně čistírny domovních odpadních vod nebo z laboratorní jednotky. Pro zkoušku MITI se inokulum získává ze směsi zdrojů a je popsáno v kapitole o této zkoušce.

I. 6. 4. 1 Inokulum z aktivovaných kalů
Je třeba odebrat čerstvý vzorek aktivovaného kalu z aerační nádrže čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. Je-li třeba, odstraní se hrubé částice filtrací jemným sítem a kal se udržuje v aerobních podmínkách.
Alternativním způsobem je odsazení nebo zcentrifugování (např. při 1 100 g po dobu 10 min.) po odstranění hrubých částic. Voda nad usazeninou se slije. Kal je možno promýt minerálním médiem. Koncentrovaný kal se suspenduje v minerálním médiu na koncentraci 3 - 5 g suspendovaných tuhých látek na litr a provzdušňuje se až do použití.
Kal je třeba odebrat z dobře pracující konvenční čistírny. Je-li nutné kal odebrat z čistírny s vysokým prosazením nebo předpokládá-li se, že obsahuje inhibitory, je třeba jej promýt. Znovu suspendovaný kal se po důkladném promíchání nechá usadit nebo se zcentrifuguje, voda nad usazeninou se slije a promytý kal se opět suspenduje v nové dávce minerálního média. Tento postup se opakuje, až se kal považuje za prostý přebytečného substrátu nebo inhibitoru.
Po dokonalém suspendování nebo z neupravovaného kalu se odebere těsně před použitím vzorek pro stanovení sušiny suspendovaných tuhých látek.
Další alternativou je homogenizace aktivovaného kalu (3 - 5 g suspendovaných látek v litru). Kal se zpracuje v mechanickém mísiči po dobu 2 min. při střední rychlosti. Promíchaný kal se nechá usadit po dobu 30 min nebo v případě potřeby déle a kapalina se slije pro použití jako inokulum v koncentraci 10 ml.l^-1 minerálního média.

I. 6. 4. 2. Jiné zdroje inokula
Inokulum je možné získat z výstupu druhého stupně čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky, pracujících převážně s domovními odpadními vodami. Odebere se čerstvý vzorek a během přepravy se udržuje v aerobních podmínkách. Nechá se po dobu 1 hodiny usadit nebo se zfiltruje přes hrubý filtrační papír a slitá kapalina nebo filtrát se udržuje v aerobních podmínkách až do použití. Tohoto typu inokula je možné použít až 100 ml na 1 litr média. Dalším zdrojem inokula je povrchová voda. V tomto případě se odebere vzorek vhodné povrchové vody, např. říční nebo jezerní, a uchovává se v aerobních podmínkách až do použití. V případě potřeby se inokulum zkoncentruje filtrací nebo zcentrifugováním.

I. 6. 5 Předběžné kondiciování inokula
Inokula je možné předběžně kondicionovat na experimentální podmínky, ale ne předběžně adaptovat na zkoušenou látku. Předběžná kondicionace spočívá v aeraci aktivovaného kalu v minerálním médiu nebo výstupu z druhého stupně čistírny po dobu 5 - 7 dní při teplotě zkoušky. Předběžné kondicionování někdy zlepší přesnost zkušebních metod snížením hodnot ze slepých pokusů. Předběžně kondicionovat inokulum MITI se nepovažuje za nutné.

I. 6. 6 Abiotické kontrolní zkoušky
V případě potřeby se kontroluje možný abiotický rozklad zkoušené látky stanovením úbytku DOC, příjmu kyslíku nebo tvorby oxidu uhličitého ve sterilních kontrolních pokusech bez inokula. Sterilizace se provádí filtrací membránou (0,2 - 0,45 µm) nebo přidáním vhodné toxické látky v příslušné koncentraci. Používá-li se membránové filtrace, odebírají se vzorky asepticky za účelem zachování sterility. Pokud nebyla předem vyloučena adsorpce zkoušené látky, musí zkoušky, kterými se sleduje biologický rozklad podle úbytku DOC, zejména při použití inokula z aktivovaného kalu, zahrnovat abiotický kontrolní pokus, který byl naočkován a intoxikován.

I. 6. 7 Počet nasazených baněk
Počet použitých nádob (nasazených pokusů) v typické zkoušce je uveden v kapitolách pro jednotlivé zkoušky.
Lze používat tyto typy nasazených nádob:
Zkoušená suspenze: obsahuje zkoušenou látku a inokulum
Slepá zkouška s inokulem: obsahuje pouze inokulum
Kontrola postupu: obsahuje referenční látku a inokulum
Abiotická sterilní kontrola: sterilní, obsahuje zkoušenou látku (viz 1.6.6)
Kontrola pro adsorpci: obsahuje zkoušenou látku, inokulum a sterilizační činidlo
Kontrola toxicity: obsahuje zkoušenou látku, referenční látku a inokulum
Stanovení ve zkoušené suspenzi a slepý pokus s inokulem se musí povinně provádět souběžně. Stanovení v ostatních nádobách se doporučuje provádět rovněž souběžně.
To však nemusí být vždy možné. Je třeba zajistit, aby se odebíral dostatečný počet vzorků nebo se prováděl dostatečný počet odečtů pro vyhodnocení procenta úbytku v 10-denním okénku.

I. 7 VÝSLEDKY A JEJICH VYHODNOCENÍ
Při výpočtu D_t , procentního úbytku, se používají střední hodnoty z dvojích měření daného parametru v obou zkušebních nádobách a ze slepého pokusu pro inokulum. Příslušné vzorce jsou uvedeny dále v kapitolách pro jednotlivé zkoušky. Průběh rozkladu se znázorní graficky a označí se 10-denní okénko. Vypočte a uvede se procentní úbytek dosažený na konci 10-denního okénka a hodnota pro vodorovnou část křivky nebo na konci zkoušky podle toho, která z nich je vhodnější.
V respirometrických zkouškách mohou látky obsahující dusík ovlivnit příjem kyslíku v důsledku nitrifikace (viz příloha 2 a 5).

I. 7. 1 Rozklad zjišťovaný na základě stanovení DOC
Za účelem posouzení platnosti zkoušky (viz I.5.2) se musí v každém časovém okamžiku, ve kterém se odebral vzorek, vypočítat odděleně pro každou nádobu obsahující zkoušenou látku, pomocí středních hodnot dvojic měření DOC, procentní rozklad, D_t,. Vypočte se podle rovnice:
$D_t=1-\frac{C_1-C_{bt}}{C_0-C_{bo}}.100$
kde:
D_t = procento rozkladu v čase t,
C_o = střední počáteční koncentrace DOC v naočkovaném kultivačním médiu obsahujícím zkoušenou látku (mg DOC.l^-1),
C_t = střední koncentrace DOC v naočkovaném kultivačním médiu obsahujícím zkoušenou látku v čase t (mg DOC.l^-1),
C_bo = střední počáteční koncentrace DOC ve slepém naočkovaném minerálním médiu (mg DOC.l^-1),
C_bt = střední koncentrace DOC ve slepém naočkovaném minerálním médiu v čase t (mg DOC.l^-1).
Všechny koncentrace se zjišťují experimentálně.

I. 7. 2 Rozklad měřený pomocí specifické analýzy
Je-li možné získat specifické analytické údaje, vypočte se primární biologický rozklad z rovnice:
$D_t=\frac{\left(S_{b-S_a}\right)}{S_b}.100$
kde:
D_t = procento rozkladu v čase t, obvykle 28 dní,
S_a = zbylé množství zkoušené látky v médiu s inokulem na konci pokusu (mg),
S_b = zbylé množství zkoušené látky ve slepém pokusu s vodou/médiem, do kterých byla přidána pouze zkoušená látka (mg).

I. 7. 3 Abiotický rozklad
Používá-li se abiotická sterilní kontrolní zkouška, vypočte se procentní abiotický rozklad podle rovnice:
$\%abiotickéhorozkladu=\frac{C_{s\left(o\right)}-C{s}_{\left(t\right)}}{C_{s\left(o\right)}}.100$
kde:
C_s(o) = koncentrace DOC ve sterilní kontrolní zkoušce v den 0
C_s(t) = koncentrace DOC ve sterilní kontrolní zkoušce v den t

I. 8 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol o zkoušce má obsahovat, je-li to možné, tyto údaje:
- zkoušená a referenční chemická látka, jejich čistota;
- podmínky při zkoušce;
- inokulum: charakter a místo (místa) odběru, koncentrace a předběžná kondicionace;
- podíl a charakter průmyslového odpadu obsaženého v odpadní vodě, jsou-li známy;
- doba trvání zkoušky a teplota;
- v případě málo rozpustných zkoušených látek použitý způsob zacházení;
- použitá metoda zkoušení; je třeba uvést vědecké důvody a vysvětlení pro každou změnu postupu;
- přehled dat;
- veškeré pozorované projevy inhibice;
- jakýkoliv pozorovaný abiotický rozklad;
- analytické údaje o meziproduktech, pokud existují;
- graf procentního rozkladu v závislosti na čase pro zkoušenou a referenční látku; je třeba zřetelně označit fázi zdržení, fázi rozkladu, 10-denní okénko a směrnici (příloha 1). Byla-li při zkoušce splněna kritéria kvality, je možné pro graf použít střední hodnotu procentního rozkladu v baňkách obsahujících zkoušenou látku;
- procentní rozklad po 10-denním okénku, na vodorovné části křivky a na konci zkoušky.