bod E · 299/1998 Sb.

IV. E ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH

VI. 1. PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY
Roztok zkoušené látky, obvykle 2 - 5 mg.l^-1 v minerálním médiu, se inokuluje malým množstvím směsné kultury a udržuje se ve zcela naplněných uzavřených lahvích, bez přístupu světla, při konstantní teplotě.
Rozklad se sleduje analýzou rozpuštěného kyslíku v průběhu 28 dnů. Množství spotřebovaného kyslíku po korekci na slepý pokus, který se provádí paralelně, se vyjadřuje jako procento TSK nebo CHSK.

VI. 2 POPIS METODY

VI. 2. 1 Přístroje

a) BSK lahvičky se sponkami, 250 - 300 ml.

b) Vodní lázeň nebo inkubátor, ve kterých se lahvičky udržují při konstantní teplotě (± 1 °C nebo lepší) za nepřístupu světla.

c) Velké skleněné lahve 2 - 5 l pro přípravu média a pro naplnění lahviček.

d) Kyslíková elektroda a oximetr nebo vybavení a chemikálie pro Winklerovu metodu.

VI. 2. 2 Příprava minerálního média
Zásobní roztoky se připravují podle I. 6. 2.
Smíchá se 1 ml roztoků (a) až (d) a doplní se do 1 l zřeďovací vodou.

VI. 2. 3 Příprava inokula
Inokulum se běžně získává z odtoku z biologické čistírny nebo z laboratorní jednotky, které čistí převážně komunální odpadní vody. Alternativním zdrojem inokula může být povrchová voda. Běžně se užívá jedna kapka až 5 ml filtrátu na 1 l média. Vhodné množství inokula se musí vyzkoušet (viz. I. 6. 4. 2 a I. 6. 5)

VI. 2. 4 Příprava lahví
Minerální médium se silně provzdušňuje po dobu 20 minut. V jedné zkoušce je nutné použít jedno minerální médium. Obecně je médium připraveno pro práci po 20 h stání při pracovní teplotě. Pro kontrolu se stanoví obsah kyslíku v médiu. Jeho obsah by měl být okolo 9 mg.l^-1 při 20 °C. Všechny operace s médiem nasyceným vzduchem se provádí tak, aby nevznikly bublinky, např. se použije sifon.
Připravují se paralelní skupiny BSK lahviček pro simultánní měření zkoušené látky a referenční látky. Připraví se dostatečný počet lahviček, včetně slepých pokusů tak, aby v každém zvoleném časovém intervalu např. 0, 7, 14, 21 a 28 dnů byly k dispozici vždy alespoň 2 lahvičky. K tomu, aby bylo možné určit 10 denní okno je potřeba více lahviček.
Do velkých lahví se do 1/3 naplní provzdušněné médium, pak se přidá zásobní roztok zkoušené látky a referenční látky do zvláštní lahve tak, aby konečná koncentrace látek byla max. 10 mg.l^-1. Slepý pokus se nasazuje bez zkoušené a referenční látky.
Ke zjištění, zda aktivita inokula není limitující, nesmí koncentrace kyslíku v lahvičkách klesnout pod 0,5 mg.l^-1. Toto omezuje koncentraci zkoušené látky na 2 mg.l^-1. Ovšem pro látky těžce rozpustné ve vodě a s nízkou TSK lze použít koncentraci 5 - 10 mg.l^-1. V některých případech lze doporučit provádět paralelně měření při 2 koncentracích studované látky např 2 a 5 mg.l^-1. Běžně se TSK počítá pro tvorbu amonných solí, ale v případech, kdy se předpokládá nitrifikace, počítá se TSK pro tvorbu dusičnanů (viz příloha 2). V případech, kdy nitrifikace není úplná, počítá se korekce z analytických koncentrací dusičnanů.
V případě, že zkoušená látka je toxická (např. v případě dříve zjištěné nízké biologické rozložitelnosti), musí se nasadit nové série lahviček.
Nasazuje se za stejných podmínek jako v předchozím případě.
Roztok ve velkých lahvích se inokuluje odtokem z biologické čistírny (1 kapka až 5 ml) nebo jiným inokulem jako např. říční vodou (viz I. 6. 4. 2). Nakonec se lahve doplní na objem provzdušněným médiem a s pomocí hadičky, která sahá na dno, se připraví homogenní roztok.

VI. 2. 5 Počet lahviček běžného pokusu
V běžném pokusu se používají následující lahvičky:
nejméně 10 se zkoušenou látkou a inokulem,
nejméně 10 jen s inokulem,
nejméně 10 s obsahem referenční látky a inokulem
a dále, je-li to zapotřebí 6 lahviček obsahujících zkoušenou látku, referenční látku a inokulum (kontrola toxicity). Pro zjištění 10 denního okna je zapotřebí dvojnásobný počet lahviček.

VI. 2. 6 Provedení zkoušky
Připravený roztok se ihned po přípravě plní do příslušné skupiny lahviček a to ze spodní čtvrtiny lahve (nikoliv ze dna), tak, aby se všechny lahvičky úplně naplnily. Jemně se poklepe, aby se odstranily bublinky. Lahvičky určené pro počátek pokusu se ihned analyzují na obsah kyslíku Winklerovou metodou nebo pomocí oximetru. Obsah lahviček lze konzervovat pro pozdější analýzu přídavkem síranu manganatého a hydroxidu sodného. Takto fixované lahvičky, které obsahují hnědě zbarvené hydratované oxidy Mn³⁺ se skladují na temném místě při teplotě 10 - 20 °C nejdéle po dobu 24 h. Zbývající lahvičky se uzavřou (bez bublinek) a inkubují se při 20 °C ve tmě. Každá série musí být doprovázena slepým pokusem, který kontroluje inokulum.
V duplicitních lahvičkách se nejméně 1x týdně stanovuje kyslík a to po celou dobu 28 dnů.
Týdenní vzorky umožňují stanovení 14 denního okna, kdežto vzorky každé 3 - 4 dny dovolují stanovit 10 denní okno, což vyžaduje dvojnásobný počet lahviček.
Pro látky, které obsahují dusík se musí provést korekce na nitrifikaci. To se provádí tak, že se změří kyslík pomocí oximetru a pak se stanoví dusičnany a dusitany. Spotřeba kyslíku na tuto oxidaci se počítá podle přílohy 5.

VI. 3 VÝSLEDKY A ZPRÁVA

VI. 3. 1 Zpracování výsledků
Nejprve se vypočte BSK po každé časové periodě tak, že se odečte spotřeba kyslíku v mg.l^-1 slepého pokusu od spotřeby se zkoušenou látkou. Takto získaný výsledek se dělí koncentrací zkoušené látky a tím se získá specifická BSK v mg kyslíku na mg látky. Pak se vypočítá procentní biologická rozložitelnost jako podíl specifické BSK a specifické TSK (počítané podle přílohy 2. 2) nebo CHSK (stanovené analyticky podle přílohy 2. 3).
$B S K = \frac{m g O_{2} z k . l . - m g O_{2} s l . p . = m g k y s l í k u n a m g l a t k y}{m g z k . l . v l a h v i}$
$% r o z k l a d u = \frac{B S K m g k y s l í k u n a m g z k . l .}{T S K m g k y s l í k u n a m g z k . l .} . 100$
nebo
$% r o z k l a d u = \frac{B S K (m g k y s l í k u n a m g z k . l .)}{C H S K (m g k y s l í k u n a m g z k . l .)} . 100$
kde
zk. l. = zkoušená látka,
sl. p. = slepý pokus.
Je potřeba podotknout, že tyto dvě metody neposkytují nezbytně stejné výsledky. Upřednostnit by se měla metoda s použitím TSK.
Pro zkoušenou látku obsahující dusík se používá vhodná TSK (NH₄ nebo NO₃) podle toho, co se ví nebo očekává o výskytu nitrifikace (viz příloha 5). V případě, že se nitrifikace vyskytuje, ale není úplná, koriguje se spotřeba kyslíku podle analytických koncentrací dusitanů a dusičnanů.

VI. 3. 2 Platnost výsledků
Spotřeba kyslíku ve slepých pokusech nesmí být vyšší než 1,5 mg.l^-1 po 28 dnech. Vyšší hodnoty vyžadují prozkoumání použité experimentální techniky. Zbytková koncentrace kyslíku v lahvičkách nesmí být nižší než 0,5 mg.l^-1 v jakémkoliv časovém úseku zkoušky. Tyto kyslíkové hladiny jsou platné jen v případě, že metoda, jíž se stanovuje kyslík, je schopná tyto koncentrace přesně měřit.
Viz také část I.5.2.

VI. 3. 3 Závěrečná zpráva
Viz I.8.

VI. 4 PŘEHLED VÝSLEDKŮ
Příklad uspořádání výsledků může být následující:
ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH

1. LABORATOŘ

2. DATUM ZAČÁTKU ZKOUŠKY

3. ZKOUŠENÁ LÁTKA
Název:
Koncentrace zásobního roztoku: mg.l^-1
Počáteční koncentrace v lahvičce: mg.l^-1
TSK nebo CHSK: mg O₂.mg zkoušené látky^-1

4. INOKULUM
Zdroj:
Úprava:
Předúprava v případě, že byla použita:
Koncentrace v reakční směsi: mg/l

5. PROVEDENÁ STANOVENÍ
Metoda: Winkler / oximetr

			Stanoveno (mg.l^-1)
			0	n₁	n₂
Slepý pokus	1	C₁
Slepý pokus	2	C₂
Průměr	$m_{b} = \frac{C_{1} + C_{2}}{2}$
Zkoušená látka	1	a₁
	2	a₂
Průměr	$m_{t} = \frac{a_{1} + a_{2}}{2}$

Poznámka: Podobný vzor může být použit i pro referenční látku a pro kontrolu toxicity.

6. OPRAVA NA NITRIFIKACI

Doba inkubace	0	n₁	n₂	n₃
(i) Koncentrace dusičňanů (mg N.l^-1)
(ii) Změna koncentrace dusičňanů (mg N.l^-1)
(iii) Kyslíkový ekvivalent (mg N.l^-1)
(iv) Koncentrace dusitanů (mg N.l^-1)
(v) Změna v koncentraci dusitanů (mg N.l^-1)
(vi) Kyslíkový ekvivalent (mg N.l^-1)
(iii + vi) Celkový kyslíkový ekvivalent (mg N.l^-1)

7. DOSAŽENÉ ODSTRANĚNÍ: % ROZKLADU

	Odstranění po n dnech (mg.l^-1)
	n₁	n₂	n₃
Lahev 1: (m_to - m_tx) - (m_bo - m_bx)
Lahev 2: (m_to - m_tx) - (m_bo - m_bx)
Lahev 1: $% D_{1} = \frac{m_{to} - m_{tx} - m_{bo} - m_{bx} . 100}{konc . ve zk \cdot TSK}$
Lahev 2: $% D_{2} = \frac{m_{to} - m_{tx} - m_{bo} - m_{bx} . 100}{konc ve zk . \cdot TSK}$
$% D prùm . = \frac{D_{1} + D_{2}}{2}$

Průměr nelze počítat v případě velkých diferencí replikátů.
m_to= hodnota ve zkušební lahvičce v čase 0
m_x= hodnota ve zkušební lahvičce v čase x
m_bo = hodnota slepého pokusu v čase 0
m_bx = hodnota slepého pokusu v čase x
Uplatní se všechny korekce na nitrifikaci iii + vi z části 6.

8. SPOTŘEBA KYSLÍKU VE SLEPÉM POKUSU
Spotřeba kyslíku ve slepém pokusu je (mb_o - mb₂₈) v mg.l^-1. Tato spotřeba je důležitá pro platnost zkoušky. Měla by být menší než 1,5 mg.l^-1.