bod D · 299/1998 Sb.

IV. D MANOMETRICKÁ RESPIROMETRICKÁ ZKOUŠKA

V. 1 PRINCIP METODY
Změřený objem inokulovaného minerálního média, jež obsahuje známou koncentraci zkoušené látky (100 mg.l^-1 látky, jež poskytují nejméně 50-100 mg.l^-1 TSK) jako jediný zdroj uhlíku je míchán v uzavřené nádobě při konstantní teplotě (± 1 °C nebo lepší) po dobu 28 dnů. Spotřeba kyslíku se stanovuje jednak měřením množství elektrolyticky produkovaného kyslíku, který je potřebný k udržení konstantního objemu plynu v respirační nádobce nebo ze změn objemu nebo tlaku nebo obou v aparatuře. Vyvinutý CO₂ je absorbován v roztoku KOH nebo v jiném vhodném absorbentu. Množství kyslíku, jenž je zkoušenou látkou spotřebován, korigované o spotřebu slepého pokusu jenž běží paralelně se vyjadřuje jako procento TSK nebo CHSK. Případně může být z doprovodné specifické chemické analýzy provedené na začátku a na konci inkubace počítána primární biologická rozložitelnost a z analýzy DOC úplný rozklad.

V. 2 POPIS METODY

V. 2. 1 Zařízení

a) vhodný respirometr,

b) regulátor teploty s přesností ± 1 °C nebo lepší,

c) aparatura pro membránovou filtraci,

d) analyzátor DOC (nepovinně),

V. 2. 2 Příprava minerálního média
Příprava zásobních roztoků je popsána v části I. 6. 2
Smíchá se 10 ml roztoku (a) s 800 ml zřeďovací vody a přidá se po 1 ml roztoků (b) až (d) a doplní se do 1 l zřeďovací vodou.

V. 2. 3 Příprava a předúprava inokula
Inokulum má být získáno z různých zdrojů: aktivovaný kal, vyčištěná městská odpadní voda, povrchová voda a půda nebo jejich směs.
Viz část I. 6. 4, I. 6. 4. 2 a I. 6. 5.

V. 2. 4 Příprava nádobek
S použitím zásobních roztoků se připraví roztoky zkoušené a referenční látky v minerálním médiu, koncentračně ekvivalentní 50 - 100 mg.l^-1 TSK.
V případech, kdy lze vyloučit nitrifikaci vypočítá se TSK za předpokladu tvorby amoniových solí, v opačném případě na bázi tvorby dusičnanů (viz příloha 2.2)
Změří se pH a v případě potřeby se upraví na 7,4 ± 0,2.
Špatně rozpustné látky se přidávají v pozdějším stádiu (viz dále).
Má-li se stanovit toxicita zkoušené látky připraví se další roztok v minerálním médiu, jenž obsahuje referenční a zkoušenou látku dohromady a to ve stejných koncentracích jako v individuálních roztocích.
Je-li požadováno stanovení fyzikálně-chemické spotřeby kyslíku, připraví se roztok zkoušené látky při obvyklé koncentraci 100 mg TSK.l^-1 sterilizovaný přídavkem vhodné toxické látky (viz I. 6. 6)
Připravené roztoky zkoušené a referenční látky se vnesou, nejméně v duplikátech, do nádobek. Do dalších nádobek se vnese pro kontrolu inokula pouze minerální médium a v případě, že je to požadováno, směs zkoušené látky a referenční látky a sterilní roztok.
V případě, že je zkoušená látka špatně rozpustná, přidává se v této fázi přímo navážením nebo odměřením objemu nebo se postupuje podle přílohy 3. Do absorbéru CO₂ se přidá KOH, pelety NaOH nebo jiný absorbent.

V. 2. 5 Počet nádobek v typické zkoušce
Nádobka č. 1 a 2: zkoušená suspenze
Nádobka č. 3 a 4: slepý pokus
Nádobka č. 5: kontrola postupu
když je to potřebné:
Nádobka č. 6: sterilní kontrola
Nádobka č. 7: kontrola toxicity
Viz část I. 6. 7.

V. 2. 6 Provedení zkoušky
Po vytemperování nádobek na zvolenou teplotu se do vybraných nádobek přidá inokulum tak, aby se ustavila koncentrace suspendovaných látek ne větší než 30 mg.l^-1. Nádobka se zkompletuje, přezkouší na těsnost, pustí se míchání a zahájí se měření spotřeby kyslíku. Obvykle není potřebné věnovat pokusu žádnou jinou pozornost vyjma denních odečtů a kontroly teploty a míchání.
Vypočítá se spotřeba kyslíku z pravidelných a občasných odečtů postupem, jenž doporučuje výrobce přístroje. Na konci inkubace, obvykle po 28 dnech, se změří pH v nádobkách a to zvláště tehdy, je-li spotřeba kyslíku malá nebo větší než TSK počítaná na vznik amoniaku (platí pro látky s obsahem dusíku).
Je-li to požadováno, odebírá se vzorek z nádobek ke stanovení DOC nebo specifickou analýzu - viz příloha 2. Při prvním odběru z nádobky je nutné znát zbývající objem v nádobce. V případě zkoušky s dusíkatými látkami stanovuje se přírůstek koncentrací dusičnanů a dusitanů v průběhu 28 dnů a z nich se počítá korekce spotřeby kyslíku podle příohy 5.

V. 3. VÝSLEDKY A ZPRÁVA

V. 3. 1. Zpracování výsledků
Spotřeba kyslíku zkoušenou látkou po zvoleném času a po korekci na slepý pokus se dělí hmotností zkoušené látky v nádobce. To poskytuje BSK vyjádřenou jako mg.mg^-1:
$B S K = \frac{{S K}_{Z L -} {S K}_{0}}{m} (m g . {m g}^{- 1})$
kde
SK_ZL = spotřeba kyslíku zkoušenou látkou (mg),
SK₀ = spotřeba kyslíku ve slepém pokusu (mg),
m = hmotnost zkoušené látky v nádobce.
Procentní biologický rozklad se vypočte z rovnice
$% b i o l o g i c k é h o r o z k l a d u = % T S K = \frac{B S K}{T S K} . 100$
nebo ze vztahu
$% C H S K = \frac{B S K}{C H S K} . 100$
Je nutné poznamenat, že obě metody nemusí poskytovat stejné hodnoty; upřednostňuje se použití první metody.
Pro látky, jež obsahují dusík se používá vhodné TSK (pro NH₄ nebo NO₃) podle toho co je známo nebo odhadováno o výskytu nitrifikace (příloha 2). Jestliže se nitrifikace vyskytuje, ale není úplná, koriguje se spotřeba kyslíku podle změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha 5).
V případě, že se stanovuje organický uhlík a /nebo se provedla specifická analýza, počítá se stupeň rozkladu podle odstavce I. 7.
Všechny výsledky se zapisují do tabulkových sestav.

V. 3. 2 Platnost zkoušky
Normální spotřeba kyslíku inokulem je 20 - 30 mg.l^-1 a nemá být větší než 60 mg.l^-1 v průběhu 28 dnů. Hodnoty větší než 60 mg.l^-1 vyžadují kritické hodnocení výsledků a experimentální techniky.
V případě, že pH je mimo rozsah 6 - 8,5 a spotřeba kyslíku zkoušenou látkou je menší než 60 % je nutno zkoušku opakovat s nižší koncentrací zkoušené látky.
Viz odst. I.

V. 3. 3 Protokol o zkoušce
Dále je uveden příklad protokolu.
MANOMETRICKÁ RESPIROMETRICKÁ ZKOUŠKA

1. LABORATOŘ

2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

3. ZKOUŠENÁ LÁTKA
Název:
Koncentrace zásobního roztoku:
Počáteční koncentrace v médiu:
Objem v nádobce:
TSK nebo CHSK v mg.mg^-1 zkoušené látky (NH₄, NO₃):

4. INOKULUM
Zdroj:
Provedená úprava:
Předúprava, pokud byla provedena:
Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi:

5. TABULKA SPOTŘEB KYSLÍKU

		Čas (dny)
		0	7	14	21	28
spotřeba kyslíku (mg) zkoušenou látkou	1
	2
	a, průměr
spotřeba kyslíku (mg) ve slepém pokuse	3
	4
	b, průměr
opravená BSK (mg)	(a₁- b_m)
BSK na zkoušené látky	(a₂ - b_m)
	$\frac{(a_{1} - b_{m})}{C_{0} V}$
	$\frac{(a_{2} - b_{m})}{C_{0} V}$
% rozkladu (BSK/TKS).100	D₁(a₁)
	D₂(a₂)
	průměr*

* pokud je mezi D₁ a D₂ výrazný rozdíl nemůže být počítán jejich průměr
Poznámka: Obdobný formulář může být použit pro referenční látku a pro kontrolu toxicity.

6. OPRAVA NA NITRIFIKACI (Viz příloha 5)

Den	0	28	Rozdíl
(i) Koncentrace dusičnanů (mg N.l^-1)			(N)
(ii) Kyslíkový ekvivalent (4,57.N.V) (mg)	-	-
(iii) Koncentrace dusitanů (mg N.l^-1)			(N)
(iv) Kyslíkový ekvivalent (3,43.N.V) (mg)	-	-
(ii + iv) Celkový kyslíkový ekvivalent	-	-

7. ANALÝZA UHLÍKU (nepovinná)
Analyzátor uhlíku:

Čas (dny)	Slepý pokus (mg.l^-1)	Zkoušená látka (mg.l^-1)
0	(C_SPO)	(C₀)
28*	(C_SPt)	(C_t)
* nebo na konci inkubace

% o d s t r . D O C = 1 - \frac{C_{t} - C_{S P t}}{C_{0} - C_{S P 0}} . 100

8. ROZKLAD VÝCHOZÍ LÁTKY (nepovinně)
S_b = koncentrace ve fyzikálně - chemické kontrole (sterilní) po 28 dnech
S_a= koncentrace v inokulované nádobě po 28 dnech
$% B R = \frac{S_{b} - S_{a}}{S_{b}} . 100$
kde
% BR = biologický rozklad výchozí látky vyjádřený v %.

9. ABIOTICKÝ ROZKLAD
a = spotřeba kyslíku ve sterilní kontrole po 28 dnech, (mg)
$s p o t ř e b a k y s l í k u n a m g c h e m i c k é l á t k y = \frac{a}{C_{c} V}$
(viz část 1 a 3)
$% a b i o t i c k é h o r o z k l a d u = \frac{a . 100}{C_{0} V . T S K}$