bod B · 299/1998 Sb.

IV. B MODIFIKOVANÁ VYHLEDÁVACÍ ZKOUŠKA OECD

III. 1 PRINCIP METODY
Změřený objem minerálního média, obsahujícího známou koncentraci zkoušené látky (10 - 40 mg DOC.l^-1) jako výhradně jediného zdroje organického uhlíku, se naočkuje 0,5 ml přečištěné odpadní vody na 1 litr média. Směs se provzdušňuje v temnu nebo v difůzním světle při 22 ± 2 °C.
Rozklad se sleduje analýzou DOC v častých intervalech během 28-denního období. Stupeň biologického rozkladu se vypočítá tak, že se koncentrace odstraněného DOC (korigovaná na koncentraci ve slepém pokusu s inokulem) vyjádří jako procento koncentrace přítomné na začátku. Stupeň primárního biologického rozkladu je rovněž možné vypočítat z doplňkové chemické analýzy, provedené na začátku a na konci inkubace.

III. 2 POPIS METODY

III. 2. 1 Aparatura

(a) Erlenmeyerovy baňky, např. od 250 ml do 2 l, podle objemu potřebného pro analýzu DOC;

(b) Třepačka - pro umístění Erlenmeyerových baněk, buď s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostatečným výkonem pro udržení aerobních podmínek ve všech baňkách;

(d) Analyzátor DOC;

(e) Přístroj pro stanovení rozpuštěného kyslíku;

(f) Odstředivka.

III. 2. 2 Příprava minerálního média
Příprava zásobních roztoků viz I. 6. 2.
Smísí se 10 ml roztoku (a) s 80 ml zřeďovací vody, přidá se 1 ml roztoků (b) až (d) a doplní na 1 l zřeďovací vodou.
Tato metoda používá jako inokulum pouze 0,5 ml přečištěné odpadní vody a proto je nutné médiu dodat stopové prvky a růstové faktory. Toho se dosáhne přidáním 1 ml každého z dále uvedených roztoků na 1 litr výsledného média:
Roztok stopových prvků:

Tetrahydrát síranu manganatého, MnSO₄.4H₂O	39,9 mg
Kyselina boritá, H₃BO₃	57,2 mg
Heptahydrát síranu zinečnatého, ZnSO₄.7H₂O	42,8 mg
Heptamolybdenan amonný, (NH₄)₆Mo₇O₂₄	34,7 mg
Chelát Fe (FeCl₃ s ethylendiamintetraoctovou kyselinou)	100,0 mg

Rozpustí se ve zřeďovací vodě a doplní se na 1000 ml.
Vitaminový roztok:
Kvasničný extrakt 15,7 mg
Kvasničný extrakt se rozpustí ve 100 ml vody. Sterilizuje se průchodem membránou 0,2 µm, nebo se připraví čerstvě.

III. 2. 3 Příprava a předběžná kondicionace inokula
Inokulum se získá z výstupu druhého stupně čistírny nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody.
Viz I. 6. 4. 2 a I. 6. 5.

III. 2. 4 Příprava baněk
Je například možné naplnit podíly po 800 ml minerálního média do 2 l Erlenmeyerových baněk a do jednotlivých baněk přidat dostatečná množství zásobních roztoků zkoušené a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 - 40 mg DOC.l^-1. Zkontrolují se hodnoty pH a případně se upraví na 7,4. Baňky se naočkují výtokem z druhého stupně čištění odpadních vod (viz I. 6. 4. 2). Připraví se rovněž kontrolní pokusy s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkoušené nebo referenční látky.
V případě potřeby se použije jedna baňka ke kontrole možného inhibičního efektu zkoušené látky naočkováním roztoku, který v minerálním médiu obsahuje srovnatelné koncentrace jak zkoušené, tak referenční látky.
Je-li třeba, použije se rovněž další, sterilní, baňka ke kontrole, zda je zkoušená chemická látka rozkládána abioticky, pomocí roztoku dané chemické látky bez inokula (viz I. 6. 6).
Existuje-li důvodné podezření, že se zkoušená látka významně adsorbuje na skle, kalu apod., provede se předběžný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce a tím vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulka 1). Použije se baňka obsahující zkoušenou látku, inokulum a sterilizační činidlo.
Obsah všech baněk se doplní minerálním médiem na 1 l a po promíchání se z každé baňky odebere vzorek pro stanovení počáteční koncentrace DOC (viz příloha 2.4). Ústí baněk se zakryjí např. hliníkovou fólií tak, aby byla možná volná výměna vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Pak se nádoby umístí do třepačky čímž se zahájí zkouška.

III. 2. 5 Počet baněk v typické zkoušce
Baňka 1 a 2: Zkoušená suspenze
Baňka 3 a 4: Slepý pokus s inokulem
Baňka 5: Kontrola postupu
Pokud možno a je-li třeba:
Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola
Baňka 7: Kontrola adsorpce
Baňka 8: Kontrola toxicity
Viz také bod I. 6. 7.

III. 2. 6 Provedení zkoušky
Během zkoušky se ve známých časových intervalech stanoví dvojmo koncentrace DOC v každé baňce, a to dostatečně často, aby bylo možno určit začátek 10-denního okénka a procentní úbytek na konci 10-denního okénka. Pro každé stanovení je třeba odebírat pouze minimální nutné množství zkoušené suspenze.
Před odběrem vzorků se případně nahradí ztráty odpařováním z baněk přidáním potřebného množství zřeďovací vody (I. 6. 1). Před odběrem vzorků je třeba kultivační médium dobře promíchat a zajistit, aby látky ulpělé na stěnách nádob přešly do roztoku nebo suspenze. Ihned po odběru je třeba vzorky zfiltrovat přes membránu nebo zcentrifugovat (viz přílohu 2. 4). Zfiltrované resp. zcentrifugované vzorky je třeba analyzovat týž den, jinak je možné je přechovávat nejdéle 48 hodin při 2 - 4 °C nebo po delší dobu při teplotě nižší než - 18 °C.

III. 3 DATA A PROTOKOL

III. 3. 1 Zpracování výsledků
Procentní rozklad v čase t se vypočte, jak je uvedeno v bodě I. 7. 1. (stanovení DOC) nebo případně v bodě I. 7. 2. (specifická analýza).
Všechny výsledky se uvedou na přiložených přehledech dat.

III. 3. 2 Platnost výsledků
Viz bod I. 5. 2.

III. 3. 3 Protokol
Viz bod I. 8.

III. 4 PŘEHLED ZÍSKANÝCH VÝSLEDKŮ
Příklad přehledu výsledků:
MODIFIKOVANÁ VYHLEDÁVACÍ ZKOUŠKA OECD

1. LABORATOŘ

2. DATUM POČÁTKU ZKOUŠKY

3. ZKOUŠENÁ LÁTKA
Název:
Koncentrace zásobního roztoku: mg.l^-1 jako chemická látka
Počáteční koncentrace v médiu, to: mg.l^-1 jako chemická látka

4. INOKULUM
Zdroj:
Provedená úprava:
Předběžná kondicionace, pokud byla provedena:
Koncentrace suspendovaných tuhých látek v reakční směsi: mg.l^-1

5. STANOVENÍ UHLÍKU

	Baňka č.		DOC po n dnech (mg.l^-1)
	Baňka č.		0	n₁	n₂	n₃	n_x
Zkoušená láka a inokulum	1	a₁
		a₂
		a, průměr C_a(t)
	2	b₁
		b₂
		b, průměr C_b(t)
Čisté inokulum bez zkoušené látky	3	c₁
		c₂
		c, průměr C_c(t)
	4	d₁
		d₂
		d, průměr C_d(t)
	$C_{bl t} = \frac{C_{c t} + C_{d t}}{2}$

6. VYHODNOCENÍ NAMĚŘENÝCH ÚDAJŮ

Baňka č.
Baňka č.		n₁	n₂	n₃	n_x
1	$D_{1} = 1 - \frac{C_{a t} - C_{bl t}}{C_{a 0} - C_{bl 0}} . 100$
2	$D_{2} = 1 - \frac{C_{b t} - C_{bl t}}{C_{b 0} - C_{bl 0}} . 100$
Průměr*	$D = \frac{D_{1} - D_{2}}{2}$

* D1 a D2 nesmí být průměrovány,pokud je mezi nimi významný rozdíl.
Poznámka: obdobný vzor může být použit i pro referenční látku a pro kontrolu toxicity.

7. ABIOTICKÁ KONTROLA (nepovinná)

	Doba (dny)
	0	t
DOC (mg.l^-1) ve sterilní kontrole	C_s(o)	C_s(t)

8. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA (nepovinná)

	Zbývající množství zkoušené chemikálie na konci zkoušky (mg.l^-1)	% primárního rozkladu
Sterilní kontrola	S_b
Neočkované zkušební medium	S_a	$\frac{S_{b} - S_{a}}{S_{b}} . 100$