IV. C ZKOUŠKA UVOLŇOVÁNÍ OXIDU UHLIČITÉHO

IV. 1 PRINCIP METODY
Odměřený objem inokulovaného minerálního média se známou koncentrací zkoušené látky (10 - 20 mg.l^-1), která je jediným zdrojem uhlíku je provzdušňovan ve tmě nebo v difusním světle řízeným proudem vzduchu prostého CO₂. Rozklad je sledován po dobu 28 dnů podle množství prokukovaného CO₂ jímaného v roztoku hydroxidu sodného nebo barnatého, kde je titračně stanoven jako anorganický uhlík. Množství uvolněného CO₂, po korekci na slepý pokus, je vyjadřováno jako % TCO₂. Stupeň biologického rozkladu může být také stanoven podle DOC stanoveného na začátku a na konci pokusu.

IV. 2 POPIS METODY

IV. 2. 1 Aparatura

a) baňky 2 - 5 l vybavené vzduchovací trubicí, která dosahuje až ke dnu nádoby, a výpustí;

b) magnetická míchačka pro zkoušení špatně rozpustných látek;

c) absorpční nádobky;

d) zařízení pro řízení a měření množství vzduchu;

e) zařízení pro praní vzduchu, pro přípravu CO₂ prostého vzduchu, případně akternativně směšovací zařízení na směs CO₂ prostého kyslíku a CO₂ prostého dusíku z lahví. Má se používat správný poměr 20 % kyslíku a 80 % dusíku;

f) zařízení na stanovení CO₂ buď titračně nebo pomocí analyzátorů anorganického uhlíku;

g) zařízení pro membránovou filtraci (nepovinně);

h) analyzátor DOC (nepovinně).

IV. 2. 2 Příprava minerálního média
Příprava zásobních roztoků je popsána v části I. 6. 2..
Roztok (a) v množství 10 ml se smíchá s 800 ml zřeďovací vody, přidá se 1 ml roztoků (b) až (d) a doplní do 1 l zřeďovací vodou.

IV. 2. 3 Příprava a předúprava inokula
Inokulum má pocházet z různých zdrojů: aktivovaný kal, odtok z městské čistírny, povrchová voda, půdy či směs z uvedených.
Viz. část I. 6. 4, I. 6. 4. 1, I. 6. 4. 2 a I. 6. 5.

IV. 2. 4 Příprava baněk
Jako příklad je uváděno uspořádání pro 5 l baňky s obsahem 3 l suspenze.
V případě použití jiných objemů se hodnoty úměrně upraví tak, aby se zajistilo přesné měření vytvořeného CO₂.
Do každé 5 l baňky se vnese 2400 ml minerálního média. Přidá se vhodné množství připraveného inokula (viz I. 6. 4. 1 a I. 6. 5) tak, aby koncentrace aktivovaného kalu byla 30 mg.l^-1 v konečném objemu 3 l inokulované směsi. Alternativně lze zředit kal tak, aby se získala suspenze 500 - 1000 mg.l^-1 v minerálním médiu a to ještě před přídavkem alikvotní části do 5 l baňky k dosažení koncentrace 30 mg.l^-1. Tento postup zajišťuje větší přesnost. Mohou být použita i jiná inokula (viz I. 6. 4. 2).
Inokulovaná směs se přes noc probublává vzduchem prostým CO₂ k odstranění absorbovaného CO₂.
Přidá se známý objem zásobního roztoku zkoušené látky a referenční látky, čímž se vytvoří dvojice baněk se živnou koncentrací ze zkoušené a referenční látky v rozmezí 10 až 20 mg.^l-1 DOC nebo TOC. Některé lahve se nasazují jako kontrola a to bez chemikálií. Špatně rozpustné látky se přidávají přímo do baněk na hmotnostní nebo objemové bázi nebo se postupuje podle přílohy 3.
Jestliže je to požadováno, použije se 1 sterilní baňka bez inokula ke zjištění abiotického rozkladu (viz I. 6. 6). Sterilizace se provádí pomocí vhodné koncentrace toxické látky.
Ve všech baňkách se upraví objem na 3 l přídavkem minerálního média prostého CO₂. Mohou se odebrat vzorky pro stanovení DOC (viz příloha 2) a/nebo specifickou analýzu. Pak se připojí absorpční nádobky.
V případě použití hydroxidu barnatého se spojují 3 nádobky, každá s obsahem 100 ml 0,0125 mol.l^-1 Ba(OH)₂ v sérii pro každou 5 l baňku. Roztok musí být prostý sraženiny síranu a uhličitanu barnatého a bezprostředně před použitím musí být stanovena jeho koncentrace. V případě použití hydroxidu sodného spojují se 2 jednotky, z nichž druhá slouží jako kontrola, že všechen CO₂ byl absorbován v první nádobce. Jako uzávěry absorpčních nádobek jsou vhodné sérové uzávěry. Do každé nádobky se přidá po 200 ml 0,05 mol NaOH, což je dostatečné k absorpci veškerého CO₂, který se uvolní při úplném rozkladu látky. Roztok hydroxidu sodného i když je čerstvě připraven, obsahuje stopy uhličitanů, což se koriguje odečtením slepého pokusu.

IV. 2. 5 Počet baněk v typickém pokusu
Baňka č. 1 a 2: Zkoušená suspenze
Baňka č. 3 a 4: Slepý pokus inokula
Baňka č. 5: Kontrola postupu
a dále s výhodou a když je to potřebné:
Baňka č. 6: Abiotická sterilní kontrola
Baňka č. 7: Kontrola toxicity
Viz. také část I. 6. 7.

IV. 2. 6 Provedení zkoušky
Zkouška se zahajuje probubláváním suspenze vzduchem prostým CO₂ rychlostí 30 - 100 ml.min^-1. Pravidelně se odebírají a analyzují vzorky absorbátu CO₂. Doporučuje se, aby v průběhu prvních 10 dnů byly analýzy prováděny každý druhý až třetí den a dále každý pátý den až do 28. dne, což umožňuje určení periody.10 denního okna.
Na konci pokusu, 28. den, může být odebrán vzorek na stanovení DOC a/nebo na specifickou analýzu, změří se pH suspenze a pak se do každé baňky přidá 1 ml koncentrované HCl. Provzdušňuje se přes noc k odstranění v suspenzi přítomného CO₂. Poslední analýza CO₂ se provede 29. den.
Ve dnech, kdy se měří CO₂ se odpojuje ten absorbér, který je nejblíže baňce a roztok hydroxidu se titruje 0,05 mol HCl na fenolftalein. Zbývající absorbér se posune o jedno místo blíže k lahvi a nový absorbér se 100 ml čerstvě připraveného 0,0125 mol.l^-1 hydroxidu barnatého se zapojí na místě posunutého, na konec série. Potřebné titrace se provádí tehdy, je-li pozorována sraženina v prvním absorbéru a před tím než je pozorovatelná ve druhém, nebo nejméně jednou týdně. Alternativně, v případě použití NaOH jako absorbentu, se pomocí injekční stříkačky odebere z absorbéru, který je nejblíže baňce malý vzorek, který se nastříkne přímo do analyzátoru uhlíku.
Druhý absorbér se analyzuje pouze na konci zkoušky, aby se tak mohl korigovat únik CO₂.

IV. 3 VÝSLEDKY A ZPRÁVA

IV. 3. 1 Zpracování výsledků
Množství CO₂ zachyceného v absorbéru je při titraci dáno:
mg CO₂ = (100.C_B - 0,5.V.C_A).44
kde
V = spotřeba HCl pro titraci 100 ml v absorbéru
C_B = koncentrace roztoku Ba(OH)₂ v mol.l^-1
C_A = koncentrace HCl v mol.l^-1
V případě, že C_B je 0,0125 mol a C_A 0,05 mol je spotřeba pro titraci 100 ml roztoku Ba(OH)₂ 50 ml a hmotnost CO₂ je dána:
$\frac{\mathrm{0,05}}{2}.44.mlHCl=\mathrm{1,1}.mlHCl$
Tedy, v tomto případě se hmotnost produkovaného CO₂ získá násobením spotřeby HCl faktorem 1,1.
Vypočítá se hmotnost CO₂ vyprodukovaného samotným inokulem, inokulem se zkoušenou látkou s použitím příslušných výsledků titrace. Jejich rozdíl je hmotnost CO₂, který byl vyprodukován samotnou zkoušenou látkou.
Např. když samotné inokulum poskytuje titrací 48 ml a inokulum se zkoušenou látkou 45 ml,
CO₂ z inokula = 1,1. (50 - 48) = 2,2 mg
CO₂ z inokula a zkoušené látky = 1,1.(50 - 45) = 5,5 mg
a z toho hmotnost CO₂ vyprodukovaná zkoušenou látkou je 3,3 mg.
Procentní biologická rozložitelnost se vypočítá z:
% rozkladu = (mg CO₂. 100)/(TCO₂. mg zkoušené látky)
nebo
% rozkladu = (mg CO₂. 100)/(mg TOC.3,67)
kde 3,67 je přepočítací koeficient 44/12 pro uhlík na CO₂.
Takto se postupuje pro každé měření jež se provádělo po celou dobu zkoušky vždy s dosazením TCO₂ spočítané pro každý den..
Při absorpci do NaOH se vypočítá hmotnost produkovaného CO₂, vyjádřeného jako anorganický uhlík, vynásobením této koncentrace objemem absorpčního roztoku.
Procento rozkladu se vypočítá ze vztahu:
% TCO₂ = [( mg IC ze zk. b. - mg IC ze sl. p.) / mg TOC ve zk. 1]. 100
kde
IC = anorganický uhlík,
sl.p. = slepý pokus,
zk. b. = zkušební baňka
zk. l. = zkoušená látka.
Úbytek DOC se může spočítat podle části I. Všechny výsledky se zapisují do sestavy dat.

IV. 3. 2 Platnost výsledků
Počáteční hmotnost anorganického uhlíku ve zkušební suspenzi v minerálním médiu nesmí být na počátku pokusu větší než 5 % celkového uhlíku. Celkové množství CO₂ vyvinutého v inokulovaném slepém pokusu nesmí překročit na konci pokusu 40 mg na litr média. V případě, že se získají hodnoty větší než 70 mg CO₂. l^-1, měly by se experimentální postup i výsledky kriticky posoudit.
Viz také I. 5. 2.

IV. 3. 3 Zpráva o výsledcích
Viz část I. 8.

IV. 4 Přehled získaných výsledků
Příklad přehledu výsledků:.
ZKOUŠKA VÝVINU OXIDU UHLIČITÉHO

1. LABORATOŘ

2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

3. ZKOUŠENÁ LÁTKA
Název:
Koncentrace zásobního roztoku: mg látky na litr
Počáteční koncentrace v médiu: mg látky v mediu
Množství celkového uhlíku nasazeného do baňky: mg C
TCO₂: mg CO₂

4. INOKULUM
Zdroj:
Způsob úpravy:
Předúprava: pokud byla
Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg CO₂

5. TVORBA OXIDU UHLIČITÉHO A ROZLOŽITELNOST
Metoda: Ba(OH)₂ / NaOH/ jiná

Čas (dny)	mg CO2 vyvinutého ve zkoušce			mg CO2 vyvinutého ve slepém pokuse			kumulatívní množství vyvinutého CO2 (průměr ve zkoušce mínus průměr		TCO2 kumulatívní CO2.100 TCO2
	1	2	průměr	3	4	průměr	1	2	1	2	průměr
()
n1
n2
n3
28

Poznámka: podobné uspořádání lze použít i pro referenční látku a pro kontrolu toxicity.

6. ANALÝZA UHLÍKU (nepovinně)
Analyzátor uhlíku

Čas (den)	Slepý pokus. mg.l-1	Zkoušená látka, mg.l-1
0	Cb(o)	Co
20 (*)	Cb(t)	C(t)
(*) nebo na konci inkubace

$\%odstr.DOC=1-\frac{C_t-C_{b\left(t\right)}}{C_o-C_{b\left(o\right)}}.100$

7. ABIOTICKÝ ROZKLAD (nepovinně)
% abiot. rozkladu = (produkce mg CO₂ ve steril. podm. po 28 dnech / TCO₂).100