VII. 2. POPIS METODY
VII. 2. 1 Přístroje
a) automatický elektrolytický měřič BSK nebo respirometr vybavený 6 baňkami, každá objemu 300 ml s uzávěry, které umožňují absorbci CO2,
b) místnost s konstatní teplotou nebo vodní lázeň s teplotou 25 ± 1 ° C,
c) zařízení pro filtraci s membránovými filtry (nepovinně),
d) analyzátor CO2 (nepovinně).
VII. 2. 2 Příprava minerálního média
Vždy 3 ml dále uvedených roztoků a, b, c, a d se doplní deionizovanou vodou na objem 1000 ml.
| a) | Hydrogenfosforečnan draselný K2HPO4 | 21,75 g, | |||||
| dihydrogenfosforečnan draselný KH2PO4 | 8,50 g, | ||||||
| dodekahydrát hydrogenfosforečnanu sodného Na2HPO4. 12 H2O | 44,60 g, | ||||||
| chlorid amonný NH4Cl se rozpustí v 1000 ml vody. Hodnota pH by měla být 7,2. | 1,70 g | ||||||
| b) | Heptahydrát síranu hořečnatého MgSO4. 7 H2O se rozpustí v 1000 ml vody. | 22,50 g | |||||
| c) | Chlorid vápenatý CaCl2 se rozpustí v 1000 ml vody. | 27,50 g | |||||
| d) | hexahydrát chloridu železitého FeCl3 . 6H2O se rozpustí v 1000 ml vody. | 0,25 g | |||||
VII. 2. 3 Příprava inokula
Odeberou se vzorky z nejméně deseti lokalit, kde se používají a vypouštějí různé chemikálie. Z míst jako jsou čistírny městských a průmyslových odpadních vod, řek, jezer a moří se odebírá l litr kalu, povrchových půd, vody a j., které se pečlivě smíchají. Po odstranění vyflotovaných látek a odstátí se pH supernatantu upraví na 7 ± 1 hydroxidem sodným nebo kyselinou fosforečnou. Do práce se bere vhodný objem tohoto filtrovaného supernatantu a naplní se jím nádoba, která se 23,5 h provzdušňuje. Třicet minut po ukončení provzdušňování se odlije 1/3 objemu a doplní stejným objemem rozoku, který obsahuje vždy po 0,1 % glukosy, peptonu a hydrogenfosforečnanu draselného a obnoví se provzdušňování. Tento postup se opakuje jednou denně. Kalová jednotka musí být provozovaná podle zásad dobré laboratorní praxe: odtok musí být čirý, teplota musí být udržovaná při 25 ± 2 °C, pH má být 7 ± 1, kal má dobře sedimentovat, provzdušňování musí být dostatečné za všech okolností, mají být přítomni provoci a aktivita kalu se má kontrolovat pomocí referenční látky nejméně každé 3 měsíce. Takto získané inokulum se nepoužívá dříve než po 1 měsíci kultivace a déle než po čtyřech měsících. Proto je nutné odebírat vzorky ze zvolených 10 míst každé 3 měsíce.
K udržení stejné aktivity čerstvého a starého kalu se filtrovaný supernatant starého kalu smíchává se stejným objemem nového kalu a směs se kultivuje podle popsaného postupu. Do práce se kal bere 18 - 24 h po přídavku živin.
VII. 2. 4 Příprava baněk
Připravuje se 6 baněk podle schematu:
č. 1 zkoušená látka ve zřeďovací vodě 100 mg.l-1
č. 2, 3, 4 zkoušená látka v minerálním médiu 100 mg.l-1
č. 5 referenční látka (např. anilin) v minerálním médiu 100 mg.l-1
č. 6 minerální médium
Málo rozpustné látky se přidávají přímo odvážením nebo odměřením objemu nebo se zpracují jak je uvedeno v příloze č. 3, s výjimkou těch, u kterých nemohou být použita rozpouštědla nebo emulgátory. Do speciálních uzávěrů lahví se přidá absorbent oxidu uhličitého. pH v baňkách č. 2, 3 a 4 se upraví na 7,0.
VII. 2. 5 Provedení zkoušky
Baňky č. 2, 3, 4 (zkušební suspenze), č. 5 (kontrola aktivity), č. 6 (slepý pokus) se inokulují malým množstvím inokula tak, aby výsledná koncentrace kalu byla 30 mg.l-1. Láhev č. 1 je bez inokula, čímž se získává abiotická kontrola.Nasadí se zátka, zkontroluje se těsnost, zapnou se míchadla a započne se s měřením úbytku kyslíku za stíněných podmínek. Denně se kontroluje teplota, míchání, zapisovač spotřeby kyslíku a zaznamenávají se všechny změny barvy obsahu láhve. Při využití 6 křivkového zapisovače se získává přímo křivka BSK. Na konci inkubace, která je obvykle 28 dní, měří se pH v láhvi a stanovuje zbytková koncentrace zkoušené látky a jejich metabolitů a v případě zkoušení látek rozpustných ve vodě také DOC (postup podle přílohy 2). V případě těkavých látek se používá speciální postup. V případě výskytu nitrifikace se stanovují, jestliže je to možné, dusičnany a dusitany.