bod F · 299/1998 Sb.

IV. F ZKOUŠKA MITI

VII. 1 PRINCIP METODY
Měření spotřeby kyslíku míchaného roztoku nebo suspenze zkoušené látky v minerálním médiu, které je inokulováno speciální kulturou neadaptovaných mikroorganismů je prováděno automaticky po dobu 28 dnů ve stíněném uzavřeném respirometru při 25 ± 1 °C. Uvolněný CO₂ je absorbován v hydroxidu sodném. Biologická rozložitelnost je vyjádřena jako procentický úbytek kyslíku (korigovaný slepým pokusem) teoretické spotřeby kyslíku (TSK). Procento primární biologické rozložitelnosti lze také počítat z doprovodné chemické analýzy provedené na začátku a na konci inkubace, případně podle analýzy DOC.

VII. 2. POPIS METODY

VII. 2. 1 Přístroje

a) automatický elektrolytický měřič BSK nebo respirometr vybavený 6 baňkami, každá objemu 300 ml s uzávěry, které umožňují absorbci CO₂,

b) místnost s konstatní teplotou nebo vodní lázeň s teplotou 25 ± 1 ° C,

c) zařízení pro filtraci s membránovými filtry (nepovinně),

d) analyzátor CO₂ (nepovinně).

VII. 2. 2 Příprava minerálního média
Vždy 3 ml dále uvedených roztoků a, b, c, a d se doplní deionizovanou vodou na objem 1000 ml.

a)	Hydrogenfosforečnan draselný K₂HPO₄	21,75 g,
	dihydrogenfosforečnan draselný KH₂PO₄	8,50 g,
	dodekahydrát hydrogenfosforečnanu sodného Na₂HPO₄. 12 H₂O	44,60 g,
	chlorid amonný NH₄Cl se rozpustí v 1000 ml vody. Hodnota pH by měla být 7,2.	1,70 g
b)	Heptahydrát síranu hořečnatého MgSO₄. 7 H₂O se rozpustí v 1000 ml vody.	22,50 g
c)	Chlorid vápenatý CaCl₂se rozpustí v 1000 ml vody.	27,50 g
d)	hexahydrát chloridu železitého FeCl₃ . 6H₂O se rozpustí v 1000 ml vody.	0,25 g

VII. 2. 3 Příprava inokula
Odeberou se vzorky z nejméně deseti lokalit, kde se používají a vypouštějí různé chemikálie. Z míst jako jsou čistírny městských a průmyslových odpadních vod, řek, jezer a moří se odebírá l litr kalu, povrchových půd, vody a j., které se pečlivě smíchají. Po odstranění vyflotovaných látek a odstátí se pH supernatantu upraví na 7 ± 1 hydroxidem sodným nebo kyselinou fosforečnou. Do práce se bere vhodný objem tohoto filtrovaného supernatantu a naplní se jím nádoba, která se 23,5 h provzdušňuje. Třicet minut po ukončení provzdušňování se odlije 1/3 objemu a doplní stejným objemem rozoku, který obsahuje vždy po 0,1 % glukosy, peptonu a hydrogenfosforečnanu draselného a obnoví se provzdušňování. Tento postup se opakuje jednou denně. Kalová jednotka musí být provozovaná podle zásad dobré laboratorní praxe: odtok musí být čirý, teplota musí být udržovaná při 25 ± 2 °C, pH má být 7 ± 1, kal má dobře sedimentovat, provzdušňování musí být dostatečné za všech okolností, mají být přítomni provoci a aktivita kalu se má kontrolovat pomocí referenční látky nejméně každé 3 měsíce. Takto získané inokulum se nepoužívá dříve než po 1 měsíci kultivace a déle než po čtyřech měsících. Proto je nutné odebírat vzorky ze zvolených 10 míst každé 3 měsíce.
K udržení stejné aktivity čerstvého a starého kalu se filtrovaný supernatant starého kalu smíchává se stejným objemem nového kalu a směs se kultivuje podle popsaného postupu. Do práce se kal bere 18 - 24 h po přídavku živin.

VII. 2. 4 Příprava baněk
Připravuje se 6 baněk podle schematu:
č. 1 zkoušená látka ve zřeďovací vodě 100 mg.l^-1
č. 2, 3, 4 zkoušená látka v minerálním médiu 100 mg.l^-1
č. 5 referenční látka (např. anilin) v minerálním médiu 100 mg.l^-1
č. 6 minerální médium
Málo rozpustné látky se přidávají přímo odvážením nebo odměřením objemu nebo se zpracují jak je uvedeno v příloze č. 3, s výjimkou těch, u kterých nemohou být použita rozpouštědla nebo emulgátory. Do speciálních uzávěrů lahví se přidá absorbent oxidu uhličitého. pH v baňkách č. 2, 3 a 4 se upraví na 7,0.

VII. 2. 5 Provedení zkoušky
Baňky č. 2, 3, 4 (zkušební suspenze), č. 5 (kontrola aktivity), č. 6 (slepý pokus) se inokulují malým množstvím inokula tak, aby výsledná koncentrace kalu byla 30 mg.l^-1. Láhev č. 1 je bez inokula, čímž se získává abiotická kontrola.Nasadí se zátka, zkontroluje se těsnost, zapnou se míchadla a započne se s měřením úbytku kyslíku za stíněných podmínek. Denně se kontroluje teplota, míchání, zapisovač spotřeby kyslíku a zaznamenávají se všechny změny barvy obsahu láhve. Při využití 6 křivkového zapisovače se získává přímo křivka BSK. Na konci inkubace, která je obvykle 28 dní, měří se pH v láhvi a stanovuje zbytková koncentrace zkoušené látky a jejich metabolitů a v případě zkoušení látek rozpustných ve vodě také DOC (postup podle přílohy 2). V případě těkavých látek se používá speciální postup. V případě výskytu nitrifikace se stanovují, jestliže je to možné, dusičnany a dusitany.

VII. 3. DATA A ZPRÁVA

VII. 3. 1 Zpracování výsledků
Spotřeba kyslíku zkoušenou látkou za daný čas v mg, korigovaná slepým pokusem za stejnou dobu, se dělí hmotností zkoušené látky v pokusu. Tento postup poskytuje výsledek vyjádřený jako spotřeba kyslíku v mg.mg^-1 zkoušené látky, což je:
$B S K = \frac{m g 0_{2} z k . l . - m g O_{2} (s l . p .)}{m g z k . l .} = m g O_{2} / m g z k . l .$
kde
zk. l. = zkoušená látka,
sl. p. = slepý pokus,
m = hmotnost zkoušené látky.
Procentický biologický rozklad se získá ze vztahu:
$% b i o l . r o z k l a d u = % T S K = \frac{B S K}{T S K} . 100$
Pro směsi se TSK vypočítává z elementární analýzy, tak jako pro jednoduché látky. Dosazuje se odpovídající TSK pro NH₄a NO₃ podle toho, zda se úplná nitrifikace vyskytuje či ne. V případě neúplné nitrifikace se vychází ze změn koncentrace NO₃a NO₂ podle přílohy 5.
Spočítá se procento primárního biologického rozkladu z úbytku původní chemické látky (viz I.7.2)
$D_{t} = \frac{S_{b} - S_{a}}{S_{b}} . 100 %$
V případě, že se v lahvi č. 1 zjistí fyzikálně-chemický úbytek původní látky zaznamená se tento jev a za koncentraci zkoušené látky (S_b) po 28 dnech se dosadí tato koncentrace.
V případě stanovení DOC (nepovinné) se úplná procentická biologická rozložitelnost počítá ze vztahu:
$D_{t} = 1 - \frac{C_{t} - C_{b t}}{C_{0} - C_{b o}} . 100$
Jestliže byl zjištěn úbytek DOC v láhvi č. 1, která měří abiotický rozklad, pak se do výpočtu dosazuje koncentrace DOC zjištěná v této láhvi.
Všechny výsledky se zaznamenají do souhrnu, jehož vzor je přiložen.

VII. 3. 2 Platnost výsledků
Slepý pokus mívá spotřebu kyslíku inokulem 20 - 30 mg.l^-1 a neměl by být větší než 60 mg.l^-1 v průběhu 28 dnů. Hodnoty větší než 60 mg.l^-1 vyžadují kritické vyhodnocení získaných dat a experimentální techniky. V případě, že pH je mimo rozsah 6 - 8,5 a spotřeba kyslíku zkoušenou látkou je menší než 60 %, zkouška by měla být opakována s nižší koncentrací látky.
Viz také I.5.2.
V případě, že rozklad anilinu, vypočítaný ze spotřeby kyslíku, nedosáhne 40 % po 7 dnech a 65 % po 14 dnech, je nutné zkoušku považovat za neplatnou.

VII. 3. 3 Zpráva
Viz I.8.

VII. 4 PŘEHLED VÝSLEDKŮ
Příklad uspořádání je uveden dále:
MITI (I) ZKOUŠKA

1. LABORATOŘ

2. DATUM ZAHÁJENÍ POKUSU

3. ZKOUŠENÁ LÁTKA
Název:
Koncentrace zásobního roztoku: mg.l^-1 jako látka
Počáteční koncentrace v médiu, Co: mg.l^-1 jako látka
Objem reakční směsi, V: ml
TSK: mg O₂.l^-1

4. INOKULUM

Lokality, odkud byly získány vzorky:
1) ...	6) ...
2) ...	7) ...
3) ...	8) ...
4) ...	9) ...
5) ...	10) ...

Koncentrace suspendovaných látek v aktivovaném kalu po aklimatizaci na syntetické splašky = ... mg.l^-1.
Objem aktivovaného kalu v konečném médiu = . . . ml
Koncentrace kalu v konečném médiu = . . . mg.l^-1

5. SPOTŘEBA KYSLÍKU: BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST
Typ použitého respirometru:

			Čas (dny)
			0	7	14	21	28
spotřeba kyslíku (mg) zkoušenou látkou	a₁
	a₂
	a₃
spotřeba kyslíku (mg) ve slepém pokuse	b
opravená spotřeba kyslíku (mg)	(a₁ - b) (a₂ - b) (a₃ - b)
BSK na mg zkoušené látky	$\frac{a - b}{C_{o} V}$	Lahev 1
		Lahev 2
		Lahev 3
% rozkladu		1
% rozkladu		2
$\frac{BSK}{TSK} . 100$		3
$\frac{BSK}{TSK} . 100$		průměr*

Poznámka: Podobný vzor může být použit pro referenční látku
* neprůměrovat, jestliže jsou mezi jednotlivými měřeními velké rozdíly

6. ANALÝZA UHLÍKU (nepovinně)
Analyzátor uhlíku:

Baňka	DOC		% odstraněného DOC	Průměr
Baňka	Změřeno	Opraveno	% odstraněného DOC	Průměr
Voda + zkoušená látka	a		-	-
Kal + zkoušená látka	b₁	b₁- c
Kal + zkoušená látka	b₂	b₂- c
Kal + zkoušená látka	b₃	b₃- c
Slepý pokud	c		-	-

7. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA

	Zbytek zkoušené chemikálie na konci zkoušky	% rozkladu
slepý pokus	S_b
inokulované medium	S_a1
	S_a1
	S_a₃

% rozkladu = [(S_b- S_a)/S_b].100
Počítá se pro lahve č. a1, a2, a3.

8. POZNÁMKY
Je-li k dispozici, může být připojena křivka BSK v závislosti na čase.