II AKUTNÍ TOXICITA PRO DAFNIE

1 METODA

1. 1 ÚVOD
Účelem této zkoušky je stanovit střední účinnou koncentraci zkoušené látky pro imobilizaci (EC₅₀) dafnií ve sladkovodním prostředí. Před začátkem experimentu je třeba mít v co nejúplnější míře k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi páry, o chemické stabilitě, o disociační kontantě a o biologické rozložitelnosti zkoušené látky.
Jak při plánování, tak i při interpretaci výsledků zkoušek je třeba brát v úvahu další údaje, jako např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, druh a procentuální podíl významných nečistot, přítomnost a množství přídavných látek, jakož i rozdělovací koeficient n-oktanol/voda.

1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY
Požadavek předpisů na stanovení LC₅₀ pro dafnie se naplňuje stanovením EC₅₀, jak je popsáno v této zkušební metodě.
Ve smyslu této zkušební metody se rozumí akutní toxicitou imobilizace dafnií střední efektivní (účinnou) koncentrací (EC₅₀). Je to taková koncentrace (vztaženo na výchozí koncentraci), která imobilizuje 50 % dafnií zkušební skupiny během doby působení (doby expozice).
Neschopnost plavání - imobilizace
Za neschopné plavání se považují ty dafnie, které po lehkém pohybu experimentální nádobou nevykazují během 15 sekund žádné plavací pohyby.
Veškeré koncentrace zkoušené látky se vyjadřují jako hmotnost na objem (mg.l^-1) nebo hmotnost na hmotnost (mg.kg^-1).

1. 3 REFERENČNÍ LÁTKY
Aby se prokázalo, že se reakce zkušebních dafnií za experimentálních podmínek v laboratoři podstatně nezměnila je možné provést kontrolní zkoušku s referenční látkou.
Referenční látky nejsou pro tuto zkoušku stanoveny.
Souhrn výsledků okružního testu laboratoří EHS s použitím 4 různých látek je uveden v příloze 2.

1. 4 PRINCIP METODY
Aby se prokázalo, že EC50 je vyšší než 100 mg.l^-1, může se provést limitní zkouška.
Dafnie se vystaví na 48 hodin účinku zkoušené látky přidané v různých koncentracích do vody. Použije-li se doba kratší, zdůvodní se ve zprávě.
Za jinak stejných experimentálních podmínek a v odpovídajícím rozmezí zkoušených koncentrací působí různé koncentrace dané zkoušené látky na schopnost plavání dafnií rozdílně. Při různých koncentracích se pak po uplynutí zkušební doby objeví vždy určité procentuální podíly dafnií neschopných plavání. Koncentrace způsobující neschopnost plavání u 0 % resp. 100 % se získají přímo pozorováním, zatímco hodnota EC₅₀ pro 48 hodin se získá, pokud je to možné, výpočtem.
Při této metodě se používá statický postup. Experimentální roztoky se tedy během doby expozice neobnovují.

1. 5 KRITÉRIA KVALITY
Kritéria kvality se vztahují na limitní i úplnou zkoušku.
Imobilizace v kontrolních skupinách nesmí přesáhnout 10 % na konci zkoušky.
Dafnie v kontrolních skupinách nesmí být zachyceny na povrchu vody.
Je žádoucí, aby koncentrace rozpuštěného kyslíku ve zkušebních nádobách zůstala vyšší než 3 mg.l^-1 po celou dobu zkoušky. Za žádných okolností nesmí poklesnout pod 2 mg.l^-1.
Koncentrace zkoušených látek by se měla udržet v rozmezí 80 % původních koncentrací po celou dobu trvání zkoušky.
U látek, které se lehce rozpouštějí ve zkušebním médiu a dávají stabilní roztoky (netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují či se neadsorbují), se počáteční koncentrace může pokládat za ekvivalentní nominální koncentrací. To, že se koncentrace udržela na určité úrovni po celou dobu zkoušky a že kritéria kvality byla dodržena musí být dokladováno.
Pro látky, které jsou:
musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená na začátku zkoušky. Koncentrace musí být stanovována po určitém období ustálení, ale před vnesením dafnií.
Ve všech případech se musí provádět další měření koncentrace během zkoušky za účelem stanovení aktuální expoziční koncentrace a kontroly dodržení kritérií kvality.
pH by se nemělo změnit o více než 1 jednotku.

(i) slabě rozpustné ve zkušebním médiu, nebo

(ii) schopné vytvářet stabilní emulze nebo disperze, nebo

(iii) nestabilní vodné roztoky,

1. 6 POPIS METODY

1. 6. 1 Činidla

1. 6. 1. 1 Roztoky zkoušených látek
Základní roztoky v požadovaných koncentracích se připraví rozpuštěním zkoušené látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1. 6. 1. 2.
Zvolené zkoušené koncentrace se připraví zředěním základního roztoku. Když se zkoušejí vysoké koncentrace, látka se může rozpustit přímo ve vodě.
Látky by měly být zkoušeny až do hranice jejich rozpustnosti. U některých látek (např. s nízkou rozpustností ve vodě, nebo vysokým P_ow , nebo spíše tvořících stabilní disperze než pravé roztoky ve vodě) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší než je hranice rozpustnosti, abychom si zajistili, že bude dosažena maximální rozpustná/stabilní koncentrace. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícím okysličení vody, atd).
Pro přípravu základních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě se mohou použít ultrazvuková dispergace, organická rozpouštědla či emulgační látky. Když jsou použity pomocné látky měly by všechny zkoušené vzorky a koncentrace, včetně kontrol obsahovat těchto látek stejné množství. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla přesáhnout 100 mg.l^-1 zkoušeného média.
Zkouška by se měla provádět bez korekcí pH. Dochází-li k výrazné změně pH, doporučuje se provést znovu zkoušku s korekcí pH a výsledky zaznamenat. V těchto případech by měla být hodnota pH základního roztoku přizpůsobena pH rozpouštědla (vody), pokud neexistují specifické důvody tak neučinit. Přednost se dává použití HCl a NaOH. Přizpůsobení pH nesmí ovlivnit významně koncentraci zkoušené látky v základním roztoku. Vznik chemické reakce nebo fyzikální precipitace ve zkušebním médiu jako následek přizpůsobení pH se musí zaznamenat.

1. 6. 1. 2 Voda pro kultivaci a zřeďování
Pro tuto zkoušku je možné používat každou vodu vhodnou ke kultivaci dafnií, ať je to přírodní nebo upravená voda (viz příloha 1, literatura (2): ISO 6341).
Aby nebylo nutné aklimatizovat dafnie na experimentální podmínky, doporučuje se pro kultivaci používat stejnou vodu jako pro zkoušku.

1. 6. 2 Přístroje
Používají se obvyklé přístroje a vybavení experimentálních pracovišť. Části, které přicházejí do styku se zkoušenými roztoky mají být nejlépe celé ze skla:
- přístroj pro měření koncentrace kyslíku (s mikroelektrodou, nebo jiný vhodný přístroj na měření koncentrace rozpuštěného kyslíku v malých vzorcích),
- přístroj pro měření teploty,
- pH metr,
- přístroj pro stanovení tvrdosti vody.

1. 6. 3 Pokusné organismy
Přednost se dává druhu Daphnia magna. Povolen je také druh Daphnia pulex. Jedinci musí být na začátku zkoušky mladší než 24 hodin, laboratorně odchovaní, bez zjevných nemocí, známého původu (např. chov - předchozí ošetření, manipulace).

1. 6. 4 Provedení zkoušky
Před vlastní zkouškou je možné provést předběžnou zkoušku. Touto předběžnou zkouškou se zjišťují informace o rozsahu koncentrací, které je možné použít ve vlastní zkoušce.
Mimo zkoušky s různými koncentracemi zkoušené látky je třeba provést kontrolní zkoušku bez zkoušené látky a kontrolní zkoušku s nosičem, pokud se nějaký při zkoušení používá.
Dafnie se exponují zkoušené látce, jak je popsáno dále:
Doba:
Nejlépe 48 hodin.
Počet jedinců:
Nejméně 20 na každou koncentraci, nejlépe rozděleně ve 4 skupinách po 5 dafniích nebo ve 2 skupinách po 10 dafniích.
Množství média:
Nejméně 2 ml zkušebního roztoku na 1 dafnii.
Koncentrace při zkoušce:
Zkušební roztok je třeba připravit bezprostředně před nasazením dafnií, pokud možno jen s vodou jako jediným rozpouštědlem. Koncentrace se připraví jako geometrická řada s činitelem nepřevyšujícím 2,2. Spolu s kontrolní zkouškou je třeba použít koncentrace, které dostačují k vyvolání 0 % a 100 % neschopnosti plavání, jakož i řadu koncentrací mezi těmito hodnotami, umožňující výpočet hodnoty EC₅₀ pro 48 hodin.
Voda: Viz 1. 6. 1. 2.
Světlo: Žádoucí je cyklus světla a tmy.
Teplota: Teplota musí být v rozmezí od 18 °C do 22 °C. Pro každou jednotlivou zkoušku má však zůstat konstantní v mezích ± 1 °C.
Provzdušňování: Zkušební roztoky je třeba provzdušňovat jen lehce. Nesmí být provzdušňovány probubláváním.
Krmení: Žádné.
Na konci zkoušky je třeba stanovit pH a obsah rozpuštěného kyslíku pro kontrolní zkoušky a pro každou koncentraci. Hodnota pH zkušebních roztoků se nesmí změnit.
Těkavé sloučeniny je třeba zkoušet v uzavřených nádobách naplněných po okraj, dostatečně velkých, aby se vyloučil nedostatek kyslíku.
Dafnie se pozorují nejpozději po 24 hodinách a znovu po 48 hodinách expoziční doby.
Limitní zkouška
S využitím postupů popsaných v této metodice se může provádět limitní zkouška při 100 mg.l^-1 za účelem prokázání faktu, že EC₅₀ je vyšší než tato koncentrace.
Jestliže je povaha zkoušené látky taková, že nelze dosáhnout ve vodě koncentrace 100 mg.l^-1, měla by být provedena limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) v použitém médiu (viz také bod 1. 6. 1. 1).
Limitní zkouška by měla být prováděna na 20 dafniích, rozdělených do 4 skupin, se stejným počtem v kontrolní skupině. Jestliže dojde k imobilizaci, musí se provést úplné zkoušení.

2 ÚDAJE A VYHODNOCENÍ
Neschopnost plavání pro každou koncentraci po 24 a 48 hodinách expoziční doby se vynese na papír s pravděpodobnostním rastrem proti koncentraci. Body se propojí přímkou. Odečte se koncentrace, která odpovídá 50 %-nímu účinku.
Pro každou dobu pozorování se stanoví standardními metodami, pokud to dovolují získané údaje, EC₅₀ a rozsah její spolehlivosti (P = 0,05); výsledky se zaokrouhlují na jedno nebo nejvýše na dvě významná místa ( příklad zaokrouhlování na dvě místa: 170 pro 173,5; 0,13 pro 0,127; 1,2 pro 1,21)
Pokud je průběh křivky závislosti účinku na koncentraci pro výpočet EC₅₀ příliš strmý, stačí grafický odhad této hodnoty.
Vyvolávají-li dvě po sobě následující koncentrace, které se liší o činitele 2,2, neschopnost plavání 0 % a 100 %, pak je to postačujícím průkazem toho, že EC₅₀ leží v této oblasti.
Pokud se pozoruje, že není možné zachovat stabilitu nebo homogenitu zkoušené látky, je to třeba uvést ve zprávě z experimentu a příslušným způsobem to zohlednit při interpretaci výsledků.

3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
Závěrečná zpráva má, je-li to možné, obsahovat:
- údaje o použitých organismech (vědecký název, kmen, chovatel nebo zdroj odběru, zacházení před zkouškou, metoda odchovu včetně původu, druh a množství potravy, frekvence krmení),
- počet dafnií použitých při každé zkušební koncentraci,
- přehled použitých koncentrací a veškeré informace, které jsou k dispozici o stabilitě zkoušené látky v použitých roztocích,
- popis experimentálních nádob, objem příslušného zkušebního média, počet jedinců na nádobu,
- při provádění chemických analýz údaj o použitých metodách a výsledky,
- původ zřeďovací vody a její nejdůležitější chemické vlastnosti (pH, teplota, tvrdost),
- metody přípravy základních a zkušebních roztoků v případě zkoušení ve vodě málo rozpustné látky,
- koncentrace všech nosičů (organická rozpouštědla, dispergační činidla, apod.),
- poměry osvětlení,
- nejvyšší použitá zkušební koncentrace, při které v průběhu zkoušky nedošlo k inhibici dafnií,
- nejnižší použitá zkušební koncentrace, při které v průběhu zkoušky došlo ke 100 % inhibici dafnií,
- tabulku kumulativní neschopnosti plavání při kontrolní zkoušce, při kontrolním zkoušce s nosičem a při každé zkušební koncentraci v doporučených intervalech pozorování (24 hodin nebo 24 a 48 hodin),
- hodnoty EC₅₀ v každém doporučeném intervalu pozorování (pokud možno s 95 % mezí spolehlivosti),
- grafické znázornění křivky závislosti účinku na koncentraci na konci zkoušky,
- je-li to možné, stoupání a 95 % mez spolehlivosti,
- použité statistické metody stanovení hodnot EC₅₀,
- koncentrace rozpuštěného kyslíku, hodnoty pH, teplota v roztocích při testu,
- při použití referenční látky údaj o výsledcích,
- důkaz, že byla splněna kritéria kvality,
- popis vybavení,
- výsledky limitního zkoušky.

4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 202. Decision of the Council, C (81) 30 final.

(2) International Standard ISO, Water Quality - Determination of inhibition of mobility od Daphnia magna Straus, ISO 6341 - 1989.

(3) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera - crustacea ) NFT 90 301(January 1983).

(4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamt zum akuten Fisch - Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) a (L 11).

(6) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K., 1978.

(7) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. A simplified method for evaluating dose effects experiments. J. Pharm. Exp. Therap., Vol. 96, 1949, s. 99.

(8) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity, Water Res., 1969, vol. 3, 793 - 821.

(9) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, vol. 4, 3 - 32.

(10) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84

(11) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.