2.2 Fyzikální a fyzikálně-chemické metody

2.2.6 Index lomu 1)

Index lomu n^t_λ prostředí vztažený na vzduch se udává jako poměr sinu úhlu dopadu paprsku světla ve vzduchu k sinu úhlu lomu paprsku světla v daném prostředí.
Pokud není uvedeno jinak, měří se index lomu při (20 ± 0,5) °C při vlnové délce D-linie sodíkového světla (λ = 589,3 nm); užívaný symbol je potom $n_D^{20}$.
Přístroje na měření indexu lomu – refraktometry obvykle stanovují mezní úhel. Základní částí těchto přístrojů je hranol o známém indexu lomu, který je ve styku se zkoušenou kapalinou.
Ke kalibraci přístroje se použijí referenční kapaliny uvedené v tabulce. 2.2.6-1. Hodnota indexu lomu každé referenční kapaliny je uvedena v označení na obalu.
Tab. 2.2.6-1

Referenční kapalina	Δn/Δt (teplotní koeficient)
trimethylpentan CRL	-0,00049
toluen CRL	-0,00056
methylnaftalen CRL	-0,00048

Při použití bílého světla je refraktometr vybaven příslušným kompenzačním zařízením. Přístroj umožňuje přesný odečet nejméně na tři desetinná místa a je vybaven zařízením umožňujícím práci při předepsané teplotě. Stupnice teploměru je dělena po 0,5 °C nebo přesněji.

2.2.27 Tenkovrstvá chromatografie

Tenkovrstvá chromatografie je separační metoda, u které stacionární fázi tvoří vhodný materiál nanesený v rovnoměrné tenké vrstvě na skleněný, kovový nebo plastový podklad (desku). Roztoky stanovovaných látek se na vrstvu nanášejí před vyvíjením. Separace je založena na adsorpci, dělení, iontové výměně nebo na kombinaci těchto mechanismů a dochází k ní migrací (vyvíjením) rozpuštěných látek (roztoky analytů) tenkou vrstvou stacionární fáze v rozpouštědle nebo vhodné směsi rozpouštědel (mobilní fáze).
Zařízení
Desky. Chromatografie se provádí na vrstvou potažených deskách popsaných ve stati Zkoumadla (4.1.1).
Předběžná úprava vrstev. Před separací mohou být vrstvy, je-li třeba, promyty, např. může být provedena migrace vhodným rozpouštědlem. Vrstvy mohou být rovněž impregnovány vyvíjením, ponořením nebo postřikem. Je-li nutné, vrstvy je možno před použitím aktivovat zahřátím v sušárně při 100 °C až 105 °C po dobu 1 h.
Chromatografická komora s plochým nebo dvojžlábkovým dnem z inertního průsvitného materiálu vhodné velikosti pro použité desky, opatřená dobře těsnicím víkem. Komora pro horizontální vyvíjení je opatřena žlábkem pro mobilní fázi a přídavným zařízením umožňujícím přímý kontakt mobilní fáze a stacionární fáze.
Mikropipety, mikroinjekční stříkačky, kalibrované kapiláry pro jedno použití nebo jiné nanášecí zařízení, které je vhodné pro správné nanášení roztoku.
Fluorescenční detekční zařízení pro přímé hodnocení fluorescence nebo zhášení fluorescence.
Detekční činidla pro detekci oddělených skvrn postřikem, vystavením vlivu par nebo ponořením.
Pracovní postup
Vertikální vyvíjení. Stěny chromatografické komory se vyloží filtračním papírem. Do chromatografické komory se nalije podle její velikosti takové množství mobilní fáze, aby po impregnaci filtračního papíru byla vrstva ponořena do vhodné hloubky vzhledem k rozměrům použité desky. Pro nasycení se komora uzavře víkem a nechá se stát 1 h při 20 °C až 25 °C. Není-li předepsáno jinak, chromatografická separace se provádí v nasycené komoře.
Nanese se předepsaný objem roztoků po dostatečně malých dávkách ve formě proužku nebo kruhových skvrn ve vhodné vzdálenosti od spodního okraje a bočních okrajů desky. Roztoky se nanášejí na start rovnoběžně se spodním okrajem desky tak, aby vzdálenost mezi skvrnami byla nejméně 10 mm.
Po odpaření rozpouštědla z nanesených roztoků se vrstva vloží do chromatografické komory tak aby byla v co nejvíce vertikální poloze a skvrny nebo proužky byly nad hladinou mobilní fáze. Komora se uzavře, udržuje se při teplotě 20 °C až 25 °C a chrání se před slunečním světlem. Deska se vyjme, když mobilní fáze dosáhne předepsané vzdálenosti, vysuší se a deteguje se předepsaným způsobem.
Pro dvojrozměrnou chromatografii se vrstva po prvním vyvíjení vysuší a provede se druhé vyvíjení ve směru kolmém na směr prvního vyvíjení.
Horizontální vyvíjení. Nanese se předepsaný objem roztoků po dostatečně malých dávkách tak, aby vznikly kruhové skvrny o průměru 1 mm až 2 mm nebo proužky 5 mm až 10 mm x 1 mm až 2 mm ve vhodné vzdálenosti od spodního okraje a bočních okrajů desky. Roztoky se nanášejí na start rovnoběžně se spodním okrajem desky tak, aby vzdálenost mezi skvrnami byla nejméně 5 mm. Po odpaření rozpouštědla z nanesených roztoku se pomocí injekční stříkačky nebo pipety vnese do žlábku vyvíjecí komory vhodné množství mobilní fáze, deska se do chromatografické komory umístí horizontálně a spojí se zařízením podle pokynů výrobce s mobilní fází. Je-li předepsáno, vyvíjení se započne simultánně z obou stran. Komora se uzavře a udržuje se při teplotě 20 °C až 25 °C. Deska se vyjme, když mobilní fáze dosáhne vzdálenosti předepsané v článku, vysuší se a chromatogram se deteguje předepsaným způsobem.
Pro dvojrozměrnou chromatografii se vrstva po prvním vyvíjení vysuší a provede se druhé vyvíjení ve směru kolmém na směr prvního vyvíjení.
Vizuální hodnocení
Zkouška totožnosti. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku se vizuálně porovnává s odpovídající skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku porovnáním barvy, velikosti a retenčního faktoru (R_F) obou skvrn.
Retenční faktor (R_F) je definován jako poměr vzdálenosti koncentračního vrcholu (obvykle střed skvrny) ke vzdálenosti čela mobilní fáze, měřeno od místa nanášení.
Ověření separační schopnosti pro zkoušky totožnosti. Obvykle je dostačující provedeni testu způsobilosti popsaného ve stati Zkoumadla (4.1.1). Pouze ve zvláštních případech může být v článku předepsáno další kritérium pro test způsobilosti.
Zkouška na příbuzné látky. Vedlejší skvrna (skvrny) na chromatogramu zkoušeného roztoku se vizuálně porovnává (porovnávají) s odpovídající(mi) skvrnou (skvrnami) na chromatogramu porovnávacího roztoku obsahujícího nečistotu (nečistoty) nebo se skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku připraveného ředěním zkoušeného roztoku.
Ověření separační schopnosti. Požadavky na ověření separační schopnosti jsou uvedeny v příslušném článku.
Ověření detekční schopnosti. Detekční schopnost je dostatečná, je-li skvrna nebo proužek na chromatogramu nejzředěnějšího porovnávacího roztoku zřetelně viditelná.
Kvantitativní stanovení
Požadavky na rozlišení a separaci jsou uvedeny v jednotlivých článcích.
Látky detegovatelné v ultrafialovém nebo denním světle separované tenkovrstvou chromatografií mohou být stanoveny přímo na desce za použití vhodného přístrojového vybavení. Deska se hodnotí měřením reflektance nebo transmitance dopadajícího světla, přičemž se pohybuje bud deska nebo měřicí zařízení. Podobně za použití vhodného optického systému muže byt měřena fluorescence. Látky obsahující radionuklidy mohou být kvantifikovaný třemi způsoby: buď přímým měřením radioaktivity podél celého chromatogramu (viz Radiofarmaca), nebo po rozstřihání desky na proužky měřením radioaktivity každého jednotlivého proužku za použiti vhodného detektoru, anebo po seškrabání stacionární fáze a rozpuštění ve vhodném scintilačním roztoku měřením jeho radioaktivity za použití kapalinového scintilačního detektoru.
Zařízení. Přístrojové vybavení pro přímé měření na desce se skládá:
- ze zařízení pro přesné umístění a reprodukovatelné dávkování objemu připravených roztoků na vrstvu,
- z mechanického zařízení pro pohyb desky nebo měřícího zařízení ve směru osy x nebo osy y,
- ze zapisovače a vhodného integrátoru nebo počítače,
- pro látky detegovatelné v ultrafialovém nebo denním světle: pro měření reflektance nebo transmitance fotometr se zdrojem světla, optické zařízení schopné generovat monochromatické světlo a fotoelektrický článek odpovídající citlivosti; pro měření fluorescence kromě toho monochromatický filtr pro vyčlenění určité spektrální oblasti vyzářeného světla,
- pro látky obsahující radionuklidy: vhodný detektor radioaktivity, u kterého musí byt ověřena oblast linearity.
Postup. Připraví se předepsaným způsobem zkoušený roztok, a je-li třeba, připraví se i porovnávací roztoky stanovované látky ve stejném rozpouštědle jako zkoušený roztok. Nanesou se stejné objemy všech připravených roztoků a chromatogram se vyvine.
Látky detegovatelné v ultrafialovém nebo denním světle: Připraví a nanesou se nejméně tři porovnávací roztoky, v nichž jsou koncentrace zkoušené látky v rozpětí jejího očekávaného obsahu ve zkoušeném roztoku (přibližně 80 %, 100 % a 120 %). Po skončeném vyvíjení se provede, je-li třeba, detekce předepsaným činidlem a zaznamená se reflektance, transmitance nebo fluorescence chromatogramů zkoušeného roztoku a porovnávacích roztoků. Naměřené hodnoty se použijí pro výpočet množství látky ve zkoušeném roztoku.
Látky obsahující radionuklidy: Připraví a nanese se zkoušený roztok, jehož koncentrace je přibližně 100 % očekávaného obsahu. Stanoví se celková radioaktivita a radioaktivita každého jednotlivého píku se vyjádří jako procento z celkového množství radioaktivity.
Není-li předepsáno jinak, lze výsledky stanovení hodnotit, jestliže rozlišení (R_s) mezi měřenými píky na chromatogramu je větší než 1,0.
Rozlišení (R_s) se vypočte ze vzorce:
$R_s=\frac{\mathrm{1,18}·\left(Z_b-Z_a\right)}{b_{\mathrm{0,5}a}+b_{\mathrm{0,5}b}},$
$Z_b>Z_a,$
v němž značí:
Z_b, Z_a - vzdálenosti podél základní linie mezi bodem nanesení vzorku a kolmicemi spuštěnými z vrcholů dvou sousedních píků (mm),
b_0,5a, b_0,5b - šířky píků v polovině jejich výšky (mm).
Jestliže se limitní řada nečistot hodnotí fotometricky, je důležitým parametrem pro stanovení detekčního limitu poměr signálu k šumu (S/N).
Poměr signálu k šumu (S/N) se vypočítá ze vzorce:
$\frac{S}{N}=\frac{2H}{h},$
v němž značí:
H - výšku píku odpovídajícího stanovované složce na chromatogramu získaném s předepsanou porovnávací látkou, měřenou z maxima píku k základně signálu sledovaného po dráze odpovídající 20násobku šířky píku v polovině jeho výšky,
h - maximální amplitudu šumu pozadí na chromatogramu kontrolního roztoku získaného při slepé zkoušce, sledovaného po dráze odpovídající 20násobku šířky píku v polovině jeho výšky na chromatogramu předepsané porovnávací látky a sledovaného v místě rovnoměrně situovaném okolo místa, kde by se tento pík nacházel.

2.2.41 Cirkulární dichroismus

Jako cirkulární dichroismus se označuje rozdíl absorbancí levotočivé a pravotočivě cirkulárně polarizovaného světla u opticky aktivní látky v oblasti jejího absorpčního pásu.
Přímé měření poskytuje střední algebraickou hodnotu:
$\Delta A=A_L-A_{R,}$
ΔA - diferenční cirkulárně dichroická absorbance,
A_L - absorbance levotočivě cirkulárně polarizovaného světla,
A_R - absorbance pravotočivě cirkulárně polarizovaného světla.
Cirkulární dichroismus se vypočítá podle rovnice:
$\Delta \epsilon ={\epsilon }_L-{\epsilon }_R=\frac{\Delta A}{c·l},$
Δε - molární cirkulární dichroismus nebo molární diferenční dichroická absorptivita vyjádřená v litr.mol^-1.cm^-1,
ε _L - molární absorptivita (2.2.25) levotočivé cirkulárně polarizovaného světla,
ε _R - molární absorptivita pravotočivě cirkulárně polarizovaného světla,
c - koncentrace zkoušeného roztoku v mol.l^-1,
l - tloušťka vrstvy v cm.
K charakterizaci cirkulárního dichroismu se mohou používat také následující veličiny:
Faktor dissymetrie:
$g=\frac{\Delta \epsilon }{\epsilon },$
ε - molární absorptivita (2.2.25).
Molární elipticita:
Některé typy přístrojů měří přímo hodnotu elipticity Θ, vyjádřenou ve stupních. Při použití těchto přístrojů může být molární elipticita vypočítána pomocí následující rovnice:
$\left[\Theta \right]=\frac{\Theta .M}{c.l.10}$
[Θ] - molární elipticita vyjádřená ve stupních.cm².decimor^-1,
Θ - hodnota elipticity odečtená na přístroji,
M - relativní molekulová hmotnost zkoušené látky,
c - koncentrace zkoušeného roztoku v g.ml^-1,
l - tloušťka vrstvy v centimetrech.
Vzájemný vztah mezi molární elipticitou a molárním cirkulárním dichroismem udává následující rovnice:
$\left[\Theta \right]=\mathrm{2,303}\Delta \epsilon \frac{4500}{\pi }\approx 3300\Delta \epsilon .$
Molární elipticita se často používá při analýze bílkovin a nukleových kyselin. V tomto případě se molární koncentrace vyjadřuje jako monomerní zbytek vypočítaný pomocí výrazu:
$\frac{molekulová hmotnost}{počet aminokyselin}.$
Střední relativní molekulová hmotnost monomerního zbytku je 100 až 120 (obvykle 115) pro bílkoviny a asi 330 pro nukleové kyseliny (ve formě sodných solí).
Zařízení. Zdrojem světla (S) je xenonová lampa; světlo prochází dvojitým monochromátorem (M) s křemennými hranoly (P₁, P₂).
Lineární světelný paprsek z prvního monochromátoru je štěpen na dvě složky, které jsou v druhém monochromátoru polarizovány v pravých úhlech. Výstupní štěrbina v monochromátoru eliminuje mimořádný paprsek.
Získané polarizované monochromatické světlo prochází opticky aktivním modulátorem (Cr); výsledkem je střídavé cirkulárně polarizované světlo.
Paprsek pak prochází zkoumaným vzorkem (C ) a dopadá na fotonásobič (PM) spojený se zesilovačem, který produkuje dva elektrické signály: jedním je stejnosměrný proud V_c a druhým střídavý proud s modulační frekvencí V_ac charakteristickou pro zkoušený vzorek. Fáze udává znaménko cirkulárního dichroismu. Poměr V_ac/ V_c je úměrný diferenční absorpci ΔA, která vytvořila signál. Dichrograf běžně pracuje v oblasti vlnových délek 170 nm až 800 nm.
Kalibrace přístroje.
Přesnost stupnice absorbance. 10,0 mg isoandrosteronu R se rozpustí v dioxanu R a zředí se stejným rozpouštědlem na 10,0 ml. Spektrum cirkulámího dichroismu roztoku se zaznamená v rozmezí vlnových délek 280 nm až 360 nm. V maximu při 304 nm hodnota Δε je +3,3.
Pro toto měření může být použit také roztok (1S)-(+)-10-kafrsulfonové kyseliny R.
Linearita modulace. 10,0 mg (1S)-(+)-10-kafrsulfonové kyseliny R se rozpustí ve vodě R a zředí se stejným rozpouštědlem na 10,0 ml. Přesná koncentrace kafrsulfonové kyseliny v roztoku se určí ultrafialovou spektrofotometrii (2.2.25) s použitím hodnoty specifické absorbance 1,49 při 285 nm.
Spektrum cirkulárního dichroismu se zaznamená mezi 185 nm a 340 nm. V maximu při 290,5 je hodnota Δε +2,2 až +2,5. V maximu při 192,5 nm je změřená hodnota Δε -4,3 až -5.
Pro kalibraci může být také použit (1S)-(+) nebo antipod (1R)-(-)-amonium-10-kafrsulfonat R.

Obr. 2.2.41-1 Optické schéma dichrografu