bod 2 · 296/1999 Sb.

2 Zkušební metody
Gummi manducabile medicinale
Léčivé žvýkací gumy
Léčivé žvýkací gumy jsou tuhé jednodávkové přípravky, které jsou tvořeny hlavně gumou určenou ke žvýkání, nikoli k polykání.
Obsahují jednu nebo více léčivých látek, které se uvolňují při žvýkání. Podle rozpouštění nebo rozptýlení léčivé látky (látek) ve slinách jsou žvýkací gumy určeny k použití při:
- místní léčbě onemocnění dutiny ústní,
- systémové distribuci po absorpci sliznicí dutiny ústní nebo gastrointestinálním traktem.
Výroba
Léčivé žvýkací gumy jsou vyráběny ze žvýkacího polymerního základu, který je bez chuti a je tvořen přírodními nebo syntetickými elastomery. Mohou obsahovat další pomocné látky, jako jsou plniva, změkčovadla, sladidla, aromatické přísady, stabilizátory, barviva a plastifikátory schválené oprávněnou autoritou.
Léčivé žvýkací gumy jsou vyráběny lisováním, případně změkčením nebo tavením žvýkacího polymerního základu a postupným přidáváním dalších látek. V případě tavení jsou žvýkací gumy zpracovány do požadovaného tvaru. Pokud je nutná ochrana před vlhkostí a světlem, mohou být potaženy ochranným povlakem.
Není-li předepsáno a schváleno jinak, provádí se vhodná zkouška prokazující průběh uvolňování účinných látek.
Při výrobě, balení, skladování a distribuci léčivých žvýkacích gum se využívá vhodných prostředků k zajištění jejich mikrobiální kvality; odpovídající doporučení jsou uvedena ve stati Mikrobiologická jakost léčivých přípravků (5.1.4).
Zkoušky na čistotu
Obsahová stejnoměrnost (2.9.6). Pokud není oprávněnou autoritou stanoveno jinak, žvýkací gumy s obsahem účinné látky menším než 2 mg nebo menším než 2 % celkové hmotnosti vyhovují zkoušce A na obsahovou stejnoměrnost jednodávkových lékových forem. Jestliže přípravek obsahuje více účinných látek, stanovení se provede pouze u těch látek, které odpovídají výše uvedeným podmínkám.
Hmotnostní stejnoměrnost (2.9.5). Nepotažené i potažené žvýkací gumy (pokud není předepsáno a schváleno jinak) vyhovují zkoušce na hmotnostní stejnoměrnost pevných jednodávkových lékových forem. Jestliže zkouška na obsahovou stejnoměrnost je předepsána pro všechny účinné látky, není zkouška na hmotnostní stejnoměrnost požadována.
Uchovávání
Nepotažené léčivé žvýkací gumy se uchovávají za ochrany před vlhkostí a světlem.
Inhalanda
Inhalační přípravky
Jsou to tekuté nebo tuhé přípravky určené k podání ve formě par nebo aerosolů do plic k místnímu nebo celkovému účinku. Obsahují jednu nebo několik léčivých látek rozpuštěných nebo dispergovaných ve vhodném vehikulu.
Inhalační přípravky mohou, podle typu přípravku, obsahovat propelenty, rozpouštědla, ředidla, protimikrobní přísady, solubilizátory nebo stabilizátory apod. Pomocné látky nemají nepříznivý účinek na funkci mukózy nebo cilií v dýchacích cestách.
Inhalační přípravky se dodávají ve vícedávkových nebo jednodávkových obalech. Jsou-li v tlakovém balení, vyhovují požadavkům článku Praeparata pharmaceutica in vasis cum pressu.
Přípravky určené k podání ve formě aerosolů (disperze pevných nebo kapalných částic v plynu) se aplikují jedním z těchto zařízení:
- rozprašovačem (nebulizerem),
- dávkovacím tlakovým inhalátorem,
- inhalátorem pro suchý prášek.
Výroba
Při vývoji inhalačního přípravku obsahujícího protimikrobní přísadu má být prokázána účinnost této přísady k uspokojení oprávněné autority. Vhodná metoda zkoušení a kritéria pro posouzení konzervačních vlastností v daném složení přípravku jsou popsány ve stati Účinnost protimikrobních konzervačních látek (5.1.3).
Kontrola velikosti inhalováných aerosolových částic zajistí, aby se podstatná část částic dostala do plic. Frakce jemných částic inhalačních přípravků se stanoví vhodnou metodou pro Aerodynamické stanovení jemných částic (2.9.18).
Při stanovení stejnoměrnosti podané dávky může výrobce použít alternativní postupy posuzující více inhalátorů. Tak má být zajištěno splnění lékopisných požadavků u všech inhalátorů.
Tlakové dávkovači inhalátory jsou zkoušeny na těsnost a kontaminaci cizími částicemi.
Označování
V označení na obalu dávkovaného přípravku se uvede:
- aplikační dávka, s výjimkou přípravků, pro které byla dávka pevně stanovena jako odměřená dávka,
- kde je to vhodné, počet podání (střiků, insuflací) z balení pro dosažení minimální doporučené dávky,
- počet dávek v balení přípravku.
Kde je to vhodné, v označení na obalu se uvádějí názvy všech protimikrobních přísad.
Inhalanda liquida
Tekuté inhalační přípravky
Lze rozlišit tři druhy tekutých inhalačních přípravků:
- přípravky určené k vypařování,
- tekutiny k rozprašování,
- dávkované tlakové přípravky pro inhalaci.
Tekuté inhalační přípravky jsou roztoky nebo disperze.
Disperze jsou snadno homogenizovatelné protřepáním a jsou natolik stabilní, aby bylo umožněno podání správné dávky. Mohou se použít vhodné pomocné látky.
Inhalanda vaporem formantia
Inhalační přípravky tvořící páry
Jsou to roztoky, disperze nebo tuhé přípravky, které se obvykle přidávají do horké vody a výpary se inhalují.
Liquida nebulam formantia
Kapaliny pro rozprašování
Jsou to přípravky určené k přeměně na aerosoly pomocí kontinuálně pracujících rozprašovačů nebo dávkovacích rozprašovačů. Tvoří je roztoky, suspenze nebo emulze. Ke zlepšení rozpustnosti léčivých látek lze použít vhodná rozpouštědla a solubilizátory.
Kapaliny pro rozprašování v koncentrovaném stavu se před použitím v kontinuálně pracujících rozprašovačích ředí na předepsaný objem předepsanou kapalinou. Kapaliny pro rozprašování mohou být také připraveny z prášků.
Vodné tekutiny v kontinuálně pracujících rozprašovačích mají hodnotu pH 3 až 8,5.
Suspenze a emulze se snadno zhomogenizují protřepáním a zůstávají dostatečně stabilní, což umožní podat správnou dávku.
Vodné přípravky pro inhalaci se dodávají ve vícedávkových obalech. Pokud přípravek nemá přiměřené protimikrobní vlastnosti, může obsahovat vhodnou protimikrobní přísadu v odpovídající koncentraci.
Kontinuálně pracující rozprašovače jsou zařízení přeměňující kapaliny na aerosoly pomocí vysokého tlaku plynů, ultrazvukových vibrací nebo jinými způsoby. Tato zařízení umožňují při vhodné rychlosti tvorbu částic o vhodné velikosti, a tím jejich inhalaci a vpravení do plic.
Dávkovací rozprašovače jsou zařízení přeměňující kapaliny na aerosoly pomocí vysokého tlaku plynů, ultrazvukových vibrací nebo jinými způsoby. Objem kapaliny tvořící aerosol je odměřen tak, aby dávka aerosolu mohla být inhalována jedním vdechnutím.
Inhalanda in vasis cum pressu doses emittentia
Dávkované tlakové přípravky pro inhalaci
Jsou to roztoky, suspenze nebo emulze dodávané ve speciálních nádobách (tlakovkách) opatřených dávkovacím ventilem. Tyto přípravky jsou udržovány pod tlakem vhodnými hnacími plyny nebo vhodnou směsí zkapalněných propelentů, které mohou být současně rozpouštědly. Mohou se přidat vhodná rozpouštědla, solubilizátory a stabilizátory.
Podaná dávka je dávka, která je z inhalátoru podána pacientovi. U některých přípravků je dávka pevně stanovena jako odměřená dávka. Odměřenou dávku určuje množství přípravku vložené do zařízení. Odměřenou dávku lze stanovit také přímo.
Zkoušení
Stejnoměrnost podané dávky. Tlakové nádoby se obvykle používají v obrácené poloze. Pro nádoby, s nimiž se pracuje ve vzpřímené poloze, se použije srovnatelná zkouška využívající metod zajišťujících úplné zachycení podané dávky uvolněné z ventilu u vzpřímené tlakovky. Inhalátor se vždy připraví podle pokynů v instrukcích pro pacienta.
Použije se zařízení kvantitativně zachycující podanou dávku.
Vhodné zařízení je na obrázku 1. Skládá se z držáku filtru, sběrné trubice a adaptéru pro náustek inhalátoru. V držáku filtru je podložka pro filtr, např. mřížka z nerezové oceli. Sběrnou trubici lze přišroubovat nebo upevnit k držáku filtru. Adaptér má vzduchotěsně upevnit náustek inhalátoru k zařízení. Použije se adaptér, který zajistí, aby čelo náustku bylo zarovnáno se vstupní částí sběrné trubice. Přípojka na vakuum se spojí se systémem zahrnujícím zdroj vakua a regulaci průtoku. Sání vzduchu procházejícího celým zařízením, zahrnujícím filtr a nasazený inhalátor, je upraveno na rychlost (28,3 ± 1,5) 1/min. Vzduch by měl kontinuálně procházet zařízením tak, aby byla vyloučena ztráta léčiva do atmosféry. Držák filtru je uzpůsoben k použití kruhových filtrů o průměru 25 mm. Filtr a další materiály tvořící zařízení jsou kompatibilní s léčivem a rozpouštědly, které se použijí k extrakci léčiva z filtru. Jeden konec sběrací trubice je přizpůsoben k těsnému uchycení kruhového filtru k základní části držáku filtru. Po sestavení jsou jednotlivé spoje zařízení vzduchotěsné. Připojením vakua k držáku filtru veškerý vzduch procházející sběracím zařízením prošel inhalátorem.
Hodnotí se první tři dávky z plného obalu přípravku, čtyři dávky z poloprázdného a dále poslední tři dávky podle počtu dávek udaných na obalu.
Není-li v instrukcích pro pacienty předepsáno jinak, třepe se inhalátorem 5 s a vystříkne se jednou do odpadu. Po připojení k zařízení se vystříkne aerosol stisknutím ventilu na dobu zajišťující kompletní výstřik. Celý postup se opakuje, až počet vystříknutí odpovídá minimálně doporučené dávce. Extrahuje se, kvantitativně se shromáždí obsah ze zařízení a stanoví se množství účinné látky.
Postup se opakuje s dalšími dvěma dávkami.
Přípravek se vyprazdňuje do odpadu s přestávkami nejméně 5 s mezi jednotlivými výstřiky tak dlouho, až v obalu zůstane nl2 + 1 dávka, kde n je počet dávek uvedených v označení na obalu. Výše popsaným postupem se nyní stanoví obsahy čtyř dávek.
Přípravek se dále vyprazdňuje do odpadu s přestávkami nejméně 5 s mezi jednotlivými výstřiky, až v obalu zůstanou tři dávky. Výše popsaným postupem se nyní stanoví obsahy tří dávek.
U přípravků obsahujících více účinných látek se provede zkouška stejnoměrnosti podané dávky pro každou účinnou látku.

Obr. 1. Sběrné zařízení pro dávkové tlakové přípravky
Rozměry v milimetrech
Tab. 1. Specifikace dílů k obr. 2

Označení	Název	Popis
A	sběrná trubice	je schopna zachytit podanou dávku, např. trubice pro sběr dávky viz obr. 1., s rozměry: vnitřní průměr 34,85 mm, délka 12 cm (např. výrobek č. XX40047 00, Millipore Corp., Bedford, MA 01732 s upravenou výstupní trubkou, vnitřní průměr ≥8 mm, přizpůsobený výrobku fy Gelman č. 61631) nebo ekvivalentní
B	filtr	47 mm filtr, např. A/E filtr ze skleněných vláken (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI 48106) nebo ekvivalentní
c	spojka	vnitřní průměr ≥8 mm, např. krátká kovová spojka, s odbočkou k P3 s malým průměrem
D	vakuová hadice	vnitřní průměr (8 ± 0,5) mm, délka (50 ± 10) cm, např. silikonová hadice vnějšího průměru asi 14 mm a vnitřního průměru asi 8 mm
E	dvoucestný solenoidový ventil	ústí s minimálním odporem průtoku vzduchu, vnitřním průměrem >8 mm a maximálním časem odezvy 100 ms (např. typ 256-A08, Burkert GmbH, D7118) nebo ekvivalentní
F	vývěva	vyhovuje kapacitou pro požadovanou rychlost průtoku vzduchu zařízením s napojeným práškovým inhalátorem přes náustkový adaptér (např. výrobky typu 1023, 1423 nebo 2565, Gast Manufact. Inc., Benton Harbor, MI 49022), nebo ekvivalentní, vývěva je propojena se solenoidovým ventilem krátkou a/nebo širokou (≥10 mm vnitřní průměr) vakuovou hadicí, spoje minimalizující snížení kapacity vývěvy
G	časový spínač	schopný řídit solenoidní ventil v požadovaných časových periodách (např. typ G814, RS Components Int., Corby, NN17 9RS, UK) nebo ekvivalentní
P1	přípoj na tlakoměr	vnitřní průměr 2,2 mm, vnější 3,1 mm, proplachování vnitřního povrchu sběrné trubice, vystředěno, bez hrubých okrajů, 59 mm od ústí
P1 P2, P3	tlakoměry	diferenciální tlak k atmosféře (P1) nebo absolutní tlak (P2 a P3)
H	průtočný kontrolní ventil	nastavitelný regulační ventil s maximálním Cv ≥1 (např. typ 8FV12LNSS, Parker Hannifin plc., Barnstaple, EX31 1NP, UK) nebo ekvivalentní

Obr. 2. Aparatura vhodná ke stanovení stejnoměrnosti podané dávky pro práškové inhalátory
Není-li předepsáno a schváleno jinak, přípravek vyhovuje zkoušce, když nejméně devět z deseti výsledků je v rozmezí 75 % až 125 % průměrné hodnoty a všechny výsledky jsou v rozmezí 65 % až 135 % průměrné hodnoty. Jestliže dva nebo více výsledků je mimo rozmezí 75 % až 125 %, opakuje se zkouška s dalšími dvěma tlakovými nádobami. Nejvýše tři z třiceti výsledků mohou být mimo rozmezí 75 % až 125 % a žádný výsledek není mimo rozmezí 65 % až 135 % průměrné hodnoty.
Dávka jemných částic. Použije se zařízení a postup popsané v článku Přípravky k inhalaci: aerodynamické stanovení jemných částic (2.9.18) a vypočte se dávka jemných částic.
Počet dávkových jednotek v nádobce. Tlaková nádoba s přípravkem (inhalátor) se stisknutím ventilu vyprázdní do odpadu vždy nejméně po 5 s. Celkový počet takto zjištěných dávkových jednotek není menší, než je uvedeno v označení. (Tuto zkoušku lze kombinovat se zkouškou na stejnoměrnost podaných dávek.)
Pulveres ad inhalationem
Prášky k inhalaci
Jsou to přípravky ve formě jednodávkových dělených prášků nebo vícedávkových nedělených prášků. Pro usnadnění použití mohou být léčivé látky kombinovány s vhodným nosičem. Podávají se pomocí inhalátorů pro suché prášky. U předem dávkovaných systémů se inhalátor plní prášky z tobolek nebo z jiné vhodné lékové formy. U zařízení používajících prášek ze zásobníku je dávka odměřena dávkovacím mechanismem v inhalátoru.
Podaná dávka je dávka, která je z inhalátoru podána pacientovi. U některých přípravků je dávka pevně stanovena jako odměřená dávka. Odměřená dávka je určena vložením množství přípravku do zařízení k podání dávky. Odměřenou dávku lze stanovit také přímo.
Zkoušení
Stejnoměrnost podané dávky. Ve všech případech se připraví inhalátor podle předpisu v pokynech pro pacienta. Použije se sběrné zařízení schopné kvantitativně zachytit podanou dávku.
Sběrné zařízení, podobné popsanému ve zkoušce pro tlakové dávkované přípravky pro inhalaci, lze použít za předpokladu, že trubice a filtr vyhovují požadované měřené rychlosti průtoku plynů. Vhodná trubice je uvedena na obrázku 1.
Trubice se spojí s odsávacím systémem podle schématu a popisu uvedených na obrázku 2 a v tabulce 1.
Není-li předepsáno jinak, provede se zkouška při rychlosti průtoku a době za použití trubice pro sběr dávky spojené s odsávacím systémem, vhodným diferenciálním tlakoměrem a vhodným objemovým průtokoměrem kalibrovaným pro odtokové měření v souladu s následujícím postupem.
Inhalátor připravený k použití se připojí k vstupní části zařízení přes náustkový adaptér zajišťující vzduchotěsný spoj. Použije se adaptér, který zajistí, aby čelo náustku sahalo ke vstupní části sběrné trubice. Jeden vstup diferenciálního tlakoměru se připojí k místu P1 na obrázku 1 a další se ponechá otevřený vzhledem k atmosféře. Zapne se vývěva, otevře se dvoucestný ventil a nastaví se kontrolní průtočný ventil tak, aby tlak, zaznamenaný diferenciálním tlakoměrem, po průchodu vzduchu inhalátorem byl 4,0 kPa (40,8 cm H₂O). Inhalátor se sejme z náustkového adaptéru a bez změny polohy průtočného kontrolního ventilu se připojí průtokoměr ke vstupu vzorkovacího zařízení. Je-li rychlost průtoku nad 100 1/min, nastaví se průtočným ventilem na hodnotu (100 ± 5) 1/min. Hodnota se zaznamená a používá se dále jako testovací průtoková rychlost Q, v litrech za minutu. Určí se testovací doba průtoku T v sekundách tak, aby za tuto dobu protekly přes inhalátor 4 litry vzduchu.
Kritický průtok přes průtočný kontrolní ventil se zajistí dále uvedeným způsobem. S připojeným inhalátorem se měří absolutní hodnoty tlaku na obou stranách průtočného ventilu (viz odečítací body tlaku P3 a P3 na obrázku 2), za testovací průtokové rychlosti Q. Poměr P3 : P2 menší než 0,5 nebo rovnající se 0,5 indikuje kritický průtok. Není-li dosaženo kritického průtoku, zvýší se výkon (otáčky) vývěvy a měření se opakuje.
Předdávkované systémy. Inhalátor se připraví dle pokynů pro pacienta a napojí se na sběrné zařízení pomocí dobře těsnicího adaptéru. Přes inhalátor se pustí vzduch podle výše určených podmínek. Celý postup se opakuje, až počet podání odpovídá minimálně doporučené dávce. Kvantitativně se shromáždí obsah léčiva ze zařízení a stanoví se množství účinné látky.
Postup se opakuje s dalšími devíti dávkami.
Zásobníkové systémy. Inhalátor se připraví dle pokynů pro pacienta a napojí se na sběrné zařízení pomocí dobře těsnicího adaptéru. Přes inhalátor se pustí vzduch podle výše určených podmínek. Celý postup se opakuje, až počet podání odpovídá minimálně doporučené dávce. Kvantitativně se shromáždí obsah ze zařízení a stanoví se množství účinné látky.
Postup se opakuje s dalšími dvěma dávkami.
Přípravek se vyprazdňuje do odpadu, až v zásobníku zůstane n/2 + 1 dávka, kde n je počet dávek uvedených v označení na obalu. Je-li třeba, nechá se vybít elektrostatický náboj inhalátoru před dalším použitím. Výše popsaným postupem se nyní stanoví obsahy čtyř dávek.
Přípravek se dále vyprazdňuje do odpadu, až v obalu zůstanou tři dávky. Je-li třeba, nechá se vybít elektrostatický náboj inhalátoru před dalším použitím. Výše popsaným postupem se nyní stanoví obsahy tří dávek.
U přípravků obsahujících více účinných látek se provede zkouška stejnoměrnosti podané dávky pro každou účinnou látku.
Není-li předepsáno a schváleno jinak, přípravek vyhovuje zkoušce, když nejméně devět z deseti výsledků je v rozmezí 75 % až 125 % průměrné hodnoty a všechny výsledky jsou v rozmezí 65 % až 135 % průměrné hodnoty. Jestliže dva nebo více výsledků je mimo rozmezí 75 % až 125 %, opakuje se zkouška s dalšími dvěma inhalátory. Nejvýše tři z třiceti výsledků mohou být mimo rozmezí 75 % až 125 % a žádný výsledek není mimo rozmezí 65 % až 135 % průměrné hodnoty.
V předepsaných a schválených případech může být rozsah hodnot větší, ale žádný naměřený výsledek není vyšší než 150 % a není nižší než 50 % průměrné hodnoty.
Dávka jemných částic. Použije se zařízení a postup popsané v článku Přípravky k inhalaci: aerodynamické stanovení jemných částic (2.9.18) a vypočte se dávka jemných částic.
Počet dávkových jednotek v nádobce vícedávkového inhalátoru. Dávky se vyprazdňují ze zařízení vhodnou tokovou rychlostí. Zaznamená se počet podání. Celkový počet dávkových jednotek není menší, než je uvedeno v označení na obalu. (Tuto zkoušku lze kombinovat se zkouškou na stejnoměrnost podaných dávek.)
Insertum intraruminale
Intraruminální inzert
Požadavky tohoto článku se nevztahují na přípravky (označené někdy jako boly), jakými jsou obvykle velké tablety, tobolky nebo tvarované lékové formy, ze kterých se účinná látka (účinné látky) uvolňuje ihned nebo s prodlouženým účinkem. Na tyto přípravky se vztahují příslušné oddíly článků Tabulettae nebo Capsulae.
Intraruminální inzerty jsou pevné přípravky obsahující jednu nebo více účinných látek. Jsou určeny k perorálnímu podání přežvýkavcům a uzpůsobeny tak, aby se zadržely v bachoru ke kontinuálnímu nebo pulznímu uvolňování účinné látky (účinných látek). Doba uvolňování může být různá, od několika dnů po několik týdnů, podle povahy receptury a/nebo inzertu.
Intraruminální inzerty se podávají podavačem pilulek. Některé jsou určeny k tomu, aby se vznášely na hladině bachorové tekutiny, zatímco jiné jsou určeny k setrvání na bázi bachoru nebo čepce. Každý inzert má hustotu přiměřenou předpokládanému použití.
Výroba
Pro kontinuální uvolňování je intraruminální inzert konstruován tak, aby účinná látka (účinné látky) byla uvolňována ve stanovené míře po stanovenou dobu. Toho je dosahováno erozí, korozí, difúzí, osmotickým tlakem nebo jiným vhodným chemickým, fyzikálním nebo fyzikálně-chemickým pochodem.
Pro pulzní uvolňování je intraruminální inzert uzpůsoben k uvolňování určitého množství účinné látky (účinných látek) v jednom nebo v několika vymezených časových intervalech. Toho je dosahováno korozí kovových složek inzertu působením bachorové tekutiny vedoucí k následnému uvolňování jednotek, které jsou obvykle ve formě tablet.
Při výrobě intraruminálních inzertů jsou uplatňovány postupy, kterými je zajišťováno přiměřené uvolňování účinné látky (účinných látek).
Při výrobě, balení, uchovávání a distribuci intraruminálních inzertů jsou přijímána vhodná opatření k zabezpečení jejich mikrobiologické jakosti; při tom se postupuje podle požadavků uvedených v článku Mikrobiologická jakost léčivých přípravků (5.1.4).
Zkoušky
Obsahová stejnoměrnost (2.9.6). Pokud není předepsáno a schváleno jinak, základní tabletové jednotky intraruminálních inzertů, obsahující účinné látky v množství menším než 2 mg nebo méně než 2 % celkové hmotnosti, vyhovují požadavkům zkoušky A na obsahovou stejnoměrnost jednodávkových lékových forem. Jestliže přípravek obsahuje více než jednu účinnou látku, vztahují se požadavky jen na účinné látky odpovídající výše uvedeným podmínkám.
Hmotnostní stejnoměrnost (2.9.5). Pokud není předepsáno a schváleno jinak, základní tabletové jednotky intraruminálních inzertů vyhovují požadavkům zkoušky na hmotnostní stejnoměrnost.
Pokud je zkouška na obsahovou stejnoměrnost předepsána pro všechny účinné látky, zkouška na hmotnostní stejnoměrnost není vyžadována.
Uchovávání
V dobře uzavřených obalech.
Označování
V označení na obalu se uvede:
- u kontinuálně uvolňujících inzertů dávka uvolňovaná za jednotku času
- u pulzně uvolňujících inzertů dávka uvolňovaná v předepsaných časových intervalech.
Praeparata homeopathica
Homeopatické přípravky
Připravují se z látek, produktů nebo přípravků nazývaných Výchozí suroviny pro výrobu za použití homeopatických postupů. Označují se obvykle latinským názvem výchozí suroviny a stupněm zředění.
Suroviny
Suroviny pro výrobu homeopatických přípravků jsou rostlinného, chemického, minerálního nebo živočišného původu.
U surovin živočišného původu musí být prokázáno, že neobsahují patogenní agens. Suroviny rostlinného a živočišného původu mohou být použity v čerstvém nebo sušeném stavu. Kde je to vhodné, může být čerstvý materiál uchováván hluboce zmrazený.
V oprávněných a schválených případech může být k přepravním a skladovacím účelům čerstvý materiál uchováván v lihu 96% za podmínky, že celý materiál, včetně lihu 96%, se použije pro výrobu.
Suroviny vyhovují požadavkům lékopisných článků.
Vehikula
Jsou to pomocné látky použité k přípravě konkrétních výchozích surovin pro výrobu nebo k potenciaci, např. čištěná voda, líh o vhodné koncentraci, glycerol a laktosa.
Vehikula vyhovují požadavkům lékopisných článků.
Výchozí suroviny pro výrobu
Jsou to látky, produkty nebo přípravky použité jako výchozí materiály pro výrobu homeopatických přípravků. Výchozími surovinami pro výrobu jsou obvykle látky rostlinného nebo živočišného původu, matečné tinktury, glycerolové výluhy; jako suroviny chemického nebo minerálního původu slouží jednotlivé látky.
Matečné tinktury
Jsou to tekuté přípravky získávané působením vhodného vehikula na suroviny rostlinného nebo živočišného původu. Mohou se připravit také z rostlinných šťáv s přidáním nebo bez přidání vehikula. Matečná tinktura se označuje symboly „MT“ nebo „0“.
Glycerolové výluhy
Jsou to tekuté přípravky získávané ze surovin rostlinného nebo živočišného původu za použití glycerolu, směsi glycerolu a lihu vhodné koncentrace nebo směsi glycerolu a roztoku chloridu sodného vhodné koncentrace.
Potenciace
Zředění a triturace se získávají z výchozích surovin pro výrobu potenciaci podle výrobních homeopatických postupů; pro tekuté přípravky to jsou postupná ředění a třepání, pro pevné přípravky to jsou postupné vhodné triturace.
Potenciační kroky jsou obvykle:
- 1 díl výchozí suroviny pro výrobu a 9 dílů vehikula; lze je označit jako „D“ nebo „DH“ nebo „X“ (desetinásobné, decimální),
- 1 díl výchozí suroviny pro výrobu a 99 dílů vehikula; lze je označit jako „C“ nebo „CH“ (stonásobné, centezimální).
Počet potenciačních kroků určuje stupeň ředění. Např. symboly „D3“ nebo „3 DH“ nebo „3X“ znamenají tři decimální potenciační kroky a symboly „C3“ nebo „3 CH“ nebo „C3“ znamenají tři centezimální potenciační kroky.
Lékové formy
Léková forma homeopatického přípravku vyhovuje příslušnému článku lékové formy a následujícím požadavkům:
- u lékových forem pro homeopatické účely jsou za „účinné látky" považována „zředění nebo triturace homeopatických výchozích surovin“,
- tyto lékové formy jsou připraveny za použití vhodných pomocných látek,
- zkouška Obsahová stejnoměrnost se běžně neprovádí, avšak za určitých okolností je předepsána.
Definice homeopatické lékové formy „Pilulae – Pilulky“
Pilulky pro homeopatické účely jsou tuhé přípravky připravené ze sacharosy, laktosy nebo jiných vhodných pomocných látek postupně přidávaných ke zředění nebo zředěním homeopatických výchozích surovin. Jsou určeny k perorálnímu nebo sublinguálnímu podání.
Praeparata insulini iniectabilia
Injekční insulinové přípravky
Injekční insulinové přípravky vyhovují požadavkům pro injekce, které jsou uvedeny v článku Parenteralia.
Jsou to sterilní přípravky obsahující lidský insulin, viz článek Insulinum humanum, nebo hovězí nebo prasečí insulin, viz článek Insulinum, pokud není uvedeno jinak. Obsahují 90,0 % až 110,0 % deklarovaného množství insulinu. Jsou vyráběny ve formě roztoků nebo suspenzí nebo směsi roztoků a suspenzí.
Výroba
Způsoby výroby injekčních insulinových přípravků jsou zvoleny tak, aby tyto přípravky splňovaly požadavky na počáteční dávkování a trvání terapeutického účinku.
Následující postupy se provedou ve vhodném pořadí v závislosti na způsobu přípravy:
- přidání vhodných protimikrobních látek,
- přidání vhodné izotonizační přísady nebo přísad,
- přidání vhodné látky nebo látek k upravení pH na předepsanou hodnotu,
- stanovení síly (koncentrace) složky nebo složek obsahujících insulin s její následnou úpravou, kde je to třeba, aby konečný přípravek obsahoval předepsaný počet mezinárodních jednotek insulinu v mililitru,
- sterilizace filtrací složky nebo složek obsahujících insulin; pokud tento postup byl proveden, všechny ostatní postupy je třeba provádět asepticky za použití materiálů, které byly sterilizovány vhodnou metodou.
V případě potřeby se přidávají vhodná aditiva a použijí se vhodné postupy k zajištění příslušné fyzikální formy složky nebo složek obsahujících insulin. Konečný přípravek je asepticky plněn do sterilních obalů, které jsou uzavřené tak, aby nedošlo k mikrobiálnímu znečištění.
Zkoušky na čistotu
Hodnota pH (2.2.3). 6,9 až 7,8; měří se roztok nebo suspenze, pokud není v článku uvedeno jinak.
Insulin v supernatantu. Nejvýše 2,5 % celkového obsahu insulinu v přípravcích tvořených suspenzí, není-li uvedeno jinak. Odstřeďuje se 10 min 10 ml suspenze při 1500 g a opatrně se oddělí supernatantní tekutina od zbytku. Obsah insulinu v supernatantní tekutině (S) se stanoví vhodnou metodou, např. užitím chromatografických podmínek popsaných ve zkoušce Stanovení obsahu. Obsah insulinu v procentech se vypočítá podle vztahu:

\frac{100 \cdot S}{T},

v němž značí:
T - celkový obsah insulinu zjištěný ve zkoušce Stanovení obsahu.
Nečistoty s molekulovou hmotností větší než insulin. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).
Zkoušený roztok. 4 μl kyseliny chlorovodíkové 6 mol/l RS se přidají k 1 ml zkoušeného přípravku, suspenze nebo roztoku k získání čirého okyseleného roztoku insulinu. Při vzorkování suspenze se směs předem protřepává, aby byl vzorek homogenní. Pokud suspenze není čirá do 5 min od počátečního přídavku kyseliny chlorovodíkové, přidá se malý podíl kyseliny chlorovodíkové (méně než 4 μl/ml), až je získán roztok. Přípravky s koncentrací vyšší než 100 m.j./ml by se měly zředit kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS, aby se předešlo přesycení kolony monomerem insulinu. Rozlišovací roztok. Použije se roztok insulinu (asi 4 mg/ml), který obsahuje více než 0,4 % vysokomolekulárních bílkovin. Mohou být použity injekční přípravky insulinu, roztok nebo suspenze, která se vyčeří dostatečným množstvím kyseliny chlorovodíkové 6 mol/l RS, obsahující určité procento vysokomolekulárních bílkovin, nebo roztok připravený z insulinu rozpuštěním v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS. Insulin obsahující určité procento vysokomolekulárních bílkovin může být připraven tak, že se prášek insulinu asi 10 dní nechá stát při pokojové teplotě. Roztoky se udržují při teplotě 2 °C až 10 °C a použijí se do 30 h (injekce s rozpustným insulinem) nebo do 7 dnů (jiné insulinové přípravky). Při použití automatického dávkovače se jeho teplota nastaví na 2 °C až 10 °C.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- kolony délky 0,3 m a vnitřního průměru nejméně 7,5 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografii R (5 μm až 10 μm), vhodného stupně pro separaci monomerního insulinu z dimeru a polymerů,
- mobilní fáze, kterou je zfiltrovaná a odplyněná směs objemových dílů kyseliny octové ledové R, acetonitrilu R a roztoku argininu R (1,0 g/l) (15 + 20 + 65), s průtokovou rychlostí 0,5 ml/min,
- spektrofotometrického detektoru, 276 nm.
Rovnováha kolony. Před použitím nové kolony pro chromatografickou analýzu se ustaluje rovnováha opakovaným nástřikem roztoku insulinu obsahujícího vysokomolekulární bílkoviny. Nejméně třikrát se nastříkne rozlišovací roztok. Kolona je ustálena, když výsledky dvou po sobě následujících nástřiků jsou opakovatelné. Jestliže jsou analyzovány vzorky obsahující protamin, rovnováha kolony se ustaluje za použití roztoku obsahujícího protamin.
Nastříkne se 100 μl rozlišovacího roztoku. Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek retenční časy jsou: polymerní komplexy insulinu nebo kovalentní insulin-protaminové komplexy 13 min až 17 min, kovalentní dimer insulinu asi 17,5 min, monomemí insulin asi 20 min, soli asi 22 min. Jestliže roztok vzorku obsahuje konzervační látky, např. methylparaben, m-kresol nebo fenol, tyto látky eluují později. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení, definované poměrem výšky píku dimeru k výšce minima mezi píky monomeru a dimeru, je nejméně 2,0.
Nastříkne se 100 μl zkoušeného roztoku. Chromatogram se zaznamenává asi 35 min. Na získaném chromatogramu součet ploch píků s retenčním časem menším než retenční čas píku insulinu není větší než 3,0 % (přípravky obsahující protamin) nebo 2,0 % (přípravky neobsahující protamin) celkové plochy píků. Nepřihlíží se k žádnému píku s retenčním časem větším než retenční čas píku insulinu.
Příbuzné bílkoviny. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) způsobem popsaným ve zkoušce Stanovení obsahu, s elučními podmínkami popsanými v následující tabulce:

Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámka
0 - 30	42	58	izokraticky
30 - 44	42 → 11	58 → 89	lineární gradient
44 - 50	11	89	izokraticky

Roztoky se udržují při 2 °C až 10 °C a použijí se do 24 h. Zkontroluje se vhodnost systému (rozlišení, linearita) způsobem popsaným ve zkoušce Stanovení obsahu. Pokud je třeba, upraví se relativní vlastnosti mobilní fáze tak, aby se zajistila úplná eluce prasečího A21 deamidoinsulinu před začátkem gradientu. Profil gradientu může být upraven tak, aby se zajistila úplná eluce všech příbuzných nečistot insulinu.
Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku a buď 20 μl porovnávacího roztoku (a), pro insulinové přípravky obsahující 100 m.j./ml, nebo 20 μl porovnávacího roztoku (b), pro insulinové přípravky obsahující 40 m.j./ml. Je-li třeba, upraví se nastřikovaný objem na objem mezi 10 μl a 20 μl v souladu s výsledky získanými pro zkoušku linearity popsanou ve Stanovení obsahu. Chromatogramy se zaznamenávají asi 50 min. Je-li třeba, provedou se další úpravy mobilní fáze, aby se zajistilo, že konzervační látky přítomné ve zkoušeném roztoku budou odděleny z insulinu a vyloučí se v krátkém retenčním čase. Malé snížení koncentrace acetonitrilu prodlouží retenční časy píků insulinu relativně více než retenční časy konzervačních látek. Na chromatogramu porovnávacího roztoku (a), nebo porovnávacího roztoku (b), co je vhodné, se A21 deamidoinsulin objeví jako malý pík za hlavním píkem s relativním retenčním časem asi 1,3 vzhledem k hlavnímu píku insulinu. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha píku A21 deamidoinsulinu není větší než 5,0 % z celkové plochy píků; součet ploch všech píků, kromě píku insulinu a píku A21 deamidoinsulinu, není větší než 6,0% z celkové plochy píků. Nepřihlíží se k pikům konzervačních látek a protaminu (píky eluující dříve).
Celkový zinek. Nejvýše množství uvedené v jednotlivých článcích; stanoví se atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).
Použije se následující postup, pokud není v jednotlivých článcích uvedeno jinak.
Zkoušený roztok. Objem zkoušeného přípravku obsahující 200 m.j. insulinu se opatrně protřepáním zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 25,0 ml. Je-li třeba, zředí se kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na koncentraci např. 0,4 μg Zn/ml až 1,6 μg Zn/ml. Porovnávací roztoky. Použijí se čerstvě připravené roztoky obsahující 0,40 μg Zn/ml, 0,80 μg Zn/ml, 1,00 μg Zn/ml, 1,20 μg Zn/ml, 1,60 μg Zn/ml připravené ředěním základního roztoku zinku (5 mg Zn/ml) kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS.
Měří se absorbance při 213,9 nm za použití zinkové lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene vzduch-acetylen vhodného složení (např. 11 l vzduchu/min a 2 1 acetylenu/min).
Zinek v roztoku. Kde lze, nejvýše množství uvedené v jednotlivých článcích. Stanoví se atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).
Zkoušený roztok. 1 ml čiré supernatantní tekutiny získané odstřeďováním zkoušeného přípravku se zředí vodou R na 25,0 ml. Je-li třeba, zředí se na vhodnou koncentraci, např. 0,4 μg Zn/ml až 1,6 μg Zn/ml, vodou R.
Porovnávací roztoky. Použijí se čerstvě připravené roztoky obsahující 0,40 μg Zn/ml, 0,80 μg Zn/ml, 1,00 μg Zn/ml, 1,20 μg Zn/ml, 1,60 μg Zn/ml připravené ředěním základního roztoku zinku (5 mg Zn/ml) kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS.
Měří se absorbance při 213,9 nm za použití zinkové lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene vzduch-acetylen vhodného složení (např. 11 1 vzduchu/min a 2 1 acetylenu/min).
Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 80 m.j. endotoxinu na 100 m.j. insulinu.
Stanovení obsahu
Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
Zkoušený roztok. 4 μl kyseliny chlorovodíkové 6 mol/l RS se přidají k 1 ml zkoušeného přípravku, roztoku nebo suspenze, aby byl získán čirý roztok. Při použití suspenze se směs protřepává před odměřením vzorku, aby byl vzorek homogenní. Pokud suspenze není čirá do 5 min od počátečního přídavku kyseliny chlorovodíkové, přidá se malý podíl kyseliny (méně než 4 μl/ml), až je získán roztok. Přípravky s koncentrací vyšší než 100 m.j./ml by se měly navíc zředit kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS, aby se předešlo přesycení kolony.
Porovnávací roztok (a). Pro přípravek obsahující jeden druh insulinu se rozpustí obsah lahvičky lidského insulinu CRL nebo prasečího insulinu CRL nebo definované množství hovězího insulinu CRL v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí tak, aby výsledná koncentrace byla 4,0 mg/ml. Pro přípravek obsahující hovězí insulin a prasečí insulin se smíchá 1,0 ml roztoku obsahujícího 4,0 mg/ml hovězího insulinu CRL v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a 1,0 ml roztoku obsahujícího 4,0 mg/ml prasečího insulinu CRL v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS. Porovnávací roztok (a) se použije pro stanovení obsahu insulinu v přípravcích obsahujících 100 m.j./ml.
Porovnávací roztok (b). 4,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 10,0 ml. Porovnávací roztok (b) se použije pro stanovení obsahu insulinu v přípravcích obsahujících 40 m.j./ml.
Porovnávací roztok (c). Obsah lahvičky lidského insulinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS tak, aby získaná koncentrace byla 4,0 mg/ml.
Porovnávací roztok (d). Obsah lahvičky prasečího insulinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS tak, aby získaná koncentrace byla 4,0 mg/ml.
Porovnávací roztok (e). 1,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 10,0 ml.
Porovnávací roztok (f). 1,0 ml porovnávacího roztoku (b) se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 10,0 ml.
Rozlišovací roztok. Smíchá se 1,0 ml porovnávacího roztoku (c) a 1,0 ml porovnávacího roztoku (d).
Roztoky se udržují při teplotě 2 °C až 10 °C a použijí se do 48 h. Při použití automatického dávkovače se jeho teplota nastaví na 2 °C až 10 °C.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- ocelové nerezové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
- mobilní fáze, kterou jsou následující roztoky připravené a udržované při teplotě nejméně 20 °C, průtoková rychlost je 1 ml/min:
- mobilní fáze A - 28,4 g síranu sodného bezvodého R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000 ml, přidá se 2,7 ml kyseliny fosforečné R, a je-li třeba, upraví se pH na hodnotu 2,3 ethanolaminem R, zfiltruje se a roztok se odplyní,
- mobilní fáze B - smíchá se 550 ml mobilní fáze A se 450 ml acetonitrilu R, roztok se zahřeje na teplotu nejméně 20 °C, aby se předešlo srážení (smíchání mobilní fáze s acetonitrilem je endotermická reakce), zfiltruje se a roztok se odplyní,
- spektrofotometrického detektoru, 214 nm.
Teplota kolony se udržuje na 40 °C.
Zaznamenají se chromatogramy mobilní fáze obsahující směs objemových dílů mobilní fáze A a mobilní fáze B (42 + 58). V případě potřeby se upraví složení mobilní fáze.
Nastříkne se 20 μl rozlišovacího roztoku a 20 μl porovnávacího roztoku (d). Zaznamenává se chromatogram rozlišovacího roztoku, až pík odpovídající hlavnímu píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (d) je zřetelně viditelný. Na chromatogramu rozlišovacího roztoku se určí totožnost píků prasečího insulinu a lidského insulinu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky odpovídajícími lidskému insulinu a prasečímu insulinu je nejméně 1,2. Je-li třeba, upraví se koncentrace acetonitrilu v mobilní fázi tak, aby bylo toto rozlišení dosaženo.
Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku a po 20 μl porovnávacího roztoku (a) a (e) pro insulinové přípravky obsahující 100m.j./ml nebo po 20 μl porovnávacího roztoku (b) a(f) pro insulinové přípravky obsahující 40 m.j./ml. Je-li třeba, provedou se další úpravy mobilní fáze, aby se zajistilo, že konzervační látky přítomné ve zkoušeném roztoku budou odděleny od insulinu a vyloučí se v kratších retenčních časech. Malé snížení koncentrace acetonitrilu prodlouží retenční časy píků insulinu relativně více než retenční časy konzervačních látek. Je-li třeba, provede se promytí kolony před nástřikem dalšího roztoku směsí stejných objemových dílů acetonitrilu R a vody R dostatečnou dobu, aby se zajistila eluce všech interferujících látek. Zkoušku lze hodnotit, jestliže plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) nebo (b) je (10 ± 0,5)násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (e) nebo (f). Pokud je tato zkouška neúspěšná, upraví se nastřikovaný objem na 10 μl až 20 μl, aby byl lineární rozsah detektoru.
Vypočítá se obsah insulinu a A21 deamidoinsulinu z plochy píku hovězího, prasečího nebo lidského insulinu a plochy píku A21 deamidoinsulinu z deklarovaného obsahu insulinu a A21 deamidoinsulinu v hovězím insulinu CRL, prasečím insulinu CRL nebo lidském insulinu CRL, jak je vhodné. U přípravků obsahujících hovězí insulin a prasečí insulin se použije součet ploch píků odpovídajících hovězímu insulinu a prasečímu insulinu a píků odpovídajících derivátům A21 deamidoinsulinu.
100 m.j. odpovídá 3,47 mg lidského insulinu, 3,45 mg prasečího insulinu a 3,42 mg hovězího insulinu.
Uchovávání
Pokud není předepsáno jinak, uchovávají se ve vzduchotěsných sterilních zabezpečených obalech, chráněny před světlem, při teplotě 2 °C až 8 °C. Insulinové přípravky nesmí zmrznout.
Označování
V označení na obalu se uvede:
- účinnost v m.j. na mililitr,
- obsah insulinu v miligramech na mililitr, u přípravků obsahujících hovězí insulin a prasečí insulin se uvede jejich součet,
- kde je to vhodné, že byla výchozí látka vyrobena enzymatickou přeměnou prasečího insu-linu,
- kde je to vhodné, že byla výchozí látka vyrobena rDNK technologií,
- v případě potřeby původ zvířete,
- že přípravek se musí chránit před mrazem,
- v případě potřeby, že se přípravek před podáním musí protřepat.
Producta fermentationis¹)
Produkty fermentace
Článek se vztahuje na nepřímé genové produkty získané fermentací. Netýká se:
- lékopisných článků na vakcíny pro humánní a veterinární použití,
- přípravků odvozených z kontinuálních buněčných linií humánního nebo zvířecího původu,
- přímých genových produktů získaných transkripcí a translací z nukleové kyseliny na bílkovinu, ať jsou či nejsou vystaveny posttranslační modifikaci,
- produktů získaných polosynteticky a produktů fermentace a produktů získaných biokatalytickou transformací,
- úplných živných koncentrátů nebo surových fermentačních produktů.
Ustanovení tohoto článku se použijí pro jednotlivé lékopisné články na přípravky získané přímo fermentací, jak je definována dále. Tyto požadavky se nezbytně nevztahují na produkty fermentace, které nejsou předmětem těchto článků. Nicméně oprávněná autorita se může k tomuto účelu na tyto požadavky odvolávat.
Pro účely tohoto článku se jako produkty fermentace chápou léčivé a pomocné látky vyráběné kontrolovanou fermentací jako nepřímé genové produkty. Jsou to primární nebo sekundární genové metabolity mikroorganismů, jako jsou bakterie, kvasinky, houby a mikroskopické řasy, ať jsou či nejsou modifikovány tradičními postupy nebo technologií rekombinace DNK (r-DNK). Tyto metabolity zahrnují vitamíny, aminokyseliny, antibiotika, alkaloidy a polysacharidy.
Mohou se získávat bud’ jednorázovou, nebo kontinuální fermentací, po níž následují postupy, jako jsou extrakce, koncentrace, čištění a izolace.
Výroba
Výroba je založena na postupu, který byl validován a ukázala se jeho vhodnost. Rozsah validace závisí na kritické povaze případného postupného kroku.
Charakteristika produkčních mikroorganismů
Historie kmene použitého k výrobě je dokumentována. Mikroorganismy jsou přiměřeně charakterizovány. Charakteristika může obsahovat stanovení fenotypu mikroorganismu, makroskopické i mikroskopické metody a biochemické zkoušky, a je-li to vhodné, stanovení genotypu mikroorganismu a molekulárně genetické zkoušky.
Postupy používající systém jednotné inokulace
Banka základních buněk je homogenní suspenze nebo lyofilizát původních buněk rozplněných do jednotlivých obalů pro uchovávání. Prokáže se životaschopnost a produktivita buněk ve vybraných podmínkách uchovávání a jejich vhodnost pro zahájení uspokojivého výrobního procesu po uchovávání.
Pomnožení banky základních buněk se provede systémem jednotné inokulace, který používá banku pracovních buněk.
Banka pracovních buněk je homogenní suspenze nebo lyofilizát buněčného materiálu pocházejícího z banky základních buněk. Je ve stejných objemech rozplněna do jednotlivých obalů pro uchovávání (např. v tekutém dusíku).
Výroba se může provádět buď jednorázovou, nebo kontinuální kultivací a může se ukončit za definovaných podmínek.
Všechny nádoby buněčné banky se uchovávají ve stejných podmínkách. Vyjmou-li se jednotlivé ampule, lahvičky nebo kapiláry s kulturou během uchovávání z buněčné banky, již se do ní nevrátí.
Postupy užívající fázový růst v buněčných kulturách
K přípravě inokula ve vhodném médiu se použijí obsahy obalů banky pracovních buněk po resuspendování, je-li třeba. Ve vhodné růstové fázi se kultury použijí k zahájení fermentačního procesu po prekultivaci v prefermentoru, je-li třeba. Podmínky používané pro každý výrobní stupeň se definují a v každém výrobním cyklu se splní.
Kontrola změn
Dojde-li k takové změně výrobního postupu, která způsobí významnou změnu v profilu nečistot výrobku, validují se znovu kritické kroky spojené s touto změnou v profilu nečistot.
Provedla-li se významná změna v mikroorganismech použitých při výrobě, která způsobí významnou změnu v profilu nečistot výrobku, validují se znovu všechny kritické kroky výrobního postupu spojené s touto změnou, zvláště průběh čištění a izolace.
Revalidace též prokazuje, že nové nečistoty přítomné ve výrobku jako výsledek této změny se přiměřeně kontrolují při zkušebním postupu. Je-li to nutné, zavedou se dodatečné nebo náhradní zkoušky spolu s vhodnými limity. Způsobí-li změna ve výrobě nebo v mikroorganismech vzestup hladiny nečistoty, jež je trvale přítomna, určí se přijatelnost takového vzestupu.
Při přemístění banky základních buněk se znovu validují kritické kroky výrobního procesu v rozsahu nezbytném k průkazu, že nedošlo k nepříznivým změnám v kvalitě a bezpečnosti výrobku. Je-li do postupu zaveden modifikovaný nebo nový mikroorganismus, věnuje se zvláštní pozornost možným změnám v profilu nečistot přípravku.
Suroviny
Suroviny použité k fermentaci a/nebo v následujících výrobních postupech jsou ve vhodné kvalitě pro zamýšlené použití. Suroviny se zkouší, aby se zajistilo, že vyhovují předepsaným požadavkům.
Hladiny biologické zátěže v živných půdách nebo v přívodu vzduchu pro zavzdušnění se sníží na přiměřeně nízkou úroveň, aby se zajistilo, že případná mikrobiologická kontaminace nebude mít nepříznivý účinek na jakost, čistotu a bezpečnost výrobku. Přidávání složek, jako jsou živiny, prekurzory a substráty, se děje v průběhu fermentace asepticky.
Mezioperační kontroly
Mezioperační kontroly se provádějí k zajištění trvale stejných podmínek při fermentaci a při následných výrobních postupech a k zajištění jakosti izolovaného produktu. Zvláštní pozornost se věnuje zabezpečení, že při prováděných kontrolách bude zjištěna mikrobiologická kontaminace, která by nepříznivě ovlivnila jakost, čistotu a bezpečnost výrobku.
Výrobní podmínky se mohou monitorovat odpovídajícími postupy vhodnými pro řízení a kontrolu:
- teploty,
- hodnoty pH,
- stupně zavzdušnění,
- stupně protřepávání,
- tlaku
a sledování koncentrace požadovaného produktu.
Následující výrobní postupy
Na konci fermentace se produkční mikroorganismus inaktivuje nebo odstraní. Další postupy jsou určeny ke snížení obsahu reziduí pocházejících z kultivační živné půdy na přijatelnou úroveň a k zajištění toho, aby se požadovaný produkt získával ve stále stejné jakosti.
Použité purifikační postupy (např. čištění aktivním uhlím, ultrafiltrace, extrakce rozpouštědly) prokazatelně snižují nebo odstraňují:
- rezidua z produkčního mikroorganismu, kultivační živné půdy, substrátů a prekurzorů,
- nežádoucí produkty transformace substrátů a prekurzorů.
Je-li třeba, provedou se vhodné zkoušky bud’ při mezioperačních kontrolách, nebo na izolovaném produktu fermentace.
Zkoušky totožnosti a na čistotu a stanovení obsahu
Požadavky, kterým produkt po dobu platnosti vyhovuje, jsou uvedeny stejně jako specifické zkušební metody v jednotlivých lékopisných článcích.
Uchovávání
Viz jednotlivé lékopisné články.
Označování
Viz jednotlivé lékopisné články.
Rectalia
Rektální přípravky
Jsou to přípravky určené k rektální aplikaci s místním nebo systémovým účinkem nebo podávané k diagnostickým účelům.
Obaly pro rektální přípravky, kde je to vhodné, vyhovují požadavkům statí Materiály používané na výrobu obalů (3.1 a příslušné části) a Obaly (3.2 a příslušné části).
Rozlišuje se několik druhů rektálních přípravků:
- čípky,
- rektální tobolky,
- rektální roztoky a suspenze,
- prášky a tablety pro rektální roztoky a suspenze,
- polotuhé rektální přípravky,
- rektální pěny,
- rektální tampony.
Výroba
Při vývoji rektálního přípravku obsahujícího protimikrobní přísadu má být prokázána účinnost této přísady podle požadavků oprávněné autority. Vhodná metoda zkoušení spolu s kritérii pro posouzení konzervačních vlastností v daném složení přípravku je popsána ve stati Účinnost protimikrobních konzervačních látek (5.1.3).
Při výrobě, balení, uchovávání a distribuci rektálních přípravků je vhodnými způsoby zajištěna jejich mikrobiální čistota; odpovídající doporučení jsou ve stati Mikrobiologická jakost léčivých přípravků (5.1.4).
Při výrobě polotuhých a tekutých rektálních přípravků obsahujících dispergované částice se používají měření k zajištění vhodné a kontrolované velikosti částic pro určené použití.
Zkoušení
Obsahová stejnoměrnost (2.9.6). Není-li předepsáno a schváleno jinak, pevné nebo tuhé jednodávkové lékové formy s obsahem léčivé látky menším než 2 mg nebo méně než 2 % celkové hmotnosti, vyhovují zkoušce A (tablety) nebo zkoušce B (čípky, rektální tobolky) na obsahovou stejnoměrnost jednodávkových přípravků. Obsahuje-li přípravek více léčivých látek, požadavek zkoušky se vztahuje jen na ty látky, které odpovídají uvedeným podmínkám.
Hmotnostní stejnoměrnost (2.9.5). Pevné nebo tuhé jednodávkové lékové formy vyhovují zkoušce na hmotnostní stejnoměrnost. Je-li zkouška na obsahovou stejnoměrnost předepsána pro všechny přítomné léčivé látky, zkouška na hmotnostní stejnoměrnost se neprovádí.
Disoluce. Použije se vhodná zkouška k prokázání příslušného uvolňování léčivé látky (látek) zpěvných a tuhých jednodávkových lékových forem, např. zkouška disoluce čípků a měkkých tobolek (2.9.3). Provádí-li se zkouška disoluce, neprovádí se zkouška rozpadavosti.
Označování
V označení na obalu se uvedou názvy všech protimikrobních přísad.
Suppositoria
Čípky
Jsou to tuhé jednodávkové přípravky. Tvarem, velikostí a konzistencí jsou vhodné pro podání do konečníku.
Čípky obsahují jednu nebo více léčivých látek dispergovaných nebo rozpuštěných v jednoduchém nebo ve složeném čípkovém základu, který je rozpustný nebo dispergovatelný ve vodě nebo taje při teplotě těla. Je-li to potřebné, mohou být přidány pomocné látky, jako jsou rozpouštědla, látky sadsorpčními vlastnostmi, povrchově aktivní látky, kluzné látky, protimikrobní přísady abarviva schválená oprávněnou autoritou.
Výroba
Čípky jsou připravovány lisováním nebo litím. Je-li třeba, léčivé látky jsou rozdrobněny a přesáty vhodným sítem. Jsou-li připravovány litím, hmota s léčivými látkami (čípkovina) je zahřátím roztavena a lita do vhodných forem. Následným ochlazením čípky ztuhnou. Pro tento způsob přípravy jsou vhodné různé pomocné látky, jako např. tuhý tuk, makrogoly, kakaový olej a různé gelotvorné směsi tvořené např. želatinou, vodou a glycerolem.
Použije se vhodná zkouška k ověření příslušného uvolňování účinné látky (látek) z přípravku s řízeným uvolňováním nebo s prodlouženým místním účinkem.
Zkoušení
Zkouška rozpadavosti. Pokud se nejedná o přípravky s řízeným uvolňováním nebo prodlouženým místním účinkem, vyhovují zkoušce rozpadavosti rektálních a vaginálních přípravků (2.9.2). Čípky s mastným základem se kontrolují po 30 min a čípky se základem rozpustným ve vodě se kontrolují po 60 min, není-li předepsáno a schváleno jinak.
Uchovávání
V dobře uzavřených obalech.
Capsulae rectales
Rektální tobolky
Synonymum. Rektální kapsle
Jsou to tuhé jednodávkové přípravky obecně podobné měkkým tobolkám popsaným v článku Capsulae, od nichž se liší možností použití lubrifikačního potahu. Jsou protáhlého tvaru, hladké a mají jednotný vnější vzhled.
Výroba
Použije se vhodná zkouška k ověření příslušného uvolňování účinné látky (látek) z přípravku s řízeným uvolňováním nebo prodlouženým místním účinkem.
Zkoušení
Zkouška rozpadavosti. Pokud se nejedná o přípravky s řízeným uvolňováním nebo prodlouženým místním účinkem, vyhovují zkoušce rozpadavosti rektálních a vaginálních přípravků (2.9.2). Rektální tobolky se hodnotí po 30 min, není-li předepsáno a schváleno jinak.
Solutiones et suspensiones rectales
Rektální roztoky a suspenze
Synonymum. Klyzmata
Jsou to tekuté přípravky určené k rektálnímu podání s celkovým nebo místním účinkem nebo k diagnostickým účelům.
Jsou to jednodávkové přípravky obsahující jednu nebo více léčivých látek rozpuštěných nebo dispergovaných ve vodě, vglycerolu, vmakrogolech nebo v jiných vhodných rozpouštědlech. Suspenze mohou obsahovat sediment, který se snadno roztřepe; takto vzniklá suspenze je natolik stabilní, aby bylo umožněno podání správné dávky.
Rektální roztoky a suspenze mohou obsahovat pomocné látky, např. k úpravě viskozity přípravku, úpravě a stabilizaci pH, ke zvýšení rozpustnosti léčivé látky (látek) nebo ke stabilizaci přípravku. Tyto pomocné látky nemají nepříznivě ovlivňovat léčebný účinek nebo v použitých koncentracích být příčinou přílišné místní dráždivosti.
Rektální roztoky a suspenze jsou dodávány v obalech o obsahu 2,5 ml až 2000 ml. Obal je upraven k podání přípravku do konečníku neboje přiložen vhodný aplikátor.
Zkoušení
Obsahová stejnoměrnost (2.9.6). Není-li předepsáno a schváleno jinak, rektální suspenze vyhovují následující zkoušce. Každý obal se vyprázdní co nejvíce a stanoví se jednotlivé obsahy. Vyhovují zkoušce B.
Hmotnostní stejnoměrnost. Rektální roztoky vyhovují následující zkoušce. Jednotlivě se zváží obsah dvaceti obalů vyprázdněných, jak lze nejvíce, a vypočte se průměrná hmotnost. Pro přípravky s hmotností do 100 g se nejvíce dvě jednotlivé hmotnosti odlišují od průměrné hmotnosti o více než 10 % a žádná se neliší o více než 20 %. U přípravků s hmotností nad 100 g se nejvíce dvě jednotlivé hmotnosti odlišují od průměrné hmotnosti o více než 5 % a žádná se neliší o více než 10 %.
Pulveres et tabulettae rectales pro solutionibus et suspensionibus
Prášky a tablety pro rektální roztoky a suspenze
Jsou to jednodávkové přípravky, které jsou rozpouštěny nebo dispergovány ve vodě v čas potřeby před podáním. Mohou obsahovat pomocné látky k usnadnění rozpouštění nebo dispergace nebo k zabránění shlukování částic.
Po rozpuštění nebo dispergaci vyhovují požadavkům na rektální roztoky nebo rektální suspenze, jak je to vhodné.
Zkoušení
Zkouška rozpadavosti. Tablety pro rektální roztoky nebo suspenze se rozpadají do 3 min při zkoušce rozpadavosti tablet a tobolek (2.9.1), ale používá se voda R o teplotě 15 °C až 25 °C.
Označování
V označení na obalu se uvede:
- návod na přípravu rektálního roztoku nebo suspenze,
- podmínky a doba uchovávání roztoku nebo suspenze po přípravě.
Rectalia semisolida
Polotuhé rektální přípravky
Jsou to masti, krémy nebo gely.
Jsou často dodávány jako jednodávkové přípravky v obalech s vhodným aplikátorem.
Polotuhé rektální přípravky vyhovují požadavkům článku Unguenta.
Spumae rectales
Rektální pěny
Rektální pěny vyhovují požadavkům článku Spumae medicatae.
Tampona rectalia medicata
Rektální tampony
Jsou to pevné jednodávkové přípravky určené k zavedení do konečníku na určenou dobu. Vyhovují požadavkům článku Tampona medicata.
Vaccina ad usum humanum
Vakcíny pro humánní použití
Synonymum. Očkovací látky pro humánní použití
Ustanovení v tomto článku jsou určena pro použití v souvislosti s lékopisnými články na vakcíny pro humánní použití. Tyto požadavky se nevztahují nezbytně na vakcíny, které nejsou předmětem těchto článků. Kombinované vakcíny, jejichž složení není popsáno ve zvláštním článku, vyhovují článkům pro jednotlivé složky s případnými nezbytnými modifikacemi provedenými oprávněnou autoritou.
Jsou to přípravky obsahující antigenní látky schopné vyvolat u člověka specifickou aktivní imunitu proti infekčnímu agens nebojím vytvořenému toxinu či antigenu. Mělo by se prokázat, že při dodržení zamýšleného vakcinačního schématu mají přijatelnou imunogenní účinnost u člověka.
Mohou obsahovat buď organismy inaktivované vhodnými chemickými nebo fyzikálními prostředky, nebo živé organismy přirozeně nevirulentní nebo přiměřeně ošetřené k oslabení jejich virulence, oboje při zachování odpovídajících imunogenních vlastností; nebo mohou obsahovat antigeny extrahované z organismů nebo jimi vylučované nebo připravené rekombinantní DNK technologií. Tyto antigeny mohou být použity v přirozené podobě nebo mohou být chemicky či fyzikálně detoxikovány, agregovány, polymerizovány nebo konjugovány na nosič ke zvýšení jejich imunogenity.
Termíny použité v článcích na humánní vakcíny jsou definovány ve stati (5.2.1).
Bakteriální vakcíny
Jsou to suspenze s různým stupněm zákalu v bezbarvých nebo téměř bezbarvých tekutinách; mohou být lyofilizované. Koncentrace živých nebo inaktivovaných bakterií se vyjadřuje v mezinárodních zákalových jednotkách, nebo je-li to vhodné, se stanoví přímým spočítáním buněk nebo u živých bakterií stanovením počtu životaschopných zárodků.
Bakteriální toxoidy
Bakteriální toxoidy se připravují z toxinů snížením jejich toxicity na nedetekovatelnou hladinu nebo úplným odstraněním toxicity fyzikálními nebo chemickými postupy, přičemž se zachovají jejich přiměřené imunizační vlastnosti.
Toxiny se získávají z vybraných kmenů mikroorganismů. Postup přípravy je takový, aby se toxoid nezměnil zpět na toxin. Toxoidy mohou být tekuté nebo lyofilizované. Mohou být čištěné a adsorbované.
Adsorbované toxoidy jsou suspenze bílých nebo šedých částic rozptýlených v bezbarvých nebo slabě žlutých tekutinách a mohou tvořit sediment na dně nádoby.
Virové vakcíny
Virové vakcíny se připravují z virů vypěstovaných na zvířatech, ptačích embryích, ve vhodných buněčných kulturách, ve vhodných tkáních nebo v kulturách získaných metodami genového inženýrství. Jsou to tekutiny různého stupně opalescence podle typu přípravy; mohou být lyofilizované. Tekuté přípravky nebo lyofilizované přípravky jsou po rekonstituci zbarveny podle indikátoru pH použitého v kultivačním médiu, např. fenolové červeně.
Výroba
Všeobecná ustanovení. Požadavky na výrobu včetně zkoušení meziproduktu jsou obsaženy v jednotlivých článcích. Po schválení oprávněnou autoritou mohou být některé zkoušky vynechány, jestliže je prokázáno, např. validační studií, že výrobní postup plynule zajišťuje výrobky vyhovující zkouškám.
Pokud není předepsáno a schváleno jinak, používá se při výrobě vakcín systém jednotné inokulace. Metody přípravy jsou navrženy k zachování odpovídajících imunologenních vlastností k vytvoření neškodných přípravků a k zabezpečení před kontaminací cizorodými antigeny.
Vakcíny vyráběné rekombinantní DNK technologií vyhovují článku Praeparata ab ADN recombinante.
Pokud není předepsáno a schváleno jinak, nepoužije se při výrobě šarže vakcíny vyšší pasáž viru nebo větší počet bakteriálních subkultur od matečného inokula, než bylo použito při výrobě vakcíny, která v klinické studii vyhověla z hlediska bezpečnosti a účinnosti.
Vakcíny jsou v mezích možností prosty složek, o nichž je známo, že jsou toxické nebo způsobují alergické reakce nebo nežádoucí účinky u člověka. Mohou se přidat vhodné přísady včetně stabilizátorů a adjuvancií. Penicilín a streptomycin se nepřidávají v žádném stupni výroby ani se nepřidávají ke konečnému výrobku. Avšak matečné inokulum připravené v médiu obsahujícím penicilín nebo streptomycin se může použít pro výrobu, je-li to předepsáno a schváleno.
Provedou se taková opatření, aby se zabránilo kontaminaci vakcín agens způsobujícími spongioformní encefalopatii, např. bovinní spongioformní encefalopatii. Užije-li se k výrobě materiál bovinního nebo ovčího původu, jsou použitá zvířata prosta spongioformní encefalopatie a ani nebyla vystavena riziku takových vlivů, jako je strava s proteiny přežvýkavců. Z těchto důvodů mají zvířata pocházet z certifikovaných zdrojů. Při výběru použitých tkání se zvažuje riziko jejich infekčnosti a potenciálního rizika spojeného s rozdílnými tkáněmi.
Substráty pro pomnožení. Substráty pro pomnožení odpovídají souvisejícím požadavkům lékopisu (5.2.2, 5.2.3), a pokud chybí, požadavkům oprávněné autority. Práce s buněčnou bankou a následnými buněčnými kulturami se provádějí v aseptických podmínkách v prostoru, kde se nepracuje s jinými buňkami. Sérum a trypsin použité při přípravě buněčné suspenze jsou prokazatelně prosty cizorodých agens.
Inokula. Bakteriální nebo virové kmeny použité jako matečné inokulum jsou identifikovány záznamy o udržování, které obsahují zprávu o původu a následném zacházení. V inokulech není přítomen jiný mikroorganismus než matečný kmen.
Kultivační média. Kultivační média jsou co nejvíce možno prosta složek, o nichž je známo, že způsobují u člověka toxické, alergické nebo jiné nežádoucí reakce; jestliže je použití takových složek nezbytné, je třeba prokázat, že jejich přítomnost v šarži je snížena na hladinu zaručující bezpečnost přípravku. Schválené sérum živočišného původu (nikoli lidské) se může použít pro kultivaci buněčných kultur, ale médium použité pro udržování buněčných kultur během pomnožování viru sérum neobsahuje, není-li stanoveno jinak. Médium pro buněčné kultury může obsahovat indikátor pH, např. fenolovou červeň, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Přednostně se pro výrobu používají média bez antibiotik.
Pomnožování a sklizeň. Inokulované kultury se pomnožují a sklízejí za definovaných podmínek. Čistota sklizně se ověřuje vhodnými zkouškami uvedenými v článcích.
Kontrolní buňky. Při výrobě vakcín na buněčných kulturách se kontrolní buňky udržují a zkoušejí, jak je předepsáno. K zajištění platnosti kontroly se tyto buňky udržují v přísně stejných podmínkách jako výrobní buňky, včetně použití stejných šarží média a výměn média.
Kontrolní vejce. Je-li vakcína vyráběna na vejcích, jsou kontrolní vejce inkubována a zkoušena podle předpisu v příslušném článku.
Puriflkace. Je-li to vhodné, použije se validovaný purifikační postup.
Inaktivace. Inaktivované vakcíny se vyrábějí validováným inaktivačním postupem, jehož účinnost a pravidelnost byly prokázány. Je-li známa možná kontaminace při sklizni, např. u vakcín vyráběných na vejcích ze zdravých chovů, které nemají označení, že jsou prosty specifikovaných patogenů, je inaktivační proces validován i vzhledem k těmto možným kontaminantám. Zkouška inaktivace se provede co nejdříve po ukončení inaktivačního procesu, není-li předepsáno a schváleno jinak.
Meziprodukty. Je-li to vhodné, vyhodnotí se stabilita meziproduktů v daných podmínkách uchovávání a stanoví se doba platnosti.
Konečná várka. Konečná várka se připraví aseptickým smícháním všech složek vakcíny.
Adsorbenty. Vakcíny mohou být adsorbované na hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, fosforečnan vápenatý nebo jiný vhodný sorbent. Sorbenty se připravují ve zvláštních podmínkách, které jim zajistí vhodnou fyzikální formu a adsorpční vlastnosti.
Protimikrobní konzervační látky. Ke sterilním a inaktivovaným přípravkům se může přidat vhodná protimikrobní konzervační látka, jež se přidává vždy, když se přípravky dodávají v mnohodávkových obalech, pokud není stanoveno jinak. Použije-li se protimikrobní konzervační látka, má se prokázat, že nemá vliv na bezpečnost a účinnost vakcíny a že je účinná po dobu platnosti.
Šarže. U vakcín pro parenterální podání se šarže asepticky plní do sterilních a zabezpečených obalů, které se po případné lyofilizaci uzavřou tak, aby se vyloučila kontaminace.
Vakcíny pro neparenterální podání se připraví rozplněním konečné várky do sterilních zabezpečených obalů za vhodných podmínek.
Stabilita. Uchování účinnosti šarže v době platnosti se má prokázat validační studií.
Určí se pokles účinnosti za doporučených skladovacích podmínek a vyšší pokles může naznačit, že vakcína není přijatelná, i když stanovená účinnost je vyhovující.
Stupeň adsorpce. Během vývoje adsorbované vakcíny se hodnotí stupeň adsorpce jako součást zkoušek pravidelnosti výroby. Propouštěcí specifikace pro stupeň adsorpce se stanoví na základě výsledků šarží propuštěných ke klinickému zkoušení. Ze stabilitních údajů vytvořených pro vakcínu má být prokázáno, že stupeň adsorpce ke konci doby platnosti nebude menší než u šarží použitých v klinické studii.
Zkoušky na čistotu
Vakcíny vyhovují zkouškám předepsaným v jednotlivých článcích, obsahujících, je-li to vhodné:
Hliník (2.5.13). Je-li jako sorbent ve vakcíně použit hliník, je jeho obsah v jedné lidské dávce nejvýše 1,25 mg hliníku (A1), není-li stanoveno jinak.
Vápník (2.5.14). Je-li jako sorbent ve vakcíně použit vápník, je jeho obsah v jedné lidské dávce nejvýše 1,3 mg vápníku (Ca), není-li stanoveno jinak.
Formaldehyd (2.4.18). Pokud byl při výrobě použit formaldehyd, je obsah volného formaldehydu v konečném výrobku nejvýše 0,2 g/l, není-li stanoveno jinak.
Fenol (2.5.15). Pokud byl při výrobě použit fenol, je jeho obsah v konečném výrobku nejvýše 2,5 g/l, není-li stanoveno jinak.
Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Lyofilizované vakcíny obsahují nejvýše 3,0 % vody, není-li stanoveno jinak.
Uchovávání
Vakcíny se chrání před světlem, a není-li stanoveno jinak, uchovávají se při 5 °C ± 3 °C. Tekuté adsorbované vakcíny nesmějí zmrznout.
Doba použitelnosti. Není-li stanoveno jinak, stanovuje se doba použitelnosti od začátku zkoušení. Doba použitelnosti platí pro vakcíny uchovávané za předepsaných podmínek.
Označování
V označení na obalu se uvede:
- název přípravku,
- údaj identifikující šarži,
- doporučená humánní dávka a způsob podání,
- podmínky uchovávání,
- doba použitelnosti,
- název a množství protimikrobní konzervační látky,
- názvy antibiotik, adjuvans, příchuti nebo stabilizátoru přítomných ve vakcíně,
- název jakékoliv složky, která může způsobit nežádoucí reakce a jakékoliv kontraindikace použití vakcíny,
- u lyofilizovaných vakcín:
- název nebo složení a objem přiložené tekutiny k rekonstituci,
- doba, do které se má vakcína po rekonstituci podat.
Acaciae mucilago
Sliz z arabské klovatiny
Synonymum. Mucilago gummi arabici
Je to koloidní roztok arabské klovatiny v konzervační vodě.
Příprava

Acaciae gummi dispersione desiccatum (Acaciae gummi)	100,0 g
Aqua conservans	ad 300,0 g

Arabská klovatina usušená rozprášením (popř. arabská klovatina) se rozpustí v konzervační vodě. Je-li třeba, zfiltruje se, rozplní se do lahví nejvýše po 100 ml a sterilizuje se např. 15 min párou při 121 °C (5.1.1).
Vlastnosti
Bezbarvá nebo nažloutlá čirá nebo slabě opalizující viskózní lepivá kapalina, mísitelná s vodou.
Zkoušky totožnosti
Zkoušky na čistotu
Zásaditě reagující látky a volné kyseliny. 1 ml se smíchá se 4 ml vody R. Ke 2 ml této směsi se přidá 0,05 ml červeně methylové RS; směs je zbarvená červeně. K dalším 2 ml této směsi se přidá 0,05 ml modři bromfenolové RS; směs je zbarvená zeleně nebo modře.
Tragant. 3 ml se smíchají se 7 ml vody R a přidá se 1 ml octanu olovnatého RS; po protřepání nevznikne zákal.
Parabeny. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za. použití vrstvy vhodného oktadecylsilanizovaného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.
Zkoušený roztok. 10 ml se třikrát intenzivně protřepe s 5 ml etheru R. Spojené etherové výtřepky se odpaří na vodní lázni do sucha, zbytek se rozpustí v acetonu R a zředí se jím na 10 ml.
Porovnávací roztok (a). 10 mg methylparabenu CRL se rozpustí v acetonu R a zředí se jím na 10 ml.
Porovnávací roztok (b). 5 mg propylparabenu CRL se rozpustí v acetonu R a zředí se jím na 10 ml.
Porovnávací roztok (c). 1 ml porovnávacího roztoku (a) a 1 ml porovnávacího roztoku (b) se smíchají.
Na vrstvu se nanese odděleně po 2 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, vody R a methanolu R (1 + 30 + 70) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Na chromatogramu zkoušeného roztoku jsou dvě skvrny, z nichž jedna polohou a intenzitou zhášení fluorescence odpovídá skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) a druhá skvrna odpovídá polohou a intenzitou zhášení fluorescence skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (b). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) jsou dvě zřetelně od sebe oddělené skvrny.
Uchovávání
Ve vzduchotěsných obalech, v chladnu, chráněn před světlem.
Označování
V označení na obalu se uvede, že přípravek obsahuje methylparaben a propylparaben.
Acidi borici aqua ophthalmica
Oční voda s kyselinou boritou
Je to sterilní roztok kyseliny borité stabilizovaný vhodnou protimikrobní přísadou.
Obsahuje 1,63 % až 1,75 % H₃BO₃ (M_r 61,83).
Příprava

Acidum bricum	1,690 g
Thiomersalum	0,002 g
Aqua purificata	ad 100,0 g

Kyselina boritá se rozpustí v roztoku 0,002 g thiomersalu v 90 g vysterilizované čištěné vody 60 °C až 70 °C teplé. Roztok se ochladí, doplní se vysterilizovanou čištěnou vodou do 100,0 g, provede se membránová filtrace, rozplní se do vhodných obalů v prostoru čistoty A nebo se sterilizuje v konečném obalu párou (5.1.1) 15 min při 121 °C.
Jako vhodnou protimikrobní přísadu lze také použít např. fenylhydrargyriumborat (0,01 g/l).
Vlastnosti
Čirá bezbarvá tekutina.
Zkoušky totožnosti
Zkoušky na čistotu
Vzhled. Zkoušený přípravek je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).
Hodnota pH (2.2.3). 4,0 až 5,5.
Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.
Stanovení obsahu
6,000 g se smíchá s 10 ml čerstvě připraveného roztoku sorbitolu R (200 g/l) předem zneutralizovaného hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS na 0,5 ml modři thymolové RS do zeleného zbarvení a titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS do stejného zbarvení.
1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 6,183 mg H₃BO₃.
Uchovávání
Viz článek Ocularia.
Chráněna před světlem.
Označování
Viz článek Ocularia, odstavec Aquae ophthalmicae.
V označení na obalu se uvede název použité protimikrobní přísady.
Vydávání
Vydává se v obalech o obsahu obvykle 100 ml, nejvýše však 200 ml. Odděleně dodaný aplikátor vyhovuje zkoušce na sterilitu, viz článek Ocularia, odstavec Sterilita.
Acidi borici oculoguttae
Oční kapky s kyselinou boritou
Synonymum. Collyrium acidi borici
Je to sterilní roztok kyseliny borité stabilizovaný vhodnou protimikrobní přísadou. Obsahuje 1,63 % až 1,75 % H₃BO₃ (M_r 61,83).
Příprava

Acidum boricum	1,690 g
Thiomersalum	0,002 g
Aqua purificata	ad 100,0 g

Kyselina boritá se rozpustí v roztoku 0,002 g thiomersalu v 90 g vysterilizované čištěné vody 60 °C až 70 °C teplé. Roztok se ochladí, doplní se vysterilizovanou čištěnou vodou do 100,0 g, provede se membránová filtrace, rozplní se do vhodných obalů v prostoru čistoty A nebo se sterilizuje v konečném obalu párou (5.1.1) 15 min při 121 °C.
Jako vhodnou protimikrobní přísadu lze také použít např. fenylhydrargyriumborat (0,01 g/l).
Vlastnosti
Čirá bezbarvá tekutina.
Zkoušky totožnosti
Zkoušky na čistotu
Vzhled. Zkoušený přípravek je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).
Hodnota pH (2.2.3). 4,0 až 5,5.
Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.
Stanovení obsahu
6,000 g se smíchá s 10 ml čerstvě připraveného roztoku sorbitolu R (200 g/l) předem zneutralizovaného hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS na 0,5 ml modři thymolové RS do zeleného zbarvení a titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS do stejného zbarvení.
1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 6,183 mg H₃BO₃.
Uchovávání
Viz článek Ocularia.
Chráněny před světlem.
Označování
Viz článek Ocularia, odstavec Oculoguttae.
V označení na obalu se uvede název použité protimikrobní přísady.
Vydávání
Vydává se v obalech o obsahu obvykle 10 ml, nejvýše však 20 ml as uzávěry umožňujícími podávání ve formě jednotlivých kapek.
Předepíše-li lékař Solutio acidi borici nebo Acidum boricum solutum a z návodu k použití přpravku je zřejmé, že přípravek je určen k podání do oka, vydává se Acidi borici oculoguttae.
Acidi borici rhinoguttae cum ephedrino
Nosní kapky s kyselinou boritou a s efedrinem
Synonymum. Acidi borici cum ephedrino naristillae
Je to roztok efedriniumchloridu (C₁₀H₁₆ClNO, M_r201,70) a kyseliny borité (H₃BO₃, M_r61,83). Obsahuje 0,90 % až 1,10 % C₁₀H₁₆ClNO a 2,85 % až 3,15 % H₃BO₃.
Příprava

Ephedrini hydrochloridum	1,0 g
Acidum boricum	3,0 g
Aqua purificata	ad 100,0 g

Kyselina boritá se rozpustí v čištěné vodě zahřáté na 60 °C až 70 °C, roztok se ochladí, přidá se efedriniumchlorid, doplní se převařenou a vychladlou čištěnou vodou do 100,0 g a zfiltruje se.
Vlastnosti
Čirá bezbarvá tekutina.
Zkoušky totožnosti
Zkoušky na čistotu
Vzhled. Zkoušený přípravek je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).
Hodnota pH (2.2.3). 4,0 až 5,5.
Mikrobiální znečištění. Vyhovuje požadavkům na 2. kategorii (5.1.4). Počet mikroorganismů se stanoví metodou membránové filtrace (2.6.12).
Stanovení obsahu
Efedriniumchlorid. 3,000 g se zředí 40 ml vody R, přidá se 5 ml kyseliny dusičné zředěné RS a titruje se dusičnanem stříbrným 0,02 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20) (stříbrná a nasycená kalomelová elektroda).
1 ml dusičnanu stříbrného 0,02 mol/l VS odpovídá 4,034 mg C₁₆H₁₆ClNO.
Kyselina boritá. 3,500 g se smíchá s 10 ml čerstvě připraveného roztoku sorbitoluR(200 g/l) předem zneutralizovaného hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS na 0,5 ml červeně fenolové RS do fialově červeného zbarvení a titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS do stejného zbarvení.
1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 6,183 mg H₃BO₃.
Uchovávání
Viz článek Nas alia.
V chladu, chráněny před světlem.
Označování
Viz článek Nasalia.
Vydávání
Vydává se jen na lékařský předpis.
Acidi borici solutio 3%
Roztok kyseliny borité 3%
Je to roztok kyseliny borité. Obsahuje 2,85 % až 3,15 % H₃BO₃ (M_r61,83).
Příprava

Acidum boricum	3,0 g
Aqua purificata	97,0 g

Kyselina boritá se rozpustí v čištěné vodě zahřáté na 60 °C až 70 °C a roztok se zfiltruje.
Vlastnosti
Čirá bezbarvá tekutina.
Zkouška totožnosti
5 ml se odpaří na porcelánové misce na vodní lázni do sucha, zbytek se rozpustí ve 3 ml lihu 96% R a přidá se 0,5 ml kyseliny sírové R. Tento roztok po zapálení hoří plamenem, který je zvláště na okraji zeleně zbarvený (kyselina boritá).
Zkoušky na čistotu
Vzhled. Zkoušený přípravek je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).
Hodnota pH (2.2.3). 4,0 až 5,0.
Stanovení obsahu
3,500 g se smíchá s 10 ml čerstvě připraveného roztoku sorbitolu R (200 g/l) předem zneutralizovaného hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS na 0,5 ml modři thymolové RS do zeleného zbarvení a titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS do stejného zbarvení.
1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 6,183 mg H₃BO₃.
Uchovávání
Viz článek Liquida ad usum dermicum.
V chladnu.
Vydávání
Předepíše-li lékař Solutio acidi borici nebo Acidum boricum solutum nebo Aqua borica a z návodu k použití je zřejmé, že jde o přípravek určený k podání do oka, vydá se Acidi borici oculoguttae nebo Acidi borici aqua ophthalmica.
Acidi borici unguentum 10%
Borová mast 10%
Synonymum. Unguentum acidi borici 10%
Je to hydrofobní mast obsahující 9,4 % až 10,6 % kyseliny borité (H₃BO₃, M_r61,83).
Příprava

Acidum boricum (180)	100,0 g
Vaselinum album	900,0 g

Za stálého roztírání se ke kyselině borité po částech přidává roztavená bílá vazelína a míchá se do vychladnutí.
Vlastnosti
Bílá prosvítavá mast.
Zkoušky totožnosti
Stanovení obsahu
1,000 g se v baňce se zabroušenou zátkou protřepává s 20 ml etheru petrolejového R, až se bílá vazelína rozpustí. Pak se přidá 20 ml čerstvě připraveného roztoku sorbitoluR (100 g/l) předem zneutralizovaného hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS na 0,5 ml modři thymolové RS do zeleného zbarvení a titruje se za stálého silného protřepávání hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS do stejného zbarvení.
1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 6,183 mg H₃BO₃.
Uchovávání
Viz článek Unguenta.
Chráněna před světlem.
Označování
Viz článek Unguenta.
Vydávání
Předepíše-li lékař Acidi borici unguentum a neuvede-li koncentraci, vydává se mast 3%. Na tuto koncentraci se upravuje bílou vazelínou.
Acidi salicylici solutio ethanolica
Ethanolický roztok kyseliny salicylové
Synonymum. Acidi salicylici solutio spirituosa
Je to roztok kyseliny salicylové (C₇H₆O₃, M_r 138,12) v ethanolu 60%. U individuálně připravených roztoků kyseliny salicylové obsahují koncentrace do 2 % včetně 90,0 % až 110,0 % deklarovaného množství C₇H₆O₃, vyšší koncentrace obsahují 92,5 % až 107,5 % deklarovaného množství C₇H₆O₃. Zásobní roztok určený k další přípravě léčivých přípravků obsahuje 95,0 % až 105,0 % deklarovaného množství C₇H₆O₃.
Příprava

Koncentrace roztoku	1 %	2%	3%	5%	10%
Acidum salicylicum	1,0 g	2,0 g	3,0 g	5,0 g	10,0 g
Ethanolum 60%	99,0 g	98,0 g	97,0 g	95,0 g	90,0 g

Kyselina salicylová se rozpustí v ethanolu 60% a roztok se zfiltruje.
Vlastnosti
Čirá bezbarvá kapalina pachu po ethanolu.
Zkouška totožnosti
0,1 ml až 0,3 ml (podle deklarované koncentrace kyseliny salicylové) se zředí 10 ml vody R a přidá se 0,1 ml chloridu železitého RS1; vznikne intenzivně červenofialové zbarvení.
Zkouška na čistotu
Vzhled. Zkoušený přípravek je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2).
Stanovení obsahu
Kyselina salicylová. Množství zkoušeného přípravku odpovídající asi 0,250 g kyseliny salicylové se zředí lihem 96% R na 25 ml, přidá se 0,1 ml červeně fenolové RS a titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS do vzniku červenofialového zbarvení.
1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 13,81 mg C₇H₆O₃.
Ethanol. Pyknometricky se stanoví relativní hustota

(d_{20}^{20})

zkoušeného přípravku (2.2.5). Obsah ethanolu ve zkoušeném přípravku v procentech (x) se vypočítá podle vzorce:

x = 445,64 - 432 A + 4,12 B - 3,36 A B + 0,0116 B^{2},

v němž značí:
A -

d_{20}^{20}

zkoušeného přípravku,
B - obsah kyseliny salicylové v procentech stanovený v odstavci Kyselina salicylová.
Uchovávání
Viz článek Liquida ad usum dermicum.
Chráněn před světlem.
Označování
Viz článek Liquida ad usum dermicum.
Vydávání
Je-li předepsáno Acidi salicylici solutio ethanolica (spirituosa) bez uvedení koncentrace kyseliny salicylové, vydá se 1% roztok.
Acidi salicylici unguentum 10%
Salicylová mast 10%
Synonymum. Unguentum acidi salicylici concentratum
Je to hydrofobní mast obsahující 9,4 % až 10,6 % kyseliny salicylové (C₇H₆O₃, M_r 138,12).
Příprava

Acidum salicylicum (180)	100,0 g
Paraffinum liquidum	50,0 g
Vaselinum flavum	850,0 g

Kyselina salicylová se důkladně rozetře s tekutým parafinem a asi 100 g žluté vazelíny podle potřeby roztavené, potom se přidá zbytek žluté vazelíny a míchá se do vychladnutí nebo se zhomogenizuje ve vhodném zařízení.
Vlastnosti
Světle žlutá stejnorodá mast.
Zkoušky totožnosti
Stanovení obsahu
1,000 g se v baňce se zabroušenou zátkou protřepává s 20 ml etheru petrolejového R do rozpuštění. K roztoku se přidá 10 ml lihu 96% R předem zneutralizovaného hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS na 0,2 ml fenolftaleinu RS1 do slabě červeného zbarvení. Titruje se za stálého protřepávání hydroxidem sodným 0,1 mol/ VS do stejného zbarvení.
1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 13,81 mg C₇H₆O₃.
Uchovávání
Viz článek Unguenta.
Chráněna před světlem.
Označování
Viz článek Unguenta.
Vydávání
Je-li předepsáno Acidi salicylici unguentum bez uvedení koncentrace kyseliny salicylové, vydává se Acidi salicylici unguentum 1%. Na nižší koncentraci kyseliny salicylové se mast upraví žlutou vazelínou.
Alcoholis cetylici cremor
Cetanolový krém
Synonymum. Cremor cetylicus
Je to hydrofobní krém s cetylalkoholem. Obsahuje 37,5 % až 42,5 % vody.
Příprava

Alcoholis cetylici unguentum	60,0 g
Aqua purificata	40,0 g

Do změklé nebo roztavené cetanolové masti se po částech vmíchá stejně teplá čištěná voda a míchá se do vychladnutí.
Vlastnosti
Bílý krém, na jehož povrchu nejsou viditelné kapky ani souvislá vrstva vody. Ve vodě se nerozpouští. Dá se do něj vmíchat další, ale jen omezené množství vody.
Zkoušky totožnosti
Zkoušky na čistotu
Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 5.
Číslo peroxidové (2.5.5). Nejvýše 10.
Stanovení obsahu
Voda. Stanoví se způsobem uvedeným ve stati Stanovení vody destilací (2.2.13).
Uchovávání
V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem a mrazem.
Alcoholis cetylici unguentum
Cetanolová mast
Synonymum. Unguentum cetylicum
Je to mast emulgující vodu s cetylalkoholem.
Příprava

Alcohol cetylicus	20,0 g
Adeps lanae	150,0 g
Vaselinum album	830,0 g

Cetylalkohol, tuk z ovčí vlny a bílá vazelína se roztaví a směs se míchá do vychladnutí.
Vlastnosti
Slabě nažloutlá mast, téměř bez pachu. V 1mm až 2mm tloušťce vrstvy je prosvítavá. Dá se do ní vmíchat omezené množství vody.
Zkoušky totožnosti
Zkoušky na čistotu
Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 5.
Číslo peroxidové (2.5.5). Nejvýše 10.
Zkouška lékové formy
Vodné číslo. Nejméně 60. Do 25,0 g měkké nebo při nejnižší možné teplotě roztavené masti ve třence odvážené s těrkou se za stálého míchání postupně přidává voda R stejné teploty tak dlouho, pokud ji mast váže. Míchá se do vychladnutí. Vzniklá emulze se nechá 24 h stát při pokojové teplotě. Oddělená voda se odstraní, směs se opatrně rozetře po stěnách třenky a kapky vody se odsají filtračním papírem. Potom se třenka s těrkou i obsahem zváží. Vodné číslo se vypočítá podle vzorce:

\frac{100 \cdot a}{n},

v němž značí:
a - množství vody zjištěné diferenčním vážením v gramech,
n - navážku zkoušeného přípravku v gramech.
Uchovávání
Viz článek Unguenta.
Chráněna před světlem.
Označování
Viz článek Unguenta.
Alcoholum adipis lanae cremor
Krém s alkoholy tuku z ovčí vlny
Synonymum. Cremor lanalcoli
Je to hydrofobní krém obsahující 48,0 % až 52,0 % vody a alkoholy z tuku z ovčí vlny.
Příprava

Alcoholum adipis lanae unguentum	50,0 g
Aqua purificata	50,0 g

Do změklé nebo roztavené masti s alkoholy tuku z ovčí vlny se po částech vmíchá stejně teplá čištěná voda a směs se míchá do vychladnutí.
Vlastnosti
Bledě žlutý krém slabého charakteristického pachu. Na povrchu nejsou viditelné kapky ani souvislá vrstva vody. Ve vodě se nerozpouští. Dá se do něj vmíchat další, ale jen omezené množství vody.
Zkoušky totožnosti
Stanovení obsahu
Voda. Stanoví se způsobem uvedeným ve stati Stanovení vody destilací (2.2.13).
Uchovávání
V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem a mrazem.
Alcoholum adipis lanae unguentum
Mast s alkoholy tuku z ovčí vlny Synonyma. Unguentum lanalcoli
Je to mast emulgující vodu s alkoholy tuku z ovčí vlny.
Příprava

Alcoholes adipis lanae	100,0 g
Vaselinum flavum	900,0 g

Alkoholy tuku z ovčí vlny a žlutá vazelína se roztaví a směs se míchá do vychladnutí.
Vlastnosti
Prosvítavá mast slabého charakteristického pachu. Dá se do ní vmíchat omezené množství vody.
Zkoušky totožnosti
Zkouška lékové formy
Vodné číslo. Nejméně 100. Do 25,0 g měkké nebo při nejnižší možné teplotě roztavené masti ve třence odvážené s těrkou se za stálého míchání postupně přidává voda R stejné teploty tak dlouho, pokud ji mast váže. Míchá se do vychladnutí. Vzniklá emulze se nechá 24 h stát při pokojové teplotě. Oddělená voda se odstraní, směs se opatrně rozetře po stěnách třenky a kapky vody se odsají filtračním papírem. Potom se třenka stěrkou i obsahem zváží. Vodné číslo se vypočítá podle vzorce:

\frac{100 \cdot a}{n},

v němž značí:
a - množství vody zjištěné diferenčním vážením v gramech,
n - navážku zkoušeného přípravku v gramech.
Uchovávání
Viz článek Unguenta.
Chráněna před světlem.
Označování
Viz článek Unguenta.
Aluminii acetotartratis cremor
Krém s octanem a vínanem hlinitým
Synonymum. Cremor aluminii acetico-tartarici
Je to hydrofobní krém s octanem hlinitým a vínanem hlinitým. Obsahuje 0,12 % až 0,16 % hliníku (A1, A_r 26,98) a 16,0 % až 20,0 % vody (H₂O, M_r 18,02).
Příprava

Aluminii acetotartratis solutio	100,0 g
Aqua purificata	100,0 g
Adeps lanae	200,0 g
Vaselinum flavum	600,0 g

Tuk z ovčí vlny a žlutá vazelína se zahřívají na vodní lázni při 40 °C a mícháním se zhomogenizují. Do této směsi se po částech vmíchá 40 °C teplá směs roztoku octanu a vínanu hlinitého a čištěné vody. Směs se míchá do vychladnutí. Po 24 h se znovu promíchá.
Vlastnosti
Nažloutlý krém, slabě páchnoucí po kyselině octové. Na jeho povrchu nejsou viditelné kapky ani souvislá vrstva vody. Ve vodě se nerozpouští. Dá se do něj vmíchat další, ale jen omezené množství vody.
Zkoušky totožnosti
Stanovení obsahu
Hliník. Do 250ml baňky se zábrusem se naváží 10,00 g zkoušeného přípravku, přidá se 1 ml kyseliny chlorovodíkové 2 mol/l RS, 15 ml ethylacetatu R, 15,0 ml edetanu disodného 0,1 mol/l VS a zahřívá se 15 min pod zpětným chladičem za mírného varu. Potom se chladič propláchne asi 20 ml vody R, přidá se 5,0 g methenaminu R, asi 0,04 g oranže xylenolové s dusičnanem draselným R a ještě teplá směs se za stálého míchání titruje dusičnanem olovnatým 0,1 mol/l VS ze žlutého do trvale fialově červeného zbarvení vodné vrstvy.
1 ml edetanu disodného 0,1 mol/l VS odpovídá 2,698 mg A1.
Voda. Stanoví se způsobem uvedeným v článku Stanovení vody destilací (2.2.13).

A. 1 g se smíchá v kádince s 5 g chloroformu R a stejné množství se v jiné kádince smíchá s 5 ml vody R. Zkoušená mast se rozpouští v chloroformu, ve vodě se nerozpouští (hydrofobní mast).

A. Na dvě podložní sklíčka se nanese asi 2 mm silná vrstva krému. Na jednu vrstvu se kápne jedna kapka roztoku sudanu III R (10 g/l) v parafinu tekutém R, na druhou vrstvu jedna kapka roztoku modři methylenové R (2 g/l). Po 2 min se vrstvy opláchnou vodou R a prohlédne se jejich zbarvení. Zkoušený přípravek se roztokem sudanu III zbarví červeně a roztokem modři methylenové se nezbarví (hydrofobní krém).

A. 10 ml se odpaří na porcelánové misce na vodní lázni do sucha, zbytek se rozpustí ve 3 ml lihu 96% R a 0,5 ml kyseliny sírové R. Tento roztok po zapálení hoří plamenem, který je zvláště na okraji zeleně zbarvený (kyselina boritá).

A. K 1 ml se přidá několik krystalků hexakyanoželezitanu draselného R, 0,2 ml hydroxidu sodného RS a zahřeje se k varu. Je cítit pach benzaldehydu a navlhčený lakmusový papír se vznikajícími parami postupně barví modře (efedrin).

A. 1 g se smíchá v kádince s 5 g chloroformu R a stejné množství se v jiné kádince smíchá s 5 ml vody R. Masťový základ se rozpouští v chloroformu, ve vodě se nerozpouští (hydrofobní mast).

A. Na dvě podložní sklíčka se nanese asi 2 mm silná vrstva krému. Na jednu vrstvu se kápne jedna kapka roztoku sudanu III R (10g/l) v tekutém parafinu R, na druhou vrstvu jedna kapka roztoku modři methylenové R (2 g/l). Po 2 min se vrstvy opláchnou vodou R a prohlédne se jejich zbarvení. Zkoušený přípravek se roztokem sudanu zbarví červeně a roztokem modři methylenové se nezbarví (hydrofobní krém).

A. Několik kapek se smíchá se 2 ml vody R a přidá se octan olovnatý zásaditý RS; po několika minutách vznikne bílá sraženina (klovatina).

B. Asi 0,5 g se třepáním rozpustí v 5 ml chloroformu R, přidá se 1 ml acetanhydridu R, 0,1 ml kyseliny sírové R a roztok se opatrně promíchá; roztok se zbarví sytě zeleně (cholesterol).

B. 5 g se protřepe s 20 ml chloroformu R a s 10 ml vody R. Vodná vrstva se zfiltruje přes navlhčený filtrační papír, filtrát se rozdělí na 3 díly a použije se také ke zkouškám C a D. K první části filtrátu se přidá 0,3 ml kyseliny octové zředěné RS, 0,6 ml hydrogenfosforečnanu sodného RS a zahřeje se k varu; vznikne bílá gelovitá sraženina rozpustná v kyselině chlorovodíkové 10% RS (hliník).

B. 2 ml se protřepou s 1 ml chloroformu R a 0,2 ml dithizonu RS. Chloroformová vrstva se zbarví hnědožlutě (sloučenina Hg).

B. 1 ml vyhovuje zkoušce (a) na chloridy (2.3.1).

B. Asi 1 g se rozetře v porcelánové misce se 3 ml lihu 96% R a 0,5 ml kyseliny sírové R. Zapálený lihový výluh hoří plamenem, který je zvláště na okraji zeleně zbarvený (kyselina boritá).

B. 0,5 g se zahřeje s 10 ml vody R k varu. Po vychladnutí se tekutina zfiltruje. Filtrát reaguje na lakmusový papír zřetelně kysele a po přidání 0,1 ml chloridu železitého RS1 se zbarví červenofialově (kyselina salicylová).

B. Asi 0,5 g se protřepe s 5 ml chloroformu R a zakalený roztok se zfiltruje suchým papírovým filtrem. K filtrátu se přidá 1 ml acetanhydridu R a 0,1 ml kyseliny sírové R a opatrně se promíchá; roztok se zbarví zeleně (cholesterol).

B. Asi 0,5 g se třepáním rozpustí v 5 ml chloroformu R a zakalený roztok se zfiltruje suchým papírovým filtrem. K filtrátu se přidá 1 ml acetanhydridu R a 0,1 ml kyseliny sírové R a roztok se opatrně promíchá; roztok se zbarví zeleně (cholesterol).

B. Ke 2 ml se přidá 0,5 ml zkoumadla Milionová R a zahřeje se k varu; kapalina se zbarví tmavě červeně (parabeny).

C. 5 ml se odpaří na porcelánové misce na vodní lázni do sucha, zbytek se rozpustí ve 3 ml lihu 96% R a přidá se 0,5 ml kyseliny sírové R. Tento roztok po zapálení hoří plamenem, který je zvláště na okraji zeleně zbarvený (kyselina boritá).

C. Ke druhé části filtrátu ze zkoušky B se přidají 2 ml lihu 96% R, 2 ml kyseliny sírové R a mírně se zahřeje; vzniká pach ethylacetatu (kyselina octová).

C. Hustota (2.2.5). ρ₂₀= 1,110 g/cm³až 1,130 g/cm³.

D. Ke třetí části filtrátu ze zkoušky B se přidá 0,05 ml manganistanu draselného 0,02 mol/l RS a 0,1 ml kyseliny sírové zředěné RS a mírně se zahřeje; tekutina se odbarví (kyselina vinná).

E. Asi 0,5 g se protřepe s 5 ml chloroformu R a zakalený roztok se zfiltruje suchým papírovým filtrem. K filtrátu se přidá 1 ml acetanhydridu R a 0,1 ml kyseliny sírové R a opatrně se promíchá; roztok se zbarví zeleně (cholesterol).

6.2.1 Obecné články lékových forem

2.2 Fyzikální a fyzikálně-chemické metody

2.2.6 Index lomu ¹)

Index lomu n^t_λ prostředí vztažený na vzduch se udává jako poměr sinu úhlu dopadu paprsku světla ve vzduchu k sinu úhlu lomu paprsku světla v daném prostředí.
Pokud není uvedeno jinak, měří se index lomu při (20 ± 0,5) °C při vlnové délce D-linie sodíkového světla (λ = 589,3 nm); užívaný symbol je potom

n_{D}^{20}

.
Přístroje na měření indexu lomu – refraktometry obvykle stanovují mezní úhel. Základní částí těchto přístrojů je hranol o známém indexu lomu, který je ve styku se zkoušenou kapalinou.
Ke kalibraci přístroje se použijí referenční kapaliny uvedené v tabulce. 2.2.6-1. Hodnota indexu lomu každé referenční kapaliny je uvedena v označení na obalu.
Tab. 2.2.6-1

Referenční kapalina	Δn/Δt (teplotní koeficient)
trimethylpentan CRL	-0,00049
toluen CRL	-0,00056
methylnaftalen CRL	-0,00048

Při použití bílého světla je refraktometr vybaven příslušným kompenzačním zařízením. Přístroj umožňuje přesný odečet nejméně na tři desetinná místa a je vybaven zařízením umožňujícím práci při předepsané teplotě. Stupnice teploměru je dělena po 0,5 °C nebo přesněji.

2.2.27 Tenkovrstvá chromatografie

Tenkovrstvá chromatografie je separační metoda, u které stacionární fázi tvoří vhodný materiál nanesený v rovnoměrné tenké vrstvě na skleněný, kovový nebo plastový podklad (desku). Roztoky stanovovaných látek se na vrstvu nanášejí před vyvíjením. Separace je založena na adsorpci, dělení, iontové výměně nebo na kombinaci těchto mechanismů a dochází k ní migrací (vyvíjením) rozpuštěných látek (roztoky analytů) tenkou vrstvou stacionární fáze v rozpouštědle nebo vhodné směsi rozpouštědel (mobilní fáze).
Zařízení
Desky. Chromatografie se provádí na vrstvou potažených deskách popsaných ve stati Zkoumadla (4.1.1).
Předběžná úprava vrstev. Před separací mohou být vrstvy, je-li třeba, promyty, např. může být provedena migrace vhodným rozpouštědlem. Vrstvy mohou být rovněž impregnovány vyvíjením, ponořením nebo postřikem. Je-li nutné, vrstvy je možno před použitím aktivovat zahřátím v sušárně při 100 °C až 105 °C po dobu 1 h.
Chromatografická komora s plochým nebo dvojžlábkovým dnem z inertního průsvitného materiálu vhodné velikosti pro použité desky, opatřená dobře těsnicím víkem. Komora pro horizontální vyvíjení je opatřena žlábkem pro mobilní fázi a přídavným zařízením umožňujícím přímý kontakt mobilní fáze a stacionární fáze.
Mikropipety, mikroinjekční stříkačky, kalibrované kapiláry pro jedno použití nebo jiné nanášecí zařízení, které je vhodné pro správné nanášení roztoku.
Fluorescenční detekční zařízení pro přímé hodnocení fluorescence nebo zhášení fluorescence.
Detekční činidla pro detekci oddělených skvrn postřikem, vystavením vlivu par nebo ponořením.
Pracovní postup
Vertikální vyvíjení. Stěny chromatografické komory se vyloží filtračním papírem. Do chromatografické komory se nalije podle její velikosti takové množství mobilní fáze, aby po impregnaci filtračního papíru byla vrstva ponořena do vhodné hloubky vzhledem k rozměrům použité desky. Pro nasycení se komora uzavře víkem a nechá se stát 1 h při 20 °C až 25 °C. Není-li předepsáno jinak, chromatografická separace se provádí v nasycené komoře.
Nanese se předepsaný objem roztoků po dostatečně malých dávkách ve formě proužku nebo kruhových skvrn ve vhodné vzdálenosti od spodního okraje a bočních okrajů desky. Roztoky se nanášejí na start rovnoběžně se spodním okrajem desky tak, aby vzdálenost mezi skvrnami byla nejméně 10 mm.
Po odpaření rozpouštědla z nanesených roztoků se vrstva vloží do chromatografické komory tak aby byla v co nejvíce vertikální poloze a skvrny nebo proužky byly nad hladinou mobilní fáze. Komora se uzavře, udržuje se při teplotě 20 °C až 25 °C a chrání se před slunečním světlem. Deska se vyjme, když mobilní fáze dosáhne předepsané vzdálenosti, vysuší se a deteguje se předepsaným způsobem.
Pro dvojrozměrnou chromatografii se vrstva po prvním vyvíjení vysuší a provede se druhé vyvíjení ve směru kolmém na směr prvního vyvíjení.
Horizontální vyvíjení. Nanese se předepsaný objem roztoků po dostatečně malých dávkách tak, aby vznikly kruhové skvrny o průměru 1 mm až 2 mm nebo proužky 5 mm až 10 mm x 1 mm až 2 mm ve vhodné vzdálenosti od spodního okraje a bočních okrajů desky. Roztoky se nanášejí na start rovnoběžně se spodním okrajem desky tak, aby vzdálenost mezi skvrnami byla nejméně 5 mm. Po odpaření rozpouštědla z nanesených roztoku se pomocí injekční stříkačky nebo pipety vnese do žlábku vyvíjecí komory vhodné množství mobilní fáze, deska se do chromatografické komory umístí horizontálně a spojí se zařízením podle pokynů výrobce s mobilní fází. Je-li předepsáno, vyvíjení se započne simultánně z obou stran. Komora se uzavře a udržuje se při teplotě 20 °C až 25 °C. Deska se vyjme, když mobilní fáze dosáhne vzdálenosti předepsané v článku, vysuší se a chromatogram se deteguje předepsaným způsobem.
Pro dvojrozměrnou chromatografii se vrstva po prvním vyvíjení vysuší a provede se druhé vyvíjení ve směru kolmém na směr prvního vyvíjení.
Vizuální hodnocení
Zkouška totožnosti. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku se vizuálně porovnává s odpovídající skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku porovnáním barvy, velikosti a retenčního faktoru (R_F) obou skvrn.
Retenční faktor (R_F) je definován jako poměr vzdálenosti koncentračního vrcholu (obvykle střed skvrny) ke vzdálenosti čela mobilní fáze, měřeno od místa nanášení.
Ověření separační schopnosti pro zkoušky totožnosti. Obvykle je dostačující provedeni testu způsobilosti popsaného ve stati Zkoumadla (4.1.1). Pouze ve zvláštních případech může být v článku předepsáno další kritérium pro test způsobilosti.
Zkouška na příbuzné látky. Vedlejší skvrna (skvrny) na chromatogramu zkoušeného roztoku se vizuálně porovnává (porovnávají) s odpovídající(mi) skvrnou (skvrnami) na chromatogramu porovnávacího roztoku obsahujícího nečistotu (nečistoty) nebo se skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku připraveného ředěním zkoušeného roztoku.
Ověření separační schopnosti. Požadavky na ověření separační schopnosti jsou uvedeny v příslušném článku.
Ověření detekční schopnosti. Detekční schopnost je dostatečná, je-li skvrna nebo proužek na chromatogramu nejzředěnějšího porovnávacího roztoku zřetelně viditelná.
Kvantitativní stanovení
Požadavky na rozlišení a separaci jsou uvedeny v jednotlivých článcích.
Látky detegovatelné v ultrafialovém nebo denním světle separované tenkovrstvou chromatografií mohou být stanoveny přímo na desce za použití vhodného přístrojového vybavení. Deska se hodnotí měřením reflektance nebo transmitance dopadajícího světla, přičemž se pohybuje bud deska nebo měřicí zařízení. Podobně za použití vhodného optického systému muže byt měřena fluorescence. Látky obsahující radionuklidy mohou být kvantifikovaný třemi způsoby: buď přímým měřením radioaktivity podél celého chromatogramu (viz Radiofarmaca), nebo po rozstřihání desky na proužky měřením radioaktivity každého jednotlivého proužku za použiti vhodného detektoru, anebo po seškrabání stacionární fáze a rozpuštění ve vhodném scintilačním roztoku měřením jeho radioaktivity za použití kapalinového scintilačního detektoru.
Zařízení. Přístrojové vybavení pro přímé měření na desce se skládá:
- ze zařízení pro přesné umístění a reprodukovatelné dávkování objemu připravených roztoků na vrstvu,
- z mechanického zařízení pro pohyb desky nebo měřícího zařízení ve směru osy x nebo osy y,
- ze zapisovače a vhodného integrátoru nebo počítače,
- pro látky detegovatelné v ultrafialovém nebo denním světle: pro měření reflektance nebo transmitance fotometr se zdrojem světla, optické zařízení schopné generovat monochromatické světlo a fotoelektrický článek odpovídající citlivosti; pro měření fluorescence kromě toho monochromatický filtr pro vyčlenění určité spektrální oblasti vyzářeného světla,
- pro látky obsahující radionuklidy: vhodný detektor radioaktivity, u kterého musí byt ověřena oblast linearity.
Postup. Připraví se předepsaným způsobem zkoušený roztok, a je-li třeba, připraví se i porovnávací roztoky stanovované látky ve stejném rozpouštědle jako zkoušený roztok. Nanesou se stejné objemy všech připravených roztoků a chromatogram se vyvine.
Látky detegovatelné v ultrafialovém nebo denním světle: Připraví a nanesou se nejméně tři porovnávací roztoky, v nichž jsou koncentrace zkoušené látky v rozpětí jejího očekávaného obsahu ve zkoušeném roztoku (přibližně 80 %, 100 % a 120 %). Po skončeném vyvíjení se provede, je-li třeba, detekce předepsaným činidlem a zaznamená se reflektance, transmitance nebo fluorescence chromatogramů zkoušeného roztoku a porovnávacích roztoků. Naměřené hodnoty se použijí pro výpočet množství látky ve zkoušeném roztoku.
Látky obsahující radionuklidy: Připraví a nanese se zkoušený roztok, jehož koncentrace je přibližně 100 % očekávaného obsahu. Stanoví se celková radioaktivita a radioaktivita každého jednotlivého píku se vyjádří jako procento z celkového množství radioaktivity.
Není-li předepsáno jinak, lze výsledky stanovení hodnotit, jestliže rozlišení (R_s) mezi měřenými píky na chromatogramu je větší než 1,0.
Rozlišení (R_s) se vypočte ze vzorce:

R_{s} = \frac{1,18 \cdot (Z_{b} - Z_{a})}{b_{0,5 a} + b_{0,5 b}},

Z_{b} > Z_{a},

v němž značí:
Z_b, Z_a - vzdálenosti podél základní linie mezi bodem nanesení vzorku a kolmicemi spuštěnými z vrcholů dvou sousedních píků (mm),
b_0,5a, b_0,5b- šířky píků v polovině jejich výšky (mm).
Jestliže se limitní řada nečistot hodnotí fotometricky, je důležitým parametrem pro stanovení detekčního limitu poměr signálu k šumu (S/N).
Poměr signálu k šumu (S/N) se vypočítá ze vzorce:

\frac{S}{N} = \frac{2 H}{h},

v němž značí:
H - výšku píku odpovídajícího stanovované složce na chromatogramu získaném s předepsanou porovnávací látkou, měřenou z maxima píku k základně signálu sledovaného po dráze odpovídající 20násobku šířky píku v polovině jeho výšky,
h - maximální amplitudu šumu pozadí na chromatogramu kontrolního roztoku získaného při slepé zkoušce, sledovaného po dráze odpovídající 20násobku šířky píku v polovině jeho výšky na chromatogramu předepsané porovnávací látky a sledovaného v místě rovnoměrně situovaném okolo místa, kde by se tento pík nacházel.

2.2.41 Cirkulární dichroismus

Jako cirkulární dichroismus se označuje rozdíl absorbancí levotočivé a pravotočivě cirkulárně polarizovaného světla u opticky aktivní látky v oblasti jejího absorpčního pásu.
Přímé měření poskytuje střední algebraickou hodnotu:

Δ A = A_{L} - A_{R,}

ΔA - diferenční cirkulárně dichroická absorbance,
A_L - absorbance levotočivě cirkulárně polarizovaného světla,
A_R - absorbance pravotočivě cirkulárně polarizovaného světla.
Cirkulární dichroismus se vypočítá podle rovnice:

Δ ε = ε_{L} - ε_{R} = \frac{Δ A}{c \cdot l},

Δε - molární cirkulární dichroismus nebo molární diferenční dichroická absorptivita vyjádřená v litr.mol^-1.cm^-1,
ε _L- molární absorptivita (2.2.25) levotočivé cirkulárně polarizovaného světla,
ε _R - molární absorptivita pravotočivě cirkulárně polarizovaného světla,
c - koncentrace zkoušeného roztoku v mol.l^-1,
l - tloušťka vrstvy v cm.
K charakterizaci cirkulárního dichroismu se mohou používat také následující veličiny:
Faktor dissymetrie:

g = \frac{Δ ε}{ε},

ε - molární absorptivita (2.2.25).
Molární elipticita:
Některé typy přístrojů měří přímo hodnotu elipticity Θ, vyjádřenou ve stupních. Při použití těchto přístrojů může být molární elipticita vypočítána pomocí následující rovnice:

[Θ] = \frac{Θ . M}{c . l . 10}

[Θ] - molární elipticita vyjádřená ve stupních.cm².decimor^-1,
Θ - hodnota elipticity odečtená na přístroji,
M - relativní molekulová hmotnost zkoušené látky,
c - koncentrace zkoušeného roztoku v g.ml^-1,
l - tloušťka vrstvy v centimetrech.
Vzájemný vztah mezi molární elipticitou a molárním cirkulárním dichroismem udává následující rovnice:

[Θ] = 2,303 Δ ε \frac{4500}{π} \approx 3300 Δ ε .

Molární elipticita se často používá při analýze bílkovin a nukleových kyselin. V tomto případě se molární koncentrace vyjadřuje jako monomerní zbytek vypočítaný pomocí výrazu:

\frac{m o l e k u l o v á h m o t n o s t}{p o č e t a m i n o k y s e l i n} .

Střední relativní molekulová hmotnost monomerního zbytku je 100 až 120 (obvykle 115) pro bílkoviny a asi 330 pro nukleové kyseliny (ve formě sodných solí).
Zařízení. Zdrojem světla (S) je xenonová lampa; světlo prochází dvojitým monochromátorem (M) s křemennými hranoly (P₁, P₂).
Lineární světelný paprsek z prvního monochromátoru je štěpen na dvě složky, které jsou v druhém monochromátoru polarizovány v pravých úhlech. Výstupní štěrbina v monochromátoru eliminuje mimořádný paprsek.
Získané polarizované monochromatické světlo prochází opticky aktivním modulátorem (Cr); výsledkem je střídavé cirkulárně polarizované světlo.
Paprsek pak prochází zkoumaným vzorkem (C ) a dopadá na fotonásobič (PM) spojený se zesilovačem, který produkuje dva elektrické signály: jedním je stejnosměrný proud V_c a druhým střídavý proud s modulační frekvencí V_ac charakteristickou pro zkoušený vzorek. Fáze udává znaménko cirkulárního dichroismu. Poměr V_ac/ V_cje úměrný diferenční absorpci ΔA, která vytvořila signál. Dichrograf běžně pracuje v oblasti vlnových délek 170 nm až 800 nm.
Kalibrace přístroje.
Přesnost stupnice absorbance. 10,0 mg isoandrosteronu R se rozpustí v dioxanu R a zředí se stejným rozpouštědlem na 10,0 ml. Spektrum cirkulámího dichroismu roztoku se zaznamená v rozmezí vlnových délek 280 nm až 360 nm. V maximu při 304 nm hodnota Δε je +3,3.
Pro toto měření může být použit také roztok (1S)-(+)-10-kafrsulfonové kyseliny R.
Linearita modulace. 10,0 mg (1S)-(+)-10-kafrsulfonové kyseliny R se rozpustí ve vodě R a zředí se stejným rozpouštědlem na 10,0 ml. Přesná koncentrace kafrsulfonové kyseliny v roztoku se určí ultrafialovou spektrofotometrii (2.2.25) s použitím hodnoty specifické absorbance 1,49 při 285 nm.
Spektrum cirkulárního dichroismu se zaznamená mezi 185 nm a 340 nm. V maximu při 290,5 je hodnota Δε +2,2 až +2,5. V maximu při 192,5 nm je změřená hodnota Δε -4,3 až -5.
Pro kalibraci může být také použit (1S)-(+) nebo antipod (1R)-(-)-amonium-10-kafrsulfonat R.

Obr. 2.2.41-1 Optické schéma dichrografu

6.2.2 Jednotlivé léčivé přípravky

2.3 Zkoušky totožnosti

2.3.2 Totožnost mastných olejů tenkovrstvou chromatografií

Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vhodného oktadecylsilanizovaného silikagelu pro vysokoúčinnou tenkovrstvou chromatografii.
Zkoušený roztok. Není-li předepsáno jinak, rozpustí se asi 20 mg (1 kapka) mastného oleje ve 3 ml dichlormethanu R.
Porovnávací roztok. Rozpustí se asi 20 mg (1 kapka) oleje kukuřičného R ve 3 ml dichlormethanu R.
Na vrstvu se odděleně nanese po 1 μl každého roztoku a vyvíjí se dvakrát etherem R po dráze 0,5 cm. Pak se vyvíjí dvakrát směsí objemových dílů dichlormethanu R, kyseliny octové ledové R a acetonu R (20 + 40 + 50) po dráze 8 cm. Vrstva se usuší na vzduchu, postříká se roztokem kyseliny fosfomolybdenové R (100 g/l) v lihu 96% R, zahřívá se asi 3 min při 120 °C a pozoruje se v denním světle.
Na chromatogramu jsou charakteristické skvrny odpovídající obrázku 2.3.2-1.

Obr. 2.3.2-1 Charakteristické chromatogramy k určení totožnosti mastných olejů

1.	Arachidis oleum	6.	Sojae oleum
2.	Olivae oleum	7.	Helianthi oleum
3.	Sesami oleum	8.	Rapae oleum
4.	Maydis oleum	9.	Rapae oleum (sine acido erucico)
5.	Amygdalae oleum	10.	Tritici aestivi oleum

2.4 Limitní zkoušky

2.4.8 Těžké kovy

Tato metoda stanovení těžkých kovů se zařazuje na konec stati (2.4.8) publikované v Českém lékopisu 1997.
Metoda F
Zkoušený roztok. Předepsané množství zkoušené látky se převede do čisté suché 100ml dlouhohrdlé spalovací baňky (300ml baňka může být použita, pokud reakce nadměrně pění). Baňka se upevní tak, aby svírala úhel 45° a přidá se dostatečný objem směsi 8 ml kyseliny sírové R a 10 ml kyseliny dusičné R. Opatrně se zahřívá do začátku reakce, po jejím ukončení se postupně přidávají další podíly stejné směsi kyselin, po každém přidání se zahřívá, až je přidán celý objem 18 ml směsi kyselin. Zahřívá se intenzivněji dále a opatrně se vaří až do ztmavnutí roztoku. Ochladí se, přidají se 2 ml kyseliny dusičné R a opět se zahřívá do ztmavnutí roztoku. Zahřívá se, dokud po dalším přídavku kyseliny dusičné R směs již netmavne, pak se silně zahřívá, až se tvoří husté bílé dýmy. Ochladí se, opatrně se přidá 5 ml vody R, mírně se vaří, až se tvoří husté bílé dýmy a objem se zmenší na 2 ml až 3 ml. Ochladí se, opatrně se přidá 5 ml vody R a pozoruje se barva roztoku. Jestliže je roztok žlutý, opatrně se přidá 1 ml peroxidu vodíku koncentrovaného R a opět se odpařuje, až se tvoří husté bílé dýmy a objem se zmenší na 2 ml až 3 ml. Jestliže je roztok ještě žlutý, opakuje se přidání 5 ml vody R a 1 ml peroxidu vodíku koncentrovaného R, až je roztok bezbarvý. Ochladí se a opatrně se zředí asi na 25 ml vodou R.
Upraví se pH roztoku amoniakem 32% R (amoniak zředěný RS1 může být použit, pokud je žádoucí přiblížení tomuto specifickému rozsahu) na 3,0 až 4,0 za použití indikátorového papírku malého rozsahu pH jako vnějšího indikátoru, zředí se vodou R na 40 ml a promíchá se.
Přidají se 2 ml tlumivého roztoku o pH 3,5 a 1,2 ml zkoumadla thioacetamidového R, ihned se promíchá. Zředí se vodou R na 50 ml a promíchá se.
Porovnávací roztok. Připraví se současně a stejným způsobem za použití předepsaného objemu základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).
Po 2 min hnědé zbarvení zkoušeného roztoku není intenzivnější než zbarvení porovnávacího roztoku.

2.4.22 Cizí oleje v mastných olejích plynovou chromatografií

Cizí oleje se stanoví jako methylestery mastných kyselin přítomných ve zkoušených olejích.
Tato metoda není použitelná pro oleje obsahující acylglyceroly mastných kyselin s epoxy-, hydroepoxy-, cyklopropyl- a cyklopropenylovými skupinami nebo oleje s velkým podílem mastných kyselin s kratším řetězcem než 8 uhlíkových atomů nebo pro oleje s vyšším číslem kyselosti než 2,0.
Provede se plynová chromatografie (2.2.28).
Zkoušený roztok. Je-li v článku předepsáno, zkoušený olej se před methylací suší. Naváží se 1,0 g zkoušeného oleje do 25ml zabroušené baňky s kulatým dnem opatřené zpětným chladičem a upravené k zavádění plynu. Přidá se 10 ml methanolu bezvodého R, 0,2 ml roztoku hydroxidu draselného R (60 g/l) v methanolu R a za míchání se pod zpětným chladičem zahřívá k varu za současného probublávání dusíkem R rychlostí asi 50 ml/min. Když je roztok čirý (asi po 10 min), pokračuje se v zahřívání ještě 5 min. Baňka se ochladí pod tekoucí vodou a obsah se převede do dělicí nálevky. Vnitřek baňky se opláchne 5 ml heptanu R, který se přidá do dělicí nálevky a protřepe se. Přidá se 10 ml roztoku chloridu sodného R (200 g/l) a intenzivně se protřepe. Po rozdělení se organická vrstva převede do nádobky, vysuší se síranem sodným bezvodým R, nechá se stát a zfiltruje se.
Porovnávací roztok (a). Podle tabulky 2.4.22-1 se připraví 0,50 g směsi kalibračních látek, rozpustí se v heptanu R a zředí se jím na 50,0 ml.
Porovnávací roztok (b). 1,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí heptanem R na 10,0 ml.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- skleněné kolony nebo nerezové ocelové kolony délky 2 m až 3 m a vnitřního průměru 2 mm až 4 mm naplněné křemelinou pro plynovou chromatografii R (125 μm až 200 μm) impregnovanou 5 % až 15 % makrogolsukcinatu R nebo makrogoladipatu R,
- dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu s průtokovou rychlostí 25 ml/min,
- plamenoionizačního detektoru.
Teplota kolony se udržuje na 180 °C, teplota nástřikového prostoru a detektoru na 200 °C. Pokud je to nutné nebo předepsané, zvyšuje se teplota kolony rychlostí 5 °C/min ze 120 °C na 200 °C.
Chromatografický postup může být alternativně proveden za použití:
- skleněné nebo křemenné kapilární kolony (je dávána přednost koloně se stěnami pokrytými kapalnou fází) délky 10 m až 30 m a vnitřního průměru 0,2 mm až 0,8 mm, jejíž vnitřní povrch je pokryt vrstvou poly[(kyanpropyl)(methyl)][(fenyl)(methyl)]siloxanu R nebo makrogolu 20 000 R (tloušťky 0,1 μm až 0,5 μm) nebo jinou vhodnou stacionární fází,
- helia pro chromatografii R nebo vodíku pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 1,3 ml/min (pro kolonu o vnitřním průměru 0,32 mm),
- plamenoionizačního detektoru,
- dělicího poměru 1 : 100 nebo menšího, podle vnitřního průměru použité kolony (1 : 50 pro kolonu o vnitřním průměru 0,32 mm).
Teplota kolony se udržuje na 160 °C až 200 °C podle délky a typu použité kolony (pro kolonu délky 30 m pokrytou makrogolem 20 000 R, 200 °C), teplota nástřikového prostoru a detektoru se udržuje na 250 °C. Je-li nutno nebo předepsáno, zvyšuje se teplota kolony rychlostí 3 °C/min ze 170 °C na 230 °C (pro kolonu s makrogolem 20 000 R).
Nastříkne se 0,5 μl porovnávacího roztoku (a). Upraví se citlivost systému tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu byla 50 % až 70 % celé stupnice zapisovače.
Určí se retenční časy jednotlivých mastných kyselin. Nastříkne se 1 μl porovnávacího roztoku (b) a zkontroluje se poměr signálu k šumu pro pík odpovídající methylmyristatu.
Nastříkne se 0,5 μl až 1,0 μl zkoušeného roztoku. Zaznamenávají se chromatogramy po dobu odpovídající 2,5násobku retenčního času methyloleatu. Chromatogramy se vyhodnotí, jak je uvedeno níže.
Zkoušku lze hodnotit, jestliže:
- na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je počet teoretických pater (n) (2.2.28), počítáno pro pík odpovídající methylstearatu, nejméně 2000 pro náplňové kolony a 30 000 pro kapilární kolony,
- na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je rozlišení (R_s) (2.2.28) mezi píky odpovídajícími methyloleatu a methylstearatu nejméně 1,25 pro náplňové a 1,8 pro kapilární kolony a je-li předepsáno v článku, rozlišení mezi píky odpovídajícími methyllinolenatu (C_18:3) a methylarachidatu (C_20:0) nebo methylarachidatu (C_20:0) a methylikosenoatu (C_20:1) nejméně 1,8,
- na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je poměr signálu k šumu (2.2.28) pro pík odpovídající methylmyristatu nejméně 5.
Vyhodnocení chromatogramů
Je třeba se vyvarovat pracovních podmínek, které umožňují vznik maskovaných píků (přítomnost složek s malými rozdíly v retenčních časech, jako u kyseliny linolenové a kyseliny arachidové).
Kvalitativní analýza. Sestrojí se kalibrační křivky za použití chromatogramů získaného s kalibračními látkami (porovnávací roztok (a)) a informací v tabulce 2.4.22-1:
Tab. 2.4.22-1 Kalibrační látky^*

Směs následujících látek	Ekvivalentní délka řetězce^**	Složení v %
Směs následujících látek	Ekvivalentní délka řetězce^**	Izometrické podmínky	Lineární teplotní program
Methyllaurat R	12,0	5	10
Methylmyristat R	14,0	5	15
Methylpalmitat R	16,0	10	15
Methylstearat R	18,0	20	20
Methylarachidat R	20,0	40	20
Methyloleat R	18,6	20	20

^* Pro GC s kapilární kolonou a s nástřikem s děličem se doporučuje, aby složka s nejdelším řetězcem ze zkoušené směsi byla přidána ke kalibrační směsi.
^** Tato hodnota, která má být počítána pomocí kalibrační křivky, je uvedena jako příklad pro kolonu s makrogolsukcinatem R.
Kvantitativní analýza. Používá se metoda vnitřní normalizace, při níž součet ploch všech píků na chromatogramu, kromě píku rozpouštědla, je brán jako 100 %. Doporučuje se použití elektronického integrátoru. Obsah složky je vypočítán jako procentuální podíl plochy odpovídajícího píku z celkového součtu ploch všech píků. Nepřihlíží se k pikům, jejichž plocha je menší než 0,05 % celkové plochy.

2.4.24 Totožnost a kontrola zbytkových rozpouštědel

Zkušební postupy popsané v této obecné metodě mohou být použity:
Třídy zbytkových rozpouštědel jsou uvedeny v obecné kapitole 5.4.
Jsou popsána 3 rozpouštědla pro přípravu vzorků a použité podmínky pro head space nástřik plynných vzorků do chromatografického systému. Jsou předepsány 2 chromatograťické systémy, ale přednost je dávána systému A, zatímco systém B je normálně používán pro potvrzení totožnosti. Výběr postupu pro přípravu vzorku závisí na rozpustnosti zkoušené látky a v některých případech i analyzovaných zbytkových rozpouštědlech.
Za popsaných podmínek head space nástřiku nebývají běžně detegována tato rozpouštědla: formamid, 2-ethoxyethanol, 2-methoxyethanol, ethylenglykol, N-methylpyrrolidon a sulfolan. Pro kontrolu těchto zbytkových rozpouštědel by měly být používány jiné vhodné postupy.
Je-li postup zkoušky používán pro kvantitativní stanovení zbytkových rozpouštědel v látce, musí být validován.
Pracovní postup
Provede se plynová chromatografie se statickým head space nástřikem (2.2.28).
Příprava vzorku 1. Je určena pro stanovení zbytkových rozpouštědel v látkách ve vodě rozpustných.
Roztok vzorku (1). 0,200 g zkoušené látky se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 20,0 ml.
Příprava vzorku 2. Je určena pro stanovení zbytkových rozpouštědel v látkách ve vodě nerozpustných.
Roztok vzorku (2). 0,200 g zkoušené látky se rozpustí v N,N-dimethyIformamidu R (DMF) a zředí se jím na 20,0 ml.
Příprava vzorku 3. Je určena pro stanovení N,N-dimethylacetamidu a/nebo N,N-dimethylformamidu, je-li známo nebo lze předpokládat, že jeden z nich nebo oba budou přítomny ve zkoušené látce.
Roztok vzorku (3). 0,200 g zkoušené látky se rozpustí v 1,3-dimethyl-2-imidazolidinonu R (DMI) a zředí se jím na 20,0 ml.
V některých případech není pro přípravu vzorku vhodný ani jeden z uvedených postupů, v takovýchto případech musí být prokázáno, že rozpouštědlo použité pro přípravu vzorku a podmínky statické head space analýzy jsou vhodné.
Roztok rozpouštědla (a). 1,0 ml roztoku zbytkového rozpouštědla třídy 1 CRL se zředí vodou R na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 10,0 ml.
Roztok rozpouštědla (b). Vhodná množství zbytkových rozpouštědel třídy 2 se rozpustí v dimelthylsulfoxidu R a zředí se vodou R na 100,0 ml. Zředění je takové, aby koncentrace odpovídala 1/20 limitní hodnoty uvedené v tabulce 2.
Roztok rozpouštědla (c). 1,00 g rozpouštědla nebo rozpouštědel přítomných ve zkoušené látce se rozpustí v dimethylsulfoxidu R nebo ve vodě R, je-li to vhodné, a zředí se vodou R na 100,0 ml. Zředí se na koncentraci odpovídající 1/20 limitní hodnoty uvedené v tabulce 1 nebo 2.
Kontrolní roztok. Připraví se jako roztok rozpouštědla (c), ale bez přídavku rozpouštědla (rozpouštědel) použitých k ověření nepřítomnosti interferujících píků.
Zkoušený roztok. 5,0 ml roztoku vzorku a 1,0 ml kontrolního roztoku se odměří do lahvičky pro nástřik vzorku.
Porovnávací roztok (a) (Třída 1). 1,0 ml roztoku rozpouštědla (a) a 5,0 ml vhodného rozpouštědla se odměří do lahvičky pro nástřik vzorku.
Porovnávací roztok (a₁) (Třída 1). 5,0 ml roztoku vzorku a 1,0 ml roztoku rozpouštědla (a) se odměří do lahvičky pro nástřik vzorku.
Porovnávací roztok (b) (Třída 2). 1,0 ml roztoku rozpouštědla (b) a 5,0 ml vhodného rozpouštědla se odměří do lahvičky pro nástřik vzorku.
Porovnávací roztok (c). 5,0 ml roztoku vzorku a 1,0 ml roztoku rozpouštědla (c) se odměří do lahvičky pro nástřik vzorku.
Porovnávací roztok (d). 1,0 ml kontrolního roztoku a 5,0 ml vhodného rozpouštědla se odměří do lahvičky pro nástřik vzorku.
Lahvičky se vzduchotěsně uzavřou pryžovým šeptem pokrytým polytetrafluorethylenem a zajistí hliníkovým uzávěrem. Roztok se zhomogenizuje protřepáním.
Mohou být použity tyto podmínky statického head space nástřiku:

Pracovní parametry	Postup pro přípravu vzorku
	1	2	3
Teplota pro ustavení rovnováhy (°C)	80	105	80
Doba ustavování rovnováhy (min)	60	45	45
Teplota přechodové kapiláry (°C)	85	110	105

Nosný plyn: Dusík pro chromatografii R nebo helium pro chromatografii R, při vhodném tlaku

Doba tlakování (s)	30	30	30
Nastřikovaný objem (ml)	1	1	1

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
Systém A
- křemenné kapilární kolony délky 30 m a vnitřního průměru 0,32 mm nebo 0,53 mm s vnitřní stěnou pokrytou zesíťovanými 6 % polykyanpropylfenylsiloxanu R a 94 % polydimethylsiloxanu R (tlouštka filmu: 1,8 μm nebo 3 μm),
- dusíku pro chromatografii R nebo helia pro chromatografii R jako nosného plynu při lineární průtokové rychlosti asi 35 cm/s a dělicím poměru 1 : 5,
- plamenoionizačního detektoru (může být použit též hmotnostní spektrometr nebo detektor elektronového záchytu pro chlorovaná zbytková rozpouštědla třídy 1).
Teplota kolony se udržuje na 40 °C po dobu 20 min, potom se zvyšuje rychlostí 10 °C/min na 240 °C, při níž se udržuje 20 min, teplota nástřikového prostoru se udržuje na 140 °C a teplota detektoru na 250 °C.
Dochází-li k interferenci stanovovaných rozpouštědel s matricí, použije se:
Systém B
- křemenné kapilární kolony délky 30 m a vnitřního průměru 0,32 mm nebo 0,53 mm s vnitřní stěnou pokrytou makrogolem 20 000 R (tlouštka filmu: 0,25 μm),
- dusíku pro chromatografii R nebo helia pro chromatografii R jako nosného plynu při lineární průtokové rychlosti asi 35 cm/s a dělicím poměru 1 : 5,
- plamenoionizačního detektoru (může být použit též hmotnostní spektrometr detektor nebo detektor elektronového záchytu pro chlorovaná zbytková rozpouštědla třídy 1).
Teplota kolony se udržuje na 50 °C po dobu 20 min, potom se zvyšuje rychlostí 6 °C/min na 165 °C, při níž se udržuje 20 min, teplota nástřikového prostoru se udržuje na 140 °C a teplota detektoru na 250 °C.
Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (a) na kolonu popsanou v systému A a zaznamená se chromatogram za takových podmínek, aby mohl být stanoven poměr signálu k šumu pro 1,1,1-trichlorethan. Tento poměr musí být nejméně 5. Typický chromatogram je ukázán na obrázku 2.4.24-1.
Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (a₁) na kolonu popsanou v systému A. Píky odpovídající zbytkovým rozpouštědlům třídy 1 musí být ještě detegovatelné.
Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (b) na kolonu popsanou v systému A a zaznamená se chromatogram za takových podmínek, aby mohlo být určeno rozlišení mezi píky odpovídajícími acetonitrilu a dichlormethanu. Systém je vhodný, jestliže získaný chromatogram je podobný chromatogramu na obrázku 2.4.24-2 a rozlišení mezi píky acetonitrilu a dichlormethanu je nejméně 1,0.
Nastříkne se 1 ml plynné fáze zkoušeného roztoku na kolonu popsanou v systému A. Jestliže na získaném chromatogramu není žádný pík odpovídající jednomu z píků zbytkových rozpouštědel na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) nebo (b), pak zkoušená látka vyhovuje požadavkům zkoušky. Jestliže kterýkoliv pík na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá některému z píků zbytkových rozpouštědel na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) nebo (b), musí být použit systém B.
Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (a) na kolonu popsanou v systému B a zaznamená se chromatogram za takových podmínek, aby mohl být stanoven poměr signálu k šumu pro benzen. Tento poměr musí být nejméně 5. Typický chromatogram je ukázán na obrázku 2.4.24-3.
Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (a₁) na kolonu popsanou v systému B. Píky odpovídající zbytkovým rozpouštědlům třídy 1 musí být ještě detegovatelné.
Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (b) na kolonu popsanou v systému B a zaznamená se chromatogram za takových podmínek, aby mohlo být určeno rozlišení mezi píky odpovídajícími acetonitrilu a trichlorethylenu. Systém je vhodný, jestliže získaný chromatogram je podobný chromatogramu na obrázku 2.4.24-4 a rozlišení mezi píky acetonitrilu a trichlorethylenu je nejméně 1,0.
Nastříkne se 1 ml plynné fáze zkoušeného roztoku na kolonu popsanou v systému B. Jestliže na získaném chromatogramu není žádný pík odpovídající jednomu z píků zbytkových rozpouštědel na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) nebo (b), pak zkoušená látka vyhovuje požadavkům zkoušky. Jestliže kterýkoliv pík na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá některému z píků zbytkových rozpouštědel na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) nebo (b) a potvrzuje závěr zkoušky za použití systému A, postupuje se takto:
Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (c) na kolonu popsanou pro systém A nebo systém B. Je-li nutné, nastaví se citlivost systému tak, aby výška píku odpovídajícího určovanému zbytkovému rozpouštědlu (rozpouštědlům) byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.
Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (d) na kolonu. Nesmí být pozorovatelný žádný interferující pík.
Nastříkne se 1 ml plynné fáze zkoušeného roztoku a 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (c) na kolonu. Tyto nástřiky se opakují ještě dvakrát.

Obr. 2.4.24-1 Typický chromatogram rozpouštědel třídy 1 za použití podmínek popsaných pro systém A a Postup 1. Plamenoionizační detektor.
4: benzen; 10: chlorid uhličitý; 14: 1,2-dichlorethan; 15: 1,1-dichlorethylen; 52: 1,1,1- trichlorethan.

Obr. 2.4.24-2 Chromatogram rozpouštědel třídy 2 za použití podmínek popsaných pro systém A a Postup 1. Plamenoionizační detektor.
3: acetonitril; 11: chloroform; 13: cyklohexan; 16a: cis-1,2-dichlorethylen; 17: dichlormethan; 29: hexan; 30: 2-hexanon; 34: methanol; 49: pyridin; 51: toluen; 53: 1,1,2-trichlorethylen; 54: xylen ortho, meta, para; 58: chlorbenzen; 61: tetralin; 62: methylcyklohexan; 63: nitromethan; 64: 1,2-dimethoxyethan, DMSO dimethylsulfoxid.

Obr. 2.4.24-3 Chromatogram zbytkových rozpouštědel třídy 1 za použití podmínek popsaných pro systém B a Postup 1. Plamenoionizační detektor.
4: benzen; 10: chlorid uhličitý; 14: 1,2-dichlorethan; 15: 1,1-dichlorethylen; 52: 1,1,1-trichlorethan.

Obr. 2.4.24-4 Typický chromatogram zbytkových rozpouštědel třídy 2 za použití podmínek popsaných pro systém B a Postup 1. Plamenoionizační detektor.
3: acetonitril; 11: chloroform; 13: cyklohexan; 16a: cis-1,2-dichlorethylen; 17: dichlormethan; 23: 1,4-dioxan; 29: hexan; 30: 2-hexanon; 34: methanol; 49: pyridin; 51: toluen; 53: 1,1,2-trichlorethylen; 54: xylen, ortho, meta, para; 58: chlorbenzen; 61: tetralin; 62: methylcyklohexan; 63: nitromethan; 64: 1,2-dimethoxyethan.
Průměrná hodnota plochy píku zbytkového rozpouštědla (rozpouštědel) na chromatogramu zkoušeného roztoku nesmí být větší než polovina průměrné hodnoty plochy píku odpovídajícího zbytkového rozpouštědla (rozpouštědel) na chromatogramu porovnávacího roztoku (c). Zkoušku lze hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka rozdílů ploch píků analytu získaných ze tří párů opakovaných nástřiků porovnávacího roztoku (a) a zkoušeného roztoku je nejvýše 15 %.
Průběhový diagram postupu je ukázán na obrázku 2.4.24-5.
Jsou-li zbytková rozpouštědla (třída 2 nebo třída 3) přítomna v koncentracích 0,1 % a větších, může být jejich obsah stanovován metodou standardního přídavku.

Obr. 2.4.24-5 Průběhový diagram pro identifikaci zbytkových rozpouštědel a aplikaci limitní zkoušky

2.4.26 N,N-Dimethylanilin

a) za izotermických podmínek vynesením logaritmů redukovaných retenčních časů jako funkce počtu uhlíkových atomů mastné kyseliny; identifikují se píky pomocí takto získané přímky a „ekvivalentní délky řetězce“ pro různé píky. Kalibrační křivka nasycených kyselin je přímka. Logaritmy redukovaných retenčních časů nenasycených kyselin jsou umístěny na této přímce v bodech odpovídajících necelým číslům, která se nazývají „ekvivalentní délky řetězce“,

b) za podmínek lineárního teplotního programu vynesením retenčních časů jako funkce počtu uhlíkových atomů mastných kyselin; určení totožnosti se provede pomocí kalibrační křivky.

A. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití N,N-diethylanilinu R jako vnitřního standardu.
Roztok vnitřního standardu. 50 mg N,N-diethylanilinu R se rozpustí ve 4 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a zředí se vodou R na 50 ml. 1 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 100 ml. Zkoušený roztok. 0,50 g se rozpustí ve zkumavce se zabroušenou zátkou ve 30,0 ml vody R. Přidá se 1,0 ml roztoku vnitřního standardu. Teplota roztoku se upraví na 26 °C až 28 °C. Přidá se 1,0 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS a míchá se do úplného rozpuštění. Přidají se 2,0 ml trimethylpentanu R. Třepe se 2 min a vrstvy se nechají oddělit. Použije se horní vrstva.
Porovnávací roztok. 50,0 mg N,N-dimethylanilinu R se rozpustí ve 4,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a zředí se vodou R na 50,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 30,0 ml. Přidá se 1,0 ml roztoku vnitřního standardu a 1,0 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS. Přidají se 2,0 ml trimethylpentanu R. Třepe se 2 min a vrstvy se nechají oddělit. Použije se horní vrstva.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- křemenné kapilární kolony délky 25 m a vnitřního průměru 0,32 mm s vnitřní stěnou pokrytou filmem síťovaného polyfenylmethylsiloxanu R (tlouštka filmu 0,52 μm),
- helia pro chromatografií R jako nosného plynu s dělicím poměrem 1 : 20, vstupním tlakem na koloně 50 kPa a průtokem na děliči 20 ml/min,
- plamenoionizačního detektoru,
- vstřikovací trubice se skládá z kolony dlouhé asi 1 cm naplněné křemelinou pro plynovou chro matografii R impregnovanou 10 % polydimethylsiloxanu R.
Teplota kolony se udržuje 5 min na 150 °C, pak se zvyšuje rychlostí 20 °C/min na 275 °C a při této teplotě se udržuje 3 min, teplota nástřikového prostoru se udržuje na 220 °C a teplota detektoru na 300 °C.
Retenční časy jsou: pro N,N-dimethylanilin asi 3,6 min a pro N,N-diethylanilin asi 5,0 min.
Nastřikuje se 1 μl zkoušeného roztoku a 1 μl porovnávacího roztoku.

B. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití natalenu R jako vnitřního standardu.
Roztok vnitřního standardu. 50 mg naftalenu R se rozpustí v cyklohexanu R a zředí se jím na 50 ml. 5 ml tohoto roztoku se zředí cyklohexanem R na 100 ml.
Zkoušený roztok. K 1,00 g zkoušené látky se přidá ve zkumavce se zabroušenou zátkou 5 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS a 1,0 ml roztoku vnitřního standardu. Zkumavka se uzavře a intenzivně třepe 1 min. Je-li nutno, odstředí se. Použije se horní vrstva.
Porovnávací roztok. K 50,0 mg N,N-dimethylanilinu R se přidají 2 ml kyseliny chlorovodíkové R a 20 ml vody R, třepe se do rozpuštění a zředí se vodou R na 50,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 250,0 ml. K 1,0 ml se ve zkumavce se zabroušenou zátkou přidá 5 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS a 1,0 ml roztoku vnitřního standardu. Zkumavka se uzavře a intenzivně třepe 1 min. Je-li nutno, odstředí se. Použije se horní vrstva.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- skleněné kolony délky 2 m a vnitřního průměru 2 mm naplněné křemelinou silanizovanou pro plynovou chromatografii R impregnovanou 3 % polyfenylmethylsiloxanu R,
- dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 30 ml/min,
- plamenoionizačního detektoru.
Teplota kolony se udržuje na 120 °C, teplota nástřikového prostoru a detektoru na 150 °C.
Nastřikuje se 1 μl zkoušeného roztoku a 1 μl porovnávacího roztoku.

1. Pro určení totožnosti většiny zbytkových rozpouštědel třídy 1 a třídy 2 v léčivých látkách a pomocných látkách, nebo léčivých přípravcích, nejsou-li zbytková rozpouštědla známa.

2. Jako limitní zkouška pro rozpouštědla třídy 1 a třídy 2 přítomná v léčivých látkách a pomocných látkách nebo léčivých přípravcích.

3. Pro kvantifikaci rozpouštědel třídy 2, jsou-li limitní hodnoty vyšší než 1000 μg/g (0,1 %), nebo třídy 3, je-li požadována kvantifikace.

2.5. Stanovení obsahu

2.5.5 Číslo peroxidové

Číslo peroxidové I_P udává množství aktivního kyslíku v milimolech obsažené v peroxidické formě v 1000 g látky, stanoví se metodami popsanými níže.
Jestliže není předepsáno jinak, použije se metoda A. Každá změna metody A na metodu B by měla být validována.
Metoda A
5,00 g zkoušené látky (m) se převede do 250ml kuželové baňky se zabroušenou skleněnou zátkou. Přidá se 30 ml směsi objemových dílů kyseliny octově ledové R a chloroformu R (3 + 2) a třepe se do rozpuštění látky. Potom se přidá 0,5 ml jodidu draselného nasyceného RS, promíchá se a přesně za 1 min se přidá 30 ml vody R. Titruje se thiosíranem sodným 0,01 mol/l VS, který se pomalu přidává za rovnoměrného míchání do změny žlutého zbarvení na téměř bezbarvé. Potom se přidá 5 ml škrobu RS a pokračuje se v titraci přidáváním thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS po kapkách a za stálého míchání do odbarvení. Současně se za stejných podmínek provede slepá zkouška, při níž spotřeba thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS není vyšší než 0,10 ml.
Číslo peroxidové se vypočítá podle vzorce:

I_{p} = \frac{10 \cdot (n_{1} - n_{2})}{m},

v němž značí:
n₁ - spotřebu thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS při titraci v ml,
n₂ - spotřebu thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS při slepé zkoušce v ml,
m - navážku zkoušené látky v g.
Metoda B
Postup se provede za chránění před aktinickým světlem.
Předepsané množství zkoušené látky (m), viz tabulka 2.5.5-1, se převede do kuželovité baňky opatřené zátkou. Přidá se 50 ml směsi objemových dílů trimethylpentanu R a kyseliny octové ledové R (2 + 3) a míchá se do rozpuštění zkoušené látky. Pipetou o vhodném objemu se přidá 0,5 ml jodidu draselného nasyceného RS, baňka se uzavře a promíchá se. Roztok se nechá stát 1 min ± 1 s, nejméně třikrát se důkladně protřepe a potom se přidá 30 ml vody R.
Tab. 2.5.5-1

Předpokládané číslo peroxidové	Navážka zkoušené látky (g)
0 až 12	2,00 až 5,00
12 až 20	1,20 až 2,00
20 až 30	0,80 až 1,20
30 až 50	0,500 až 0,800
50 až 90	0,300 až 0,500

Roztok se titruje thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS, přidává se postupně za stálého intenzivního míchání do změny žlutého zbarvení na téměř bezbarvé. Přidá se asi 0,5 ml škrobu RS1 a pokračuje se v titraci za stálého míchání zvláště v blízkosti bodu ekvivalence, aby se uvolnil všechen jod z vrstvy rozpouštědla. Roztok thiosíranu sodného se přidává po kapkách až do odbarvení.
Pokud se při titraci spotřebuje méně než 0,5 ml thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS, opakuje se stanovení za použití thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS za stálého intenzivního míchám.
Poznámka. K 15 s až 30 s zpoždění při neutralizaci škrobového indikátora dochází pro peroxidové číslo 70 a vyšší, trimethylpentan má sklon pěnit na povrchu vodného prostředí a v tomto případě je třeba přiměřeně míchat rozpouštědlo a odměrný roztok, až do uvolnění poslední stopy jodu. Doporučuje se použít thiosíran sodný 0,01 mol/l VS pro peroxidové číslo nižší než 150. Může se přidat malé množství (0,5 % až 1,0 %) vyšších HLB emulgátorů k reakční směsi, aby se zpomalilo dělení fází a zkrátilo se tak zpoždění při uvolnění jodu.
Provede se slepá zkouška. Jestliže spotřeba titračního činidla při slepé zkoušce je vyšší než 0,1 ml, odstraní se nečistoty činidel a opakuje se stanovení.
Číslo peroxidové se vypočítá podle vzorce:

I_{p} = \frac{1000 \cdot (V_{1} - V_{0}) \cdot c}{m},

v němž značí:
c - koncentraci thiosíranu sodného v mol/l,
V₁ - spotřebu thiosíranu sodného při titraci v ml,
V₀ - spotřebu thiosíranu sodného při slepé zkoušce v ml,
m - navážku zkoušené látky v g.

2.5.31 Ribosa v polysacharidových vakcínách

Zkoušený roztok. Použije se odměrná baňka vhodného objemu pro přípravu roztoku přípravku obsahujícího asi 5 mg suchého polysacharidu v mililitru. Do této baňky se kvantitativně přenese obsah nádobky a zředí se vodou R na potřebný objem. Dále se roztok zředí tak, aby objemy použité při zkoušce obsahovaly 2,5 μg až 25 μg ribosy. Zředěný roztok se převede po 0,20 ml do tří zkumavek a po 0,40 ml do dalších tří zkumavek.
Porovnávací roztoky. 25 mg ribosy R se rozpustí ve vodě R a zředí se ji na 100,0 ml (základní roztok obsahující 0,25 g/l ribosy). Bezprostředné před použitím se zředí 1 ml základního roztoku vodou R na 10,0 ml (pracovní zředění: 25 mg/l ribosy). Do šesti zkumavek se přenese 0,10 ml, 0,20 ml, 0,40 ml, 0,60 ml, 0,80 ml a 1,0 ml tohoto roztoku.
Slepá zkouška. Použijí se 2 ml vody R.
Postup. Obsah každé zkumavky se doplní vodou R na objem 2 ml, protřepe se a do každé zkumavky se přidají 2 ml roztoku chloridu železitého R (0,5 g/l) v kyselině chlorovodíkové R. Po protřepání se přidá 0,2 ml roztoku orcinolu R (100 g/l) v ethanolu R. Zkumavky se vloží na 20 min do vodní lázně a potom se ochladí v ledové vodě. Měří se absorbance (2.2.25) každého roztoku při 670 nm proti kontrolnímu roztoku získanému při slepé zkoušce. Sestrojí se kalibrační křivka ze zjištěných absorbancí šesti porovnávacích roztoků a odpovídajících obsahu ribosy a odečte se množství ribosy pro každé zředění zkoušeného roztoku. Ze tří získaných hodnot pro každý objem se vypočítá průměr.

2.5.32 Coulometrická titrace, mikrometoda

Princip metody

Coulometrická titrace vody je založena na kvantitativní reakci vody s oxidem siřičitým a jodem v bezvodém prostředí za přítomnosti zásady s dostatečnou tlumicí kapacitou. Na rozdíl od odměrné metody uvedené ve stati (2.5.12) je jod produkován elektrochemicky v reakční nádobce oxidací jodidu. Jod generovaný na anodě reaguje okamžitě s vodou a oxidem siřičitým, které jsou obsaženy v reakční nádobce. Množství vody v látce je přímo úměrné množství elektrického náboje spotřebovaného do bodu ekvivalence titrace. Když všechna voda v nádobce (stanovené látce) zreagovala, je dosaženo bodu ekvivalence a objeví se nadbytek jodu. 1 mol jodu odpovídá 1 molu vody, množství elektrického náboje 10,71 C odpovídá 1 mg vody.
Vlhkost ze systému je odstraněna předchozí elektrolýzou. Jednotlivá stanovení se mohou provádět po sobě ve stejném roztoku zkoumadel za následujících podmínek:
- každá složka zkoušené směsi je kompatibilní s dalšími složkami,
- neprobíhají žádné další reakce,
- objem a vodní kapacita elektrolytového zkoumadla jsou dostatečné.
Coulometrická titrace je omezena na stanovení malých množství vody, nejlépe v rozmezí 10 μg až 10 mg.
Přesnost a správnost metody jsou podmíněny především tím, jak účinně lze vyloučit ze systému atmosférickou vlhkost. To lze monitorovat měřením velikosti posunu základní linie.
Zařízení
Zařízení se skládá z reakční nádobky, elektrod a elektromagnetické míchačky. Nádobka je tvořena větším prostorem anodovým a menším prostorem katodovým. V závislosti na tvaru elektrod mohou být oba prostory odděleny membránou a v každém prostoru je platinová elektroda. Kapalné nebo rozpuštěné vzorky jsou vnášeny přes septum injekční stříkačky. Alternativně může být použita technika odpařování, při níž je vzorek zahříván ve zkumavce (sušárně) a voda je odpařována a vedena do reakční nádobky proudem suchého inertního plynu. Obecně je třeba se vyhnout vnášení pevných vzorků do reakční nádobky. Avšak, je-li to nezbytné, provádí se to utěsněným vstupem. Je třeba učinit vhodná opatření, aby se zabránilo zanesení vlhkosti ze vzduchu, např. pracuje se v boxu opatřeném rukavicemi v atmosféře suchého inertního plynu. Postup analýzy je řízen vhodným elektronickým zařízením, které též zobrazuje výsledek.
Pracovní postup
Obě části nádobky se naplní elektrolytovým zkoumadlem pro mikrostanovení vody R podle návodu výrobce a provede se coulometrická titrace do trvalého konečného bodu. Předepsané množství zkoušené látky se vnese do reakční nádobky, 30 s se míchá, pokud není v článku uvedeno jinak, a znovu se titruje do trvalého konečného bodu. V případě, že je použito sušárny, předepsané množství vzorku se převede do zkumavky a zahřívá se. Po odpaření vody ze vzorku do reakční nádobky se začne titrovat. Hodnota se odečte z výstupu přístroje a vypočítá se, je-li to nutné, procentuální obsah nebo množství vody ve zkoušené látce. Pokud je to vhodné podle druhu vzorku a přípravku, provede se slepá zkouška.
Ověření správnosti
Mezi dvě po sobě následující titrace vzorku se vnese do nádobky přesně zvážené množství vody řádově stejné velikosti, jako je množství vody ve vzorku, buď jako voda R, nebo ve formě základního roztoku pro mikrostanovení vody a provede se coulometrická titrace. Výtěžnost se pohybuje v rozmezí 97,5 % až 102,5 % pro přidání 1000 μg H₂O, v rozmezí 90,0 % až 110,0 % pro přidání 100 μg H₂O.

2.6 Biologické zkoušky

2.6.1 Zkoušky na sterilitu ¹)

Tato zkouška se provádí s léčivými látkami, pomocnými látkami, léčivými přípravky a zdravotnickými prostředky, u nichž je lékopisem předepsána sterilita. Vyhovující výsledek však pouze udává, že zkoušený vzorek není znečištěn žádným mikrobem zjistitelným v podmínkách zkoušky. Seznam dalších požadavků k prokázání sterility celé šarže je uveden na konci tohoto textu.
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění
Zkouška na sterilitu se provádí za aseptických podmínek, např. použitím laminárního boxu o třídě čistoty A umístěného v místnosti vyhovující třídě čistoty B, nebo v izolátoru. Opatření přijatá proti kontaminaci nepůsobí na mikroorganismy, které se mají při zkoušce zjistit. Pracovní podmínky, v nichž je zkouška prováděna, se pravidelně monitorují vhodným vzorkováním pracovního prostředí a provádějí se vhodné kontroly, jak jsou popsány v příslušných směrnicích Evropského společenství a v navazujících Notes for guidance on GMP.
Živné půdy
Následující živné půdy byly shledány vhodnými pro zkoušku na sterilitu. Thioglykolanová půda je především určena pro kultivaci anaerobních bakterií, ale umožní zjistit také aerobní bakterie. Půda z hydrolyzátů soji a kaseinu je především určena pro kultivaci aerobních bakterií, ale je vhodná i pro kultivaci hub. Mohou se používat i jiné živné půdy, pokud prokazatelně podporují růst široké řady mikroorganismů.
Thioglykolanová půda

L-cystin	0,5 g
agar granulovaný (obsah vlhkosti do 15 %)	0,75 g
chlorid sodný	2,5 g
glukosa monohydrát	5,5 g
kvasničný výtažek (rozpustný ve vodě)	5,0 g
pankreatický hydrolyzát kaseinu	15,0 g
thioglykolan sodný nebo	0,5 g
kyselina thioglykolová	0,3 ml
roztok sodné soli resazurinu (1 g/l) čerstvě připravený	1,0 ml
voda R	1000 ml
pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,1 ± 0,2.

Smíchá se L-cystin, agar, chlorid sodný, glukosa, kvasničný výtažek a pankreaticky hydrolyzát kaseinu s vodou a zahřívá se, dokud se nerozpustí. Přidá se thioglykolan sodný nebo kyselina thioglykolová do roztoku a přidá se, je-li třeba, hydroxid sodný 1 mol/l RS tak, aby roztok po sterilizaci měl pH 7,1 ± 0,2. Je-li zapotřebí filtrace, zahřeje se roztok téměř až k varu a za tepla se filtruje navlhčeným filtračním papírem. Potom se přidá roztok sodné soli resazurinu, promíchá se a rozplní do vhodných nádob, které zajistí takový poměr povrchu k výšce sloupce půdy, aby se do konce inkubační doby nezměnilo pohlcováním kyslíku barevně víc, než horní třetina půdy. Používá se validovaný postup sterilizace. Uchovává se při teplotě 2 °C až 25 °C ve sterilních, utěsněných nádobách, není-li určen a k okamžitému použití. Je-li třeba, regeneruje se půda těsně před použitím, např. 20 min zahříváním ve vodní lázni a rychlým ochlazením. Nesterilní vzduch se přitom nesmí dostat do nádoby.
Půda z hydrolyzátu sóji a kaseinu

pankreatický hydrolyzát kaseinu	17,0 g
papainový hydrolyzát sóji	3,0 g
chlorid sodný	5,0 g
hydrogenfosforečnan draselný	2,5 g
glukosa monohydrát	2,5 g
voda R	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2.
Pevné látky se za mírného zahřátí rozpustí ve vodě a roztok se ochladí na pokojovou teplotu. V případě potřeby se přidá hydroxid sodný 1 mol/l RS tak, aby roztok měl po sterilizaci pH 7,3 ± 0,2. Je-li třeba, filtruje se do vyjasnění, rozplní se do vhodných nádob a sterilizuje se validovaným postupem. Uchovává se při teplotě mezi 2 °C až 25 °C ve sterilních, utěsněných nádobách, pokud není určena pro okamžité použití.
Užité půdy, ať již ty výše popsané nebo jiné, vyhovují následujícím zkouškám provedeným před zkouškou zkoušeného přípravku nebo současně s ní.
Sterilita. Vzorky živné půdy se 14 dní inkubují při teplotách podle tabulky 2.6.1-1. Není pozorován růst mikroorganismů.
Růstová zkouška aerobních a anaerobních bakterií a hub. Části vybrané půdy se naočkují malým počtem jednoho typu mikroorganismu (10 až 100 jednotek vytvářejících kolonie), který je uveden v tabulce 2.6.1-1, a inkubují se za podmínek podle této tabulky nejdéle 3 dny v případě bakterií a nejdéle 5 dní v případě hub. Rody a kmeny uvedené v tabulce nejsou jediné, které lze použít; jiné mikroorganismy mohou být také vhodné.
Použije se metoda výchozí kultury (systému jednotné inokulace), takže živé mikroorganismy užité pro očkování nejsou vzdáleny o více než pět generací od původní výchozí kultury.
Půdy jsou vhodné tehdy, objeví-li se jasně viditelný časný růst mikroorganismů.
Validační zkouška
Pro každý typ mikroorganismu uvedený v tabulce 2.6.1-1 se provede zkouška, jak je popsáno dále v odstavci Zkouška na sterilitu zkoušeného přípravku. Užije se přesně stejná metoda s výjimkou následujících modifikací.
Membránová filtrace
Po převedení obsahu zkoušené nádoby nebo nádob na membránu se přidá inokulum malého množství živých mikroorganismů (je vhodné 10 až 100 jednotek vytvářejících kolonie) do poslední části sterilního promývacího roztoku.
Tab. 2.6.1-1 Mikroorganismy vhodné pro růstovou a validační zkoušku

Živná půda	Mikroorganismus		Inkubace
	druh	doporučený kmen	Teplota (°C) maximální doba
	Aerobní bakterie		Pro všechny aeroby
	Staphylococcus aureus	ATCC 6538P
Thioglykolanová půda		CIP 53,156
		NCTC 7447
		CCM 2022
		CNCTC Mau 28/58
	Bacillus subtilis	ATCC 6633
		CIP 52,62	32,5+ 2,5	3 dny
		NCIB 8054
		CCM 1999
		CNCTC Bs 8/58
	Pseudomonas aeruginosa	ATCC 9027
		NCIMB 8626
		CIP 82,118
		CCM 1961
		CNCTC Ps 37/65
	Anaerobní bakterie		Pro všechny anaeroby
	Clostridium sporogenes	ATCC 19404	32,5 ± 2,5	3 dny
		CIP 79,3
		CCM 4409
		CNCTC Cl 66/79
Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu*	Houby		Pro všechny houby
	Candida albicans	ATCC 10231
		IP 4872	22,5 ± 2,5	5 dní
		ATCC 2091
		IP 1180,79
		CCM 8226
		CNCTC 55/79
	Aspergillus niger	ATCC 16404
	Aspergillus niger	CCM 8222

*v této půdě se pomnožuje též Baccilus subtilis (ATCC 6633 nebo CIP 52,62)
Přímé očkování
Po převedení obsahu zkoušené nádoby nebo nádob do živné půdy se přidá inokulum malého množství živých mikroorganismů (je vhodné 10 až 100 jednotek vytvářejících kolonie).
V obou případech se provede růstová zkouška jako pozitivní kontrola. Všechny nádoby s živnou půdou se inkubují při teplotách podle tabulky 2.6.1-1 po dobu nejvýše 3 dnů pro bakterie a 5 dnů pro houby.
Dojde-li k jasně viditelnému časnému růstu, vizuálně srovnatelnému srůstem v kontrolních nádobkách bez zkoušeného přípravku, potom přípravek nemá v podmínkách zkoušky žádný protimikrobní účinek nebo takový účinek byl uspokojivě vyloučen. Zkouška na sterilitu se pak může provést bez dalších modifikací.
Nedojde-li v přítomnosti zkoušeného přípravku k jasně viditelnému časnému růstu, vizuálně srovnatelnému s růstem v kontrolních nádobkách bez zkoušeného přípravku, přípravek má protimikrobní účinek, který nebyl v podmínkách zkoušky uspokojivě vyloučen. Podmínky zkoušky se upraví tak, aby byl protimikrobní účinek odstraněn a zkouška se opakuje.
Tato validace se provádí:
Validace se může provést současně se zkouškou na sterilitu zkoušeného přípravku, ale před hodnocením výsledku této zkoušky.
Zkouška na sterilitu zkoušeného přípravku
Zkouška se může provést metodou membránové filtrace nebo přímým očkováním zkoušeného přípravku do živné půdy. Vhodné negativní kontroly jsou obsaženy v každém případě. Všude tam, kde to povaha přípravku dovolí, tj. u filtrovatelných vodných, lihových nebo olejových přípravků, u přípravků mísitelných nebo rozpustných ve vodných nebo olejových rozpouštědlech, které samy v podmínkách zkoušky nemají žádný protimikrobní účinek, se použije metoda membránové filtrace.
Membránová filtrace
Použijí se membránové filtry s jmenovitou velikostí pórů nejvýše 0,45 μm, jejichž účinnost zadržet mikroorganismy byla ověřena. Filtry např. z dusičnanů celulosy se používají pro vodné, olejové a slabě lihové roztoky, filtry z octanu celulosy se používají pro silně lihové roztoky. Pro určité přípravky, např. antibiotika, mohou být zapotřebí speciální filtry.
Dále popsaná metoda je určena pro filtry o průměru 50 mm. Pokud se použijí filtry jiného průměru, měly by se jim přizpůsobit objemy zřeďovacího i promývacího roztoku. Filtrační přístroj a membránové filtry se sterilizují vhodnými postupy. Přístroj je upraven tak, aby zkoušený roztok mohl být do něho naplněn a filtrován za aseptických podmínek a aby umožnil vyjmutí membránového filtru a jeho přenesení do živné půdy nebo aby bylo možné provést inkubaci po přidání živné půdy do přístroje.
Vodné roztoky. Je-li to vhodné, přenese se na membránový filtr malé množství vhodné sterilní tekutiny, jako např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1g/l) o pH 7,1 ± 0,2, a zfiltruje se. Tekutina může obsahovat vhodné neutralizační anebo inaktivační látky, např. v případě antibiotik.
Na membránový filtr nebo filtry se přenese obsah zkoušené nádoby nebo nádob, a je-li třeba, zředí se na asi 100 ml vybraným sterilním rozpouštědlem, v každém případě se však použije nejméně množství předepsané v tabulce 2.6.1-2 a ihned se zfiltruje. Membránový filtr se nejméně třikrát stejnou rychlostí promyje vybraným sterilním rozpouštědlem, jehož množství je stejné jako při validační zkoušce. Membránový filtr se přenese do živné půdy nebo se asepticky rozdělí na dvě stejné části a každá z nich se přenese do vhodné půdy. Užije se stejný objem půdy jako při validační zkoušce. Lze též nalít půdu na membránu v přístroji. Pokud není předepsáno jinak, inkubují se půdy určené zejména k průkazu bakterií při teplotě 32,5 °C ± 2,5 °C a půdy určené zejména k průkazu hub při 22,5 °C ± 2,5 °C a to vždy nejméně 14 dní.
Rozpustné pevné látky. Na každou živnou půdu se použije nejméně podle tabulky 2.6.1-2 určené množství zkoušené látky, které se rozpustí ve vhodném rozpouštědle, jako např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1g/l), a dále se postupuje stejně jako u vodných roztoků za použití membránového filtru vhodného pro zvolené rozpustidlo.
Oleje a olejové roztoky. Na každou živnou půdu se použije nejméně podle tabulky 2.6.1-2 určené množství zkoušené látky. Oleje a olejové roztoky s dostatečně nízkou viskozitou se bez ředění filtrují přímo suchým membránovým filtrem. Viskózní oleje se mohou zředit vhodným sterilním ředidlem, jako je isopropylmyristat, u něhož je prokázáno, že v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinky. Olej se nechá proniknout membránovým filtrem vlastní tíhou a tlak nebo sání se nastavuje postupně. Membránový filtr se promyje nejméně třikrát stejnou rychlostí asi 100 ml vhodného sterilního roztoku, jako je např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1g/l), obsahující 1 g/l (p-terc.oktylfenoxy)polyoxyethanol nebo 10 g/l polysorbátu 80. Membránový filtr nebo filtry se přenesou do živné půdy nebo živných půd nebo naopak se k nim půda přidá, jak je uvedeno u vodných roztoků, a inkubují se při stejných teplotách po stejnou dobu.
Masti a krémy. Na každou živnou půdu se použije množství přípravku uvedené v tabulce 2.6.1-2. Masti s hydrofobním základem a emulze typu v/o se mohou ředit až na 1% koncentraci isopropylmyristatem, jak je popsáno výše, a zahřívat, pokud je to nutné, na nejvýše 40 °C. Výjimečně je lze, pokud je to nutné, zahřát až na 44 °C. Zfiltruje se tak rychle, jak je to jen možné, a postupuje se, jak je popsáno u olejů a olejových roztoků.
Přímé očkování do živných půd
Do živné půdy se dá takové množství zkoušeného přípravku, jak je předepsáno v tabulce 2.6.1-2 tak, aby objem vzorku nečinil více než 10 % objemu živné půdy, není-li předepsáno jinak.
Olejové kapaliny. Použijí se živné půdy, k nimž se přidá roztok polysorbátu 80 (10 g/l) nebo (p-terc.oktylfenoxy)polyoxyethanol (1 g/l) nebo jiné emulgující látky ve vhodné koncentraci, u níž bylo prokázáno, že v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinek.
Masti a krémy. Zředí se v poměru 1 : 10 vhodným emulgátorem ve sterilním rozpouštědle, např. neutrálním roztoku masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l). Zředěný přípravek se očkuje do živné půdy, která neobsahuje emulgující látku.
Má-li zkoušený přípravek protimikrobní účinky, provede se zkouška po neutralizaci vhodnou neutralizační látkou nebo po zředění dostatečným množstvím živné půdy. Je-li nutné použít větší objem přípravku, lze dát přednost použití koncentrované živné půdy připravené tak, aby se dosáhlo potřebného zředění. V některých případech lze koncentrovanou živnou půdu přímo přidat k přípravku v jeho obalu.
Pokud není předepsáno jinak, inkubují se naočkované půdy nejméně 14 dní při teplotách uvedených v tabulce 2.6.1-1. V průběhu inkubace se půdy několikrát prohlížejí. Půdy s olejovými přípravky se každý den opatrně protřepou. Pokud se však použije k důkazu anaerobů thioglykolanová nebo jí podobná půda, je nutno omezit třepání nebo míchání na minimum, aby byly zachovány anaerobní podmínky.
Odečítání a hodnocení výsledků
V živných půdách se v průběhu a na závěr inkubace makroskopicky zjišťuje případný růst mikrobů. Jestliže zkoušený přípravek způsobí zakalení živné půdy, takže nelze určit přítomnost nebo absenci mikrobiálního růstu vizuálně po 14 dnech od začátku inkubace, přenese se vhodná část živné půdy do nové nádobky se stejnou živnou půdou. Pokračuje se v inkubaci původního i nového vzorku nejméně 14 + 7 dní od původního očkování.
Jestliže není pozorován žádný růst, vyhovuje zkoušený přípravek zkoušce na sterilitu. Je-li zjištěn růst, přípravek nevyhovuje zkoušce na sterilitu, pokud nelze jasně prokázat, že zkouška byla neplatná z důvodů, jež se nevztahují na zkoušený přípravek. Zkouška může být považována za neplatnou, je-li splněna jedna nebo více z následujících podmínek:
Je-li zkouška prohlášena za neplatnou, opakuje se se stejným množstvím jednotek jako původní zkouška.
Jestliže při opakování zkoušky není pozorován žádný růst, vyhovuje zkoušený přípravek zkoušce na sterilitu. Je-li při opakované zkoušce zjištěn růst, přípravek nevyhovuje zkoušce na sterilitu.
Postup zkoušky pro parenterální, oční a jiné neinjekční přípravky, u nichž je požadována sterilita
Pokud se použije metoda membránové filtrace, zkouší se, pokud možno, celý obsah nádoby, ale nejméně množství uvedené v tabulce 2.6.1-2. Je-li třeba, zředí se asi na 100 ml vhodným sterilním roztokem, např. neutrálním roztokem masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l). Celkový objem filtrovaný jedním filtrem nepřesahuje 1000 ml, není-li uvedeno a schváleno jinak.
Použije-li se metoda přímého očkování do živné půdy, očkuje se množství podle tabulky 2.6.1-2. Zkoušky na bakteriální a houbovou sterilitu se provádějí se stejným vzorkem zkoušeného přípravku. Pokud objem nebo množství v jedné nádobě nestačí k provedení obou zkoušek, použije se obsah dvou nebo více nádob k naočkování různých půd.
Je-li obsah přípravku v obalu větší než 100 ml, použije se membránová metoda, není-li uvedeno a schváleno jinak
Tab. 2.6.1-2 Zkouška na sterilitu – množství zkoušeného přípravku

Typ přípravku	Množství v obalu	Minimální množství, které se použije pro každou půdu, není-li uvedeno a schváleno jinak
Parenterální přípravky	Tekutiny
	- méně než 1 ml	celý obsah obalu polovina obalu, ale nejvýše 20 ml
	- 1 ml a více

	Pevé látky
	- méně než 50 mg	celý obsah obalu
	- více než 50 mg, ale méně než 300 mg	polovina obalu 150 mg
	- 300 mg a více	polovina obalu 150 mg
Oční přípravky, ostatní neinjekční přípravky	Vodné roztoky	celý obsah jednoho nebo více obalů, nejméně 2,5 ml
	Ostatní přípravky rozpustné ve vodě nebo isopropylmyristatu	celý obsah jednoho nebo více obalů, nejméně 0,25 g

	Nerozpustné přípravky, krémy a masti, jež je nutno suspendovat nebo emulgovat	celý obsah jednoho nebo více obalů, nejméně 0,25 g

Pokyny k použití zkoušky na sterilitu
Účel zkoušky na sterilitu, jako ostatně všech lékopisných zkoušek, je poskytnout nezávislému kontrolujícímu analytikovi prostředky k ověření, že jednotlivý materiál splňuje požadavky lékopisu. Výrobci nejsou povinni provádět takové zkoušky, ani vyloučit užití modifikací nebo alternativ popsaných metod za předpokladu, že jsou přesvědčeni o tom, že bude-li přípravek zkoušen oficiálními metodami, vyhoví požadavkům lékopisu.
Pokyny pro výrobce
Stupeň jistoty získaný uspokojivým výsledkem zkoušky na sterilitu (nepřítomnost kontaminovaných jednotek ve vzorku) a vztažený na kvalitu celé šarže, je funkcí stejnorodosti podmínek výroby a efektivnosti přijatého systému odebírání vzorků. Pro účely tohoto textu je šarže definována jako homogenní soubor těsně uzavřených obalů připravených takovým způsobem, že riziko kontaminace je stejné pro každou jednotku v tomto souboru obsaženou.
Pokud se přípravek sterilizuje v uzavřených konečných obalech, vyšší stupeň záruky než provedení zkoušky na sterilitu poskytuje sledování správného průběhu sterilizace celé šarže pomocí měření a automatického zaznamenávání hodnot biologicky opodstatněných fyzikálních parametrů. Podmínky, za kterých může být považováno za vhodné parametrické uvolnění, jsou popsány ve stati 5.1.1-Metody přípravy sterilních přípravků. Pro vyhodnocení postupu aseptické výroby může být použita metoda, při níž se tento postup napodobí za použití živných půd. Nehledě k tomu, že zkouška na sterilitu je jediná analytická metoda použitelná pro přípravky vyrobené v aseptických podmínkách, je to dále v každém případě jediná dostupná analytická metoda pro autority, které mají vzorky přípravků zkoušet na sterilitu.
Pravděpodobnost detekce mikroorganismů zkouškou na sterilitu roste s jejich počtem ve zkoušeném vzorku a kolísá podle schopnosti růstu přítomných mikroorganismů. Pravděpodobnost odhalení velmi nízkého stupně kontaminace, i když je homogenní v celé šarži, je velmi malá. Interpretace výsledků zkoušky na sterilitu se opírá o předpoklad, že obsahy všech obalů v šarži, pokud by byly zkoušeny, daly by stejný výsledek. Jelikož je zřejmé, že každý obal nemůže být zkoušen, je třeba přijmout vhodný plán odběru vzorků. Vodítko pro minimální počet jednotek doporučených ke zkoušení ve vztahu k velikosti šarže je v tabulce 2.6.1-3 a vychází z předpokladu, že přípravek byl vyroben za podmínek určených k vyloučení kontaminace. Aplikace doporučení musí brát ohled na objem přípravku v obalu, na validaci sterilizační metody a na jiné speciální zřetele týkající se sterility přípravku.
Tab. 2.6.1.-3 Doporučený nejmenší počet jednotek pro zkoušku na sterilitu

Počet jednotek v šarži	Nejmenší počet jednotek pro zkoušku na sterilitu pro každou půdu (*)
Parenterální přípravky
- nejvýše 100 obalů	10 % nebo 4 obaly – podle toho, co je více
- více než 100, méně než 500 obalů	10 obalů
- více než 500 obalů	2 % nebo 20 obalů – podle toho, co je méně

Oční přípravky a ostatní neinjekční přípravky
- nejvýše 200 obalů	5 % nebo 2 obaly – podle toho, co je více
- více než 200 obalů	10 obalů
Je-li přípravek v jednodávkovém obalu, použije se tabulka pro parenterální přípravky

Nerozplněné pevné přípravky
- do 4 obalů	každý obal
- více než 4, méně než 50 obalů	20 % nebo 4 obaly – podle toho, co je více
- více než 50 obalů	2 % nebo 10 obalů – podle toho, co je více

(*) Stačí-li obsah jednoho obalu k inokulaci dvou půd, pak tento sloupec udává počet obalů potřebných pro obě půdy dohromady

2.6.2 Mykobakterie

Podstata zkoušky. Nepřítomnost mykobakterií se zjišťuje kultivací ve vhodných živných půdách.
Postup zkoušky. Je-li zkoušený vzorek kontaminován jinými mikroorganismy, než jsou mykobakterie, ošetří se vhodným dekontaminačním roztokem, jako je např. roztok acetylcysteinu s hydroxidem sodným nebo roztok laurylsíranu sodného.
Na dvě vhodné pevné půdy (za vhodnou se považuje Löwenstein-Jensenova půda a Middle-brookova 7H10 půda) se trojmo naočkuje po 0,2 ml vzorku a dále se do vhodné tekuté půdy trojmo naočkuje po 0,5 ml vzorku. Všechny půdy se inkubují 56 dnů při 37 °C.
Růstové vlastnosti živných půd v přítomnosti zkoušeného přípravku se ověří naočkováním vhodného kmene Mycobacterium tuberculosis, jako je např. BCG, a je-li třeba, použije se vhodná neutralizační látka.
Jestliže v prvních osmi dnech inkubace vyrostou kolonie kontaminujících mikroorganismů, zkouška se opakuje a zároveň se provede bakteriologická zkouška na sterilitu.
Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže se na konci inkubační doby nezjistí nárůst mykobakterií v žádné zkumavce

2.6.7 Zkouška na mykoplazmata

Tam, kde je předepsána zkouška na mykoplazmata pro banku základních buněk, banku pracovních buněk, výchozí kulturu viru nebo kontrolní buňky, použije se metoda kultivační a metoda imunofluorescence v buněčné kultuře. Tam, kde je předepsána zkouška na mykoplazmata pro virovou sklizeň ve vakcíně před rozplněním nebo v šarži, použije se kultivační metoda. Metoda imunofluorescence v buněčné kultuře se může také použít, je-li třeba, k ověření půd.
KULTIVAČNÍ METODA
Výběr kultivačních půd
Zkouška se provádí za použití dostatečného počtu jak pevných, tak tekutých živných půd, aby se za vybraných podmínek inkubace zajistil růst malých počtů mykoplazmat, která mohou být přítomna ve zkoušeném přípravku.
Tekuté živné půdy obsahují fenolovou červeň. Vybrané druhy živných půd mají prokazatelně dostatečné živné vlastnosti nejméně pro organismy uvedené dále. Živné vlastnosti každé nové šarže živné půdy jsou ověřovány pro příslušné organismy uvedené na seznamu.
Acholeplasma laidlawii (vakcíny pro humánní a veterinární použití, při jejichž výrobě byla použita antibiotika)
Mycoplasma gallisepticum (kde se při výrobě použil materiál ptačího původu nebo kde vakcína je určena pro drůbež)
Mycoplasma hyorhinis (neaviární veterinární vakcíny)
Mycoplasma orale (vakcíny pro humánní a veterinární užití)
Mycoplasma pneumoniae (vakcíny pro humánní užití) nebo jiný vhodný druh, fermentující glukózu
Mycoplasma synoviae (kde se při výrobě použil materiál ptačího původu nebo kde vakcína je určena pro drůbež)
Zkušební kmeny jsou izoláty z terénu, které neprošly více než patnácti subkultivacemi a jsou uchovávány zmrazené nebo v lyofilizovaném stavu.
Po klonování se kmeny identifikují jako požadované druhy vhodnou metodou, porovnáním se sbírkovými kulturami např.:

Acholeplasma laidlawii	NCTC 10116	CIP 75,27	ATCC 23206
Mycoplasma gallisepticum	NCTC 10115	CIP 104967	ATCC 19610
Mycoplasma hyorhinis	NCTC 10130	CIP 104968	ATCC 17981
Mycoplasma orale	NCTC 10112	CIP 104969	ATCC 23714
Mycoplasma pneumoniae	NCTC 10119	CIP 103766	ATCC 15531
Mycoplasma synoviae	NCTC 10124	CIP 104970	ATCC 25204

Inkubační podmínky
Naočkovaná živná půda se rozdělí na dvě stejné části a jedna část se inkubuje za aerobních a druhá část za mikroaerofílních podmínek; pevné živné půdy se udržují v atmosféře s patřičnou vlhkostí, aby se zamezilo vysychání povrchu půd. Za aerobních podmínek se inkubuje v atmosféře vzduchu s odpovídající vlhkostí a obsahující pro pevné půdy 5 % až 10 % oxidu uhličitého. Za mikroaerofilních podmínek se inkubuje v dusíkové atmosféře, obsahující pro pevné půdy 5 % až 10 % oxidu uhličitého.
Živné vlastnosti
S každou novou šarži živé půdy se provede zkouška živných vlastnosti. Vybraná živná půda se naočkuje vhodnými zkušebními mikroorganismy; použije se nejvýše 100 jednotek vytvářejících kolonie na misku o průměru 60 mm obsahující 9 ml pevné živné půdy a nejvýše 40 jednotek vytvářejících kolonie pro 100ml nádobu s odpovídající tekutou půdou; pro každý druh organismu se použije samostatná plotna a nádoba. Živné půdy se inkubují za podmínek, které budou použity ke zkoušce zkoušeného výrobku (aerobní, mikroaerofilní nebo obojí, v závislosti na požadavcích zkušebního organismu). Půdy vyhovují zkoušce na živné vlastnosti, dojde-li k přiměřenému růstu zkušebních organismů doprovázenému příslušnou barevnou změnou v tekutých živných půdách.
Inhibiční látky
Zkouška na živné vlastnosti se provede v přítomnosti zkoušeného přípravku. Je-li růst zkušebních organismů zřetelně menší než ten, který byl zjištěn bez přítomnosti zkoušeného přípravku, přípravek obsahuje inhibiční látky, které se před provedením zkoušky na mykoplazmata neutralizují (nebo se jejich účinek vyloučí jinak např. ředěním). Účinnost neutralizace nebo jiného postupu se kontroluje opakováním zkoušky na inhibiční látky po neutralizaci.
Zkouška na mykoplazmata ve zkoušeném přípravku
Pro pevné živné půdy se použijí misky o průměru 60 mm a obsahující 9 ml půdy. Každá z nejméně dvou misek s každou pevnou půdou se naočkuje 0,2 ml zkoušeného přípravku a 100 ml každé tekuté půdy se naočkuje 10 ml zkoušeného přípravku. Inkubuje se 21 dní při 35 °C až 38 °C za aerobních a mikroaerofilních podmínek a současně se jako kontrola inkubuje nenaočkovaná dávka 100 ml každé tekuté živné půdy. Objeví-li se po přidání zkoušeného přípravku jakékoliv významné změny pH, původní hodnota pH se obnoví přidáním roztoku bud’ hydroxidu sodného, nebo kyseliny chlorovodíkové. První, druhý nebo třetí den po naočkování se vyočkuje po 0,2 ml z každé tekuté půdy na dvě misky s každou pevnou půdou a inkubuje se nejméně 21 dní při 35 °C až 38 °C za aerobních a mikroaerofilních podmínek. Postup se opakuje šestý, sedmý nebo osmý den a znovu třináctý nebo čtrnáctý den zkoušky. Tekuté živné půdy se prohlížejí každý druhý nebo třetí den, a objeví-li se změna barvy, okamžitě se přeočkují. Pevné živné půdy se prohlížejí jednou týdně.
Jestliže jsou tekuté živné půdy kontaminovány bakteriemi nebo houbami, zkouška se opakuje. Jestliže nejdříve za sedm dní po naočkování je nejvýše jedna miska v každé části zkoušky náhodně kontaminována bakteriemi nebo houbami nebo zničena, vyloučí se tato miska za předpokladu, že se při bezprostředním vyšetření neprokáže růst mykoplazmat. Pokud je v kterékoliv části v průběhu zkoušky více než jedna miska náhodně kontaminována bakteriemi nebo houbami nebo rozbita, je zkouška neplatná a opakuje se.
Do zkoušky se zařadí pozitivní kontrola připravená naočkováním nejvýše 100 jednotek vytvářejících kolonie vhodného druhu, jako M. orale a M. pneumoniae.
Na konci inkubační doby se všechny pevné naočkované půdy mikroskopicky vyšetří na přítomnost mykoplazmat.
Přípravek vyhovuje zkoušce, nezjistí-li se růst mykoplazmat v žádné z naočkovaných půd. Zjistí-li se růst mykoplazmat, zkouška se může opakovat s použitím dvojnásobného množství inokula, půd a misek. Nezjistí-li se růst mykoplazmat, přípravek vyhovuje zkoušce. Zkouška není platná, jestliže pozitivní kontrola neprokáže růst zkušebního mikroorganismu.
Metoda imunofluorescence v buněčné kultuře
Buněčné kultury se obarví fluorescenčním barvivem, které se váže na DNK. Mykoplazmata se zjistí pomocí fluorescence jejich charakteristických částic nebo nitkovitých útvarů na povrchu buněk, a jestliže je kontaminace silná, i v okolním prostředí.
Ověření substrátu
Jako substrát se použije kultura buněk Vero, předem odzkoušená pomocí inokula, které neobsahuje více než 100 jednotek vytvářejících kolonie kmene rostoucího dobře v tekuté nebo pevné půdě a dokáže se schopnost metody prokázat případnou kontaminaci mykoplazmaty, např. vhodnými kmeny Mycoplasma hyorhinis a Mycoplasma orale. Mohou se použít různé buněčné substráty, např. produkční buněčná linie, jestliže se prokázalo, že poskytne přinejmenším stejnou citlivost pro důkaz možné kontaminace mykoplazmaty.
Zkušební metoda
Nejméně 1 ml zkoušeného přípravku se použije k dvojnásobnému naočkování, jak je popsáno v odstavci Postup zkoušky, na kulturu indikátorových buněk představující plochu nejméně 25 cm²souvislé buněčné kultury.
Do zkoušky se zařadí negativní (neinfikovaná) kontrola a dvě pozitivní kontroly mykoplazmat, jako např. Mycoplasma hyorhinis a Mycoplasma orale. Pro pozitivní kontrolu se použije k očkování inokulum, které obsahuje nejvýše 100 jednotek vytvářejících kolonie.
Jestliže pro virové suspenze je interpretace výsledků ovlivněna zřetelnými cytopatickými efekty, může se virus neutralizovat specifickým antisérem, které nemá inhibiční účinek na mykoplazmata, nebo se použije substrát buněčné kultury, který neumožní pomnožení viru. K průkazu nepřítomnosti inhibičního účinku v séru se provedou kontrolní zkoušky v přítomnosti a v nepřítomnosti antiséra.
Postup zkoušky
Doporučené živné půdy pro kultivační metodu
Následující půdy se doporučují. Jiné půdy mohou být použity za předpokladu, že se u každé šarže prokáže schopnost podporovat růst mykoplazmat v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku.
I. Půdy doporučené pro důkaz Mycoplasma gallisepticum.
II. Půdy doporučené pro důkaz Mycoplasma synoviae.
III. Půdy doporučené pro důkaz neaviárních mykoplazmat.

2.6.12 Mikrobiologické zkoušení nesterilních výrobků
(celkový počet živých mikroorganismů)

Dále popsaná zkouška umožňuje kvantitativně spočítat mezofilní houby a bakterie, které mohou růst v aerobních podmínkách.
Zkouška je určena především ke zjištění, zda látka, která je předmětem lékopisného článku vyhovuje nebo nevyhovuje mikrobiologickým požadavkům uvedeným v tomto článku. Pokud se zkouška používá pro tyto účely, postupuje se podle následujících pokynů, včetně potřebného počtu odebraných vzorků a dále uvedené interpretace výsledků. Zkouška se může také použít ve stati Účinnost protimikrobních konzervačních látek (5.1.3), jak je popsána v lékopise. Dále se může užít pro monitorování kvality surovin a může se použít ve spojení s požadavky uvedenými ve stati Mikrobiologická jakost léčivých přípravků (5.1.4). Pokud ji výrobce použije v takových případech, jako je monitorování kvality surovin anebo konečných přípravků nebo při validaci postupu, je provedení zkoušky, včetně počtu odebraných vzorků a interpretace výsledků, záležitostí dohody mezi výrobcem a oprávněnou autoritou.
Stanovení se provádí za podmínek vylučujících nahodilé znečištění zkoušeného výrobku. Opatření vylučující znečištění mají být taková, aby nepůsobila na prokazované mikroorganismy. Jestliže zkoušený výrobek má protimikrobní účinky, musí být přiměřeným způsobem zneutralizovány. Používají-li se k tomuto účelu inaktivující látky, prokáže se jejich účinek a také že nejsou toxické pro mikroorganismy.
Celkový počet živých mikroorganismů se stanoví metodou membránové filtrace nebo počítáním na pevných půdách, jak je předepsáno v lékopisném článku.
Metoda nejpravděpodobnějšího počtu je vyhrazena pro stanovení počtu bakterií v případech, kdy se nedá provést žádná jiná metoda. Výběr metody může být založen na různých faktorech, jako jsou např. povaha výrobku a očekávaný počet mikroorganismů. Kterákoliv vybraná metoda se dostatečně validuje.
Ve spojení s kapitolou (5.1.3) nebo (5.1.4) se může použít metoda zalévání do agaru, metoda očkování na povrch agarové půdy nebo metoda membránové filtrace.
Příprava vzorku
Plán vzorkování. Vzorkování výrobku se provede podle dobře definovaného plánu odběru vzorků. Tento plán závisí na faktorech, jako jsou velikost šarže, zdravotní riziko spojené s nepřijatelně vysokou kontaminací přípravku, na jeho charakteru a na očekávaném stupni kontaminace. Jestliže není předepsáno jinak, použije se 10 g nebo 10 ml zkoušené látky nebo přípravku odebraných za shora uvedených podmínek. Vzorky se vyberou náhodně z nerozplněného materiálu nebo z dostupných obalů přípravku. K získání potřebného množství se smíchá, je-li třeba, obsah dostatečného počtu obalů, které postačují k vytvoření vzorku podle povahy zkoušené látky nebo přípravku.
Trojúrovňový vzorkovací plán je příkladem vzorkovacího plánu vhodného pro výrobky, kde může být homogenita problémem ve vztahu k rozložení mikroorganismů. V tom případě se z každé šarže odebere a vyzkouší odděleně pět vzorků. Tři uznané úrovně jsou: (i) přijatelné vzorky, tj. obsahující méně než m jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru, kde m je limit určený v příslušném článku; (ii) kritické vzorky, tj. které obsahují více než m jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru, ale méně než 10 m jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru; (iii) vadné vzorky, tj. obsahující více než 10 m jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru.
Výrobky rozpustné ve vodě. 10 g nebo 10 ml zkoušeného výrobku se rozpustí nebo zředí v tlumivém roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 nebo v jiné vhodné tekutině. Obecně se připraví desetinné ředění, ale vlastnosti výrobku nebo požadovaná citlivost mohou vyžadovat použití jiných poměrů. Jestliže je známa protimikrobní účinnost výrobku, může se do rozpouštědla přidat inaktivující látka. Pokud je třeba, upraví se pH na hodnotu asi 7 a připraví se řada desetinásobných ředění za použití stejného rozpouštědla.
Nelipofilní výrobky nerozpustné ve vodě. 10 g nebo 10 ml zkoušeného výrobku se suspenduje v tlumivém roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 nebo jiné vhodné tekutině. Obecně se připraví desetinná suspenze, ale vlastnosti některých výrobků mohou vyžadovat použití větších objemů. Je možné přidat vhodnou povrchově aktivní látku, např. polysorbát 80 (1 g/l) k usnadnění tvorby suspenze špatně smáčitelných látek. Jestliže je známa protimikrobní účinnost výrobku, může se do rozpouštědla přidat inaktivující látka. Pokud je třeba, upraví se pH na hodnotu asi 7 a připraví se řada desetinásobných ředění za použití stejného rozpouštědla.
Výrobky lipofilní. 10 g nebo 10 ml zkoušeného výrobku se zhomogenizuje s nejvýše polovinou jeho hmotnosti sterilního polysorbátu 80 nebo jiné vhodné povrchově aktivní látky, kterou je možno v případě potřeby zahřát nejvýše na 40 °C, ve výjimečných případech nejvýše na 45 °C. Dobře se promíchá a udržuje se při této teplotě na vodní lázni nebo v termostatu a přidá se dostatečné množství předehřátého tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 k přípravě desetinného ředění původního výrobku. Zatímco se udržuje teplota, míchá se pečlivě co nejkratší dobu nezbytnou k vytvoření emulze, nejdéle však 30 min. Další řada desetinásobných ředění se může připravit za použití tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 obsahujícího vhodnou koncentraci sterilního polysorbátu 80 nebo jiné povrchově aktivní látky.
Zkoušení vzorku
Membránová filtrace
Použijí se membránové filtry s nominální velikostí pórů nejvýše 0,45 μm, jejichž účinnost zadržet bakterie byla ověřena. Typ materiálu filtru se vybere tak, aby účinnost filtru nebyla ovlivněna složkami zkoušeného vzorku. Filtry z dusičnanů celulosy se např. používají pro vodné, olejové a slabě lihové roztoky a filtry z octanu celulosy se např. používají pro silně lihové roztoky. Přístroj je navržen tak, aby umožnil přenést filtr na agarovou půdu.
Vhodné množství vzorku, připraveného jak je popsáno v odstavci Příprava vzorku (přednostně představující 1 g výrobku nebo méně, jestliže se očekává větší množství jednotek vytvářejících kolonie), se přenese na každý ze dvou membránových filtrů a ihned se zfiltruje. Každý filtr se promyje třemi dávkami, z nichž každou tvoří asi 100 ml vhodné tekutiny, jako např. tlumivý roztok chloridu sodného s peptonem o pH 7,0. K tomuto roztoku je možné přidat povrchově aktivní látky, jako je polysorbát 80, nebo látky inaktivující protimikrobní účinky. Je-li postup validován, může se na promytí použít méně než tři dávky. Membránový filtr určený především pro počítání bakterií se přenese na povrch vhodné agarové půdy (jako je agarová půda B) a druhý, určený především pro počítání hub, na povrch vhodné půdy (jako je agarová půda C). Misky s agarem B se inkubují při 30 °C až 35 °C a misky s agarem C při 20 °C až 25 °C po dobu 5 dní, pokud se nezíská spolehlivý počet dříve. Vyberou se misky s nejvyšším počtem kolonií, který však nepřesahuje 100, a vypočítá se počet jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru výrobku.
Počítání na pevných půdách
Metoda zalévání do agaru. Použijí se Petriho misky o průměru 9 cm, do každé se přidá 1 ml vzorku připraveného, jak je popsáno v odstavci Příprava vzorku, a 15 ml až 20 ml rozehřáté agarové půdy vhodné pro kultivaci bakterií (jako např. agarová půda B) nebo rozehřáté agarové půdy vhodné pro kultivaci hub (jako např. agarová půda C). Půdy se rozehřívají při teplotě, která nepřesahuje 45 °C. Použijí-li se větší Petriho misky, zvětší se příslušně i množství agaru. S každou živnou půdou a s každým zředěním se připraví nejméně dvě Petriho misky. Plotny s půdou pro bakterie se inkubují při 30 °C až 35 °C (pro houby při 20 °C až 25 °C) po dobu 5 dní, pokud se nezíská spolehlivý počet dříve. Vyberou se misky odpovídající jednomu ředění a ukazující nejvyšší počet kolonií, který však nepřesahuje 300 (100 kolonií pro houby). Z aritmetického průměru počtů se vypočítá množství jednotek vytvářejících kolonie v gramu nebo mililitru.
Metoda očkování na povrch agarové půdy. Použijí se Petriho misky o průměru 9 cm, do každé se přidá 15 ml až 20 ml agarové půdy vhodné pro kultivaci bakterií (jako je agarová půda B) nebo agarové půdy vhodné pro kultivaci hub (jako je agarová půda C) rozehřáté asi na 45 °C a se utuhnout. Používají-li se větší Petriho misky, použije se přiměřeně větší množství živné půdy. Povrch půd se nechá zaschnout, např. ve skříni s laminárním prouděním vzduchu nebo v termostatu. Odměřený objem, nejméně však 0,1 ml vzorku připraveného jak je posáno v odstavci Příprava vzorku, se rozetře na povrch půdy. Pro každou půdu a každé ředění se použijí nejméně dvě Petriho misky. Při inkubaci a počítání jednotek vytvářejících kolonie se postupuje stejně, jak je popsáno v metodě zalévání do agaru.
Metoda nejpravděpodobnějšího počtu
Správnost a přesnost této metody (MPN) je menší než u metody membránové filtrace nebo počítání na pevných půdách. Nespolehlivé výsledky jsou získávány obzvláště při počítání plísní. Z těchto důvodů se metoda MPN používá pro počítání bakterií v případě, kdy se žádná jiná metoda nedá provést. Je-li použití této metody oprávněné, postupuje se následujícím způsobem.
Připraví se řada nejméně tří následujících desetinásobných ředění výrobku, jak je popsáno v odstavci Příprava vzorku. Z každého ředění se použijí tři stejné dávky (1 g nebo 1 ml) k očkování tří zkumavek s 9 ml nebo 10 ml vhodné tekuté půdy (jako je půda A). Je-li třeba, může se k půdě přidat povrchově aktivní látka, jako je polysorbát 80, nebo látka inaktivující proitimikrobní účinky. Jestliže jsou připraveny tři stupně ředění, naočkuje se devět zkumavek a všechny se 5 dnů inkubují při 30 °C až 35 °C. Pro každý stupeň ředění se zaznamenává počet zkumavek, které vykazují mikrobiální růst. Jestliže odečítání výsledků je obtížné nebo nejisté vzhledem k povaze zkoušeného výrobku, vyočkuje se do stejné půdy nebo na vhodnou pevnou půdu (jako je agarová půda B) a inkubuje se 18 h až 24 h při stejné teplotě a použijí se tyto výsledky. Nejpravděpodobnější počet bakterií v gramu nebo miligramu zkoušeného výrobku se stanoví z tabulky 2.6.12-1.
Tab. 2.6.12-1 Nejpravděpodobnější počet bakterií

			Tři zkumavky pro každé ředění
Počet zkumavek s pozitivním růstem			Nejpravděpodobnější počet v 1 g	Kategorie*		95% meze spolehlivosti
0,1 g	0,01 g	0,001 g		1	2
0	0	0	< 3			-	-
0	1	0	3		x	< 1	17
1	0	0	3	x		1	21
1	0	1	7		x	2	27
1	1	0	7	x		2	28
1	2	0	11		x	4	35
2	0	0	9	x		2	38
2	0	1	14		x	5	48
2	1	0	15	x		5	50
2	1	1	20		x	8	61
2	2	0	21	x		8	63
3	0	0	23	x		7	129
3	0	1	38	x		10	180
3	1	0	43	x		20	210
3	1	1	75	x		20	280
3	2	0	93	x		30	390
3	2	1	150	x		50	510
3	2	2	210		x	80	640
3	3	0	240	x		100	1400
3	3	1	460	x		200	2400
3	3	2	1100	x		300	4800
3	3	3	> 1100			-	-

* Kategorie 1: normální výsledky obdržené v 95 % případů.
Kategorie 2: méně pravděpodobné výsledky obdržené pouze ve 4 % případů. Tyto se nemohou použít pro důležitá rozhodnutí. Výsledky, které jsou ještě menší než tyto v kategorii 2, nejsou uvedeny a jsou vždy nepřijatelné.
Účinnost kultivační půdy a validita metod na stanovení počtu
Bakteriální kmeny se 18 h až 24 h kultivují odděleně v nádobách obsahujících vhodnou tekutou půdu (jako je půda A) při 30 °C až 35 °C. Kmeny hub se kultivují odděleně na vhodné agarové půdě (jako je půda C bez antibiotik) při 20 °C až 25 °C 48 h (Candida albicans) nebo 7 dní (Aspergillus niger).

Staphylococcus aureus	ATCC 6538 (NCIB 9518, CIP 4.83, CCM 4516, CNCTC Mau 29/58)
Escherichia coli	ATCC 8739 (NCIB 8545, CIP 53.126, CCM 4517)
Bacillus subtilis	ATCC 6633 (NCIB 8054, CIP 52.62, CCM 1999, CNCTC Bs 8/58)
Candida albicans	ATCC 10231 (NCPF 3179, IP 48.72, CCM 8215, CNCTC 59/91)
Aspergillus niger	ATCC 16404 (IMI 149007, IP 1431.83, CCM 8222)

K přípravě referenční suspenze obsahující asi 100 jednotek vytvářejících kolonie se použije tlumivý roztok chloridu sodného s peptonem o pH 7,0. Suspenze každého z mikroorganismů se použije samostatně jako u metod na stanovení počtu, v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného výrobku. Pokud se zkouška provádí pomocí membránové filtrace nebo počítáním na pevných půdách, počty kolonií všech zkoušených mikroorganismů by se neměly lišit od hodnot vypočítaných z inokula o více než faktor 5. Pokud se zkouška provádí metodou nejpravděpodobnějšího počtu, pak vypočítaný výsledek je v 95% mezích spolehlivosti. Pro zkoušku sterility agarové půdy a ředícího roztoku a aseptického provedení zkoušky se místo zkoušeného přípravku použije sterilní roztok chloridu sodného s peptonem o pH 7,0. Nesmí se objevit růst mikroorganismů.
Interpretace výsledků
Za celkový počet bakterií se považuje průměrný počet jednotek vytvářejících kolonie nalezený na agarové půdě B. Za celkový počet hub se považuje průměrný počet jednotek vytvářejících kolonie nalezený na agarové půdě C. Celkový počet živých mikroorganismů je součet počtu bakterií a hub. Jestliže je prokázáno, že stejné typy mikroorganismů rostou na obou agarových půdách, může se provést oprava. Jestliže se použila metoda nejpravděpodobnějšího počtu, tak vypočítaná hodnota je počet bakterií.
Je-li v článku uveden limit počtu mikroorganismů, interpretuje se takto:
10² mikroorganismů - nejvyšší přípustná hodnota je 5 x 10²,
10³ mikroorganismů - nejvyšší přípustná hodnota je 5 x 10³, atd.
Jestliže je např. použit trojúrovňový vzorkovací plán, postupuje se následovně:
Pro každý z pěti vzorků se spočítá samostatně celkový počet živých mikroorganismů. Látka nebo přípravek vyhovují zkoušce, jestliže jsou splněny následující podmínky: (i) žádný z jednotlivých výsledků celkového počtu živých mikroorganismů nepřesahuje desetinásobek předepsaného limitu (tj. žádné nepřijatelné vzorky) a (ii) nejvýše dva z jednotlivých výsledků celkového počtu živých mikroorganismů jsou mezi předepsaným limitem a desetinásobkem tohoto limitu (tj. nejvýše dva kritické vzorky).
Doporučené roztoky a agarové půdy jsou popsány v kapitole (2.6.13).

2.6.13 Mikrobiologické zkoušení nesterilních výrobků
(zkoušky na specifické mikroorganismy)

V těchto obecných metodách se předpokládá použití určitých selektivních půd. Vlastností společnou pro všechny selektivní půdy je, že subletálně poškozené mikroorganismy nejsou zachyceny. Jelikož subletálně poškozené mikroorganismy jsou důležité pro kvalitu výrobku, jejich oživení musí být zahrnuto do zkušebních postupů, které používají selektivní půdy.
Jestliže zkoušený výrobek má protimikrobní účinky, neutralizují se tyto účinky odpovídajícím způsobem.
Enterobakterie a určité jiné gramnegativní bakterie
Přestože zkouška byla určena pro zjištění bakterií patřících do čeledi Enterobacteriaceae, je známo, že mohou být nalezeny i jiné typy mikroorganismů (např. Aeromonas, Pseudomonas).
Důkaz. Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, ale místo tlumivého roztoku s chloridem sodným a peptonem o pH 7,0 se použije tekutá půda D. Zhomogenizuje se a inkubuje při 35 °C až 37 °C po dobu postačující k oživení bakterií, ale nepostačující k jejich pomnožení (obvykle 2 h, ale nejvýše 5 h). Obal se protřepe a obsah homogenizátu A odpovídající 1 g nebo 1 ml zkoušeného výrobku se kvantitativně přenese do 100 ml pomnožovací půdy E a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Potom se vyočkuje na misky s agarovou půdou F a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Výrobek vyhovuje, jestliže na žádné misce nevyrostou kolonie gramnegativních bakterií.
Kvantitativní stanovení. Do vhodných množství obohacené tekuté půdy E se přidají z homogenizátu A a/nebo z jeho ředění množství odpovídající 0,1 g, 0,01 g a 0,001 g nebo 0,1 ml, 0,01 ml a 0,001 ml zkoušeného výrobku. Inkubuje se 24 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Z každé kultury se pro dosažení selektivní izolace provede vyočkování na agarovou půdu F. Inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Růst dobře vyvinutých, červených nebo načervenalých kolonií gramnegativních bakterií se hodnotí jako pozitivní výsledek. Zaznamená se nejmenší množství zkoušeného výrobku, které dává pozitivní výsledek a největší množství zkoušeného výrobku, které dává negativní výsledek.
Z tabulky 2.6.13-1 se stanoví pravděpodobný počet bakterií.
Tab. 2.6.13-1

Výsledky pro množství přípravku			Pravděpodobný počet bakterií v 1 g přípravku
0,1 g nebo 0,1 ml	0,01 g nebo 0,01 ml	0,001 g nebo 0,001 ml
+	+	+	více než 10³
+	+	-	méně než 10³ a více než 10²
+	-	-	méně než 10² a více než 10
-	-	-	méně než 10

Escherichia coli
Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, ale místo tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 se použije tekutá půda A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. Obsah nádoby se protřepe a množství odpovídající 1 g nebo 1 ml zkoušeného výrobku se přenese do 100 ml půdy G a inkubuje se 18 h až 24 h při 43 °C až 45 °C. Vyočkuje se na agarovu půdu H a inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Nárůst červených, nemukózních kolonií gramnegativních tyčinek indikuje možnou přítomnost Escherichia coli. Ta se potvrdí vhodnými biochemickými zkouškami, jako je tvorba indolu. Výrobek vyhovuje zkoušce, jestliže žádné takovéto kolonie nejsou pozorovány nebo když jsou potvrzující biochemické zkoušky negativní.
Salmonella
Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, ale použije se místo tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 tekutá půda A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 24 h při 35 °C až 37 °C. 1 ml obohacené kultury se přenese do 10 ml tekuté půdy I a inkubuje se 18 h až 24 h při 41 °C až 43 °C. Potom se vyočkuje na nejméně dvě různé pevné půdy vybrané z agarové půdy J, agarové půdy K a agarové půdy L. Inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Pravděpodobná přítomnost salmonel je indikována růstem kolonií tohoto vzhledu:

- na půdě J:	dobře rozvinuté bezbarvé kolonie,
- na půdě K:	dobře rozvinuté červené kolonie s černým středem nebo bez něho,
- na půdě L:	malé průsvitné bezbarvé nebo růžové až matně bílé kolonie, často obklopené růžovou nebo červenou zónou.

K potvrzení nálezu se samostatně naočkuje několik podezřelých kolonií na povrch a vpichem do agarové půdy M. Přítomnost salmonel je předběžně potvrzena, jestliže uvnitř půdy, ale nikoliv na jejím povrchu, dojde ke změně barvy z červené na žlutou a obvykle též ke tvorbě plynu. Tvoří se nebo též netvoří sirovodík. Potvrzení se může zpřesnit vhodnými biochemickými a sérologickými zkouškami. Výrobek vyhovuje zkoušce, jestliže se nenajdou kolonie popsaného typu nebo jestliže jsou potvrzující biochemické a sérologické zkoušky negativní.
Pseudomonas aeruginosa
Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, a použije se 10 ml nebo množství odpovídající 1 g nebo 1 ml k naočkování do 100 ml tekuté půdy A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Potom se vyočkuje na misku s agarovou půdou N a inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Není-li zjištěn růst mikroorganismů, výrobek vyhovuje. Jestliže se objeví růst gramnegativních tyčinek, vhodné množství z morfologicky odlišných izolovaných kolonií se přenese do tekuté půdy A a inkubuje se 18 h až 24 h při 41 °C až 43 °C. Výrobek vyhovuje, jestliže při 41 °C až 43 °C není pozorován žádný růst.
Staphylococcus aureus
Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, a použije se 10 ml nebo množství odpovídající 1 g nebo 1 ml k naočkování do 100 ml tekuté půdy A, zhomogenizuje se a inkubuje se 18 h až 48 h při 35 °C až 37 °C. Vyočkuje se na misku s agarovou půdou O a inkubuje se 18 h až 72 h při 35 °C až 37 °C. Černé kolonie grampozitivních koků obklopené jasnou zónou indikují přítomnost S. aureus. Výsledek je možno potvrdit vhodnými biochemickými zkouškami, jako jsou koagulasová a deoxyribonukleasová zkouška. Výrobek vyhovuje zkoušce, jestliže se na agarové půdě O neobjeví popsaný typ kolonií nebo jestliže jsou ověřovací biochemické zkoušky negativní.
Růstové a selektivní vlastnosti půd a validace zkoušky
Dále uvedené zkoušky se provedou nejméně u každé šarže dehydrované tekuté půdy.
Postupuje se následujícím způsobem. Dále uvedené zkušební kmeny se 18 h až 24 h kultivují samostatně ve zkumavkách obsahujících vhodné tekuté půdy při 30 °C až 35 °C:

Staphylococcus aureus	např. ATCC 6538 (NCIB 9518, CIP 4.83, CCM 4516, CNCTC Mau 29/58): tekutá půda A,

Pseudomonas aeruginosa	např. ATCC 9027 (NCIB 8626, CIP 82.118, CCM 1961, CNCTC Ps 37/65): tekutá půda A,

Escherichia coli	např. ATCC 8739 (NCIB 8545, CIP 53.126, CCM 4517): tekutá půda A,
Salmonella typhimurium	nedoporučuje se žádný určitý kmen (může se použít nějaká pro člověka nepatogenní salmonela, např. Salmonella abony (NCTC 6017, CIP 80.39, CCM 4518): tekutá půda A.

Část roztoku každé kultury se zředí tlumivým roztokem s chloridem sodným a peptonem o pH 7,0 tak, aby suspenze obsahovala asi 1000 živých mikroorganismů v 1 ml. Smíchají se stejné díly od všech suspenzí a použije se 0,4 ml (přibližně 100 mikroorganismů od každého kmene) jako inokulum ve zkouškách na S. aureus, Ps. aeruginosa, E. coli a na Salmonelly, a to za přítomnosti i nepřítomnosti zkoušeného výrobku. Pro všechny mikroorganismy se má dosáhnout pozitivního výsledku.
Klostridie
Dále popsané zkoušky jsou určeny pro vymezené účely. První metoda je určena pro výrobky, u nichž je nezbytné vyloučit přítomnost patogenních klostridií a které je proto nutno zkoušet na jejich nepřítomnost. Tyto výrobky mají obecně nízký celkový počet mikroorganismů. Druhá metoda je semikvantitativním stanovením Clostridium perfringens a je určena pro přípravky, kde množství tohoto druhuje kritériem jejich kvality.
Ke kontrole se použijí tyto kmeny:

pro 1. metodu: Clostridium sporogenes, např.	ATCC 19404 (NCTC 532, CIP 79.3, CCM 4409, CNCTC Cl 66/79),

pro 2. metodu: Clostridium perfringens, např.	ATCC 13124 (NCIB 6125, NCTC 8237, CIP 103 409, CCM 4435, CNCTC Cl 68/83).

Je-li to nutné, použije se Clostridium sporogenes ke kontrole selektivity a anaerobních podmínek.
Následující část se uvádí pro informaci a jako návod, netvoří závaznou část lékopisu.
Doporučené živné půdy a roztoky
Následující roztok a živné půdy byly shledány dostatečnými pro účely, pro které jsou v lékopise předepsány pro zkoušku na mikrobiální znečištění. Jiné půdy mohou být použity, mají-li podobné výživné a selektivní vlastnosti pro mikroorganismy, které se mají zjišťovat.
Tlumivý roztok s chloridem sodným a s peptonem o pH 7,0

Dihydrogenfosforečnan draselný	3,6 g
Hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	7,2 g
Chlorid sodný	4,3 g
Pepton (z masa nebo kaseinu)	1,0 g
Voda	1000 ml

Mohou se přidat povrchově aktivní látky nebo látky inaktivující protimikrobní účinek, jako např.:

Polysorbát 80

1 g/l až 10 g/l.

Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.
Tekutá půda A (půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)

Pankreatický hydrolyzát kaseinu	17,0 g
Papainový hydrolyzát sóji	3,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Hydrogenfosforečnan draselný	2,5 g
Glukosa monohydrát	2,5 g
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 mm v autoklávu při 121 °C.
Agarová půda B (agarová půda s hydrolyzáty sóji a kaseinu)

Pankreatický hydrolyzát kaseinu	15,0 g
Papainový hydrolyzát sóji	5,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Agar	15,0 g
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.
Agarová půda C (Sabouraudův glukosový agar s antibiotiky)

Pepton (z masa a kaseinu)	10,0 g
Glukosa monohydrát	40,0 g
Agar	15,0 g
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 5,6 ± 0,2. Sterilizuje se 15 mm v autoklávu při 121 °C. Bezprostředně před použitím se přidá 0,10 g sodné soli benzylpenicillinu a 0,10 g tetracyklinu na 1 l půdy ve formě sterilního roztoku, nebo se přidá 50 mg chloramfenikolu na 1 l půdy před sterilizací.
Tekutá půda D (laktosová půda)

Masový výtažek	3,0 g
Pankreatický hydrolyzát želatiny	5,0 g
Laktosa monohydrát	5,0 g
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,9 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C a ihned se ochladí.
Obohacená tekutá půda E (Mosselova obohacená půda pro Enterobacteriaceae)

Pankreatický hydrolyzát želatiny	10,0 g
Glukosa monohydrát	5,0 g
Sušená hovězí žluč	20,0 g
Dihydrogenfosforečnan draselný	2,0 g
Hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	8,0 g
Zeleň brilantní	15 mg
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,2 ± 0,2. Zahřívá se 30 min při 100 °C a ihned se ochladí.
Agarová půda F (žlučový agar s glukosou, violetí krystalovou a červení neutrální)

Kvasničný výtažek	3,0 g
Pankreatický hydrolyzát želatiny	7,0 g
Žlučové soli	1,5 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Glukosa monohydrát	10,0 g
Agar	15,0 g
Červeň neutrální	30 mg
Violeť krystalová	2 mg
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,4 ± 0,2. Zahřeje se k varu; nelze zahřívat v autoklávu.
Tekutá půda G (MacConkeyova půda)

Pankreatický hydrolyzát želatiny	20,0 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Sušená hovězí žluč	5,0 g
Červeň bromkresolová	10 mg
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.
Agarová půda H (MacConkeyův agar)

Pankreatický hydrolyzát želatiny	17,0 g
Pepton (z masa a kaseinu)	3,0 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Žlučové soli	1,5 g
Agar	13,5 g
Červeň neutrální	30 mg
Violeť krystalová	1 mg
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,1 ± 0,2. Za stálého třepání se povaří 1 min a pak se sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C.
Tekutá půda I (tetrathionanová půda se žlučí a zelení brilantní)

Pepton	8,6 g
Sušená hovězí žluč	8,0 g
Chlorid sodný	6,4 g
Uhličitan vápenatý	20,0 g
Tetrathionan draselný	20,0 g
Zeleň brilantní	70 mg
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby bylo po zahřátí 7,0 ± 0,2. Zahřeje se právě k varu. Nelze opakovaně zahřívat.
Agarová půda J (deoxycholano-citronanový agar)

Masový výtažek	10,0 g
Pepton z masa	10,0 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Citronan sodný	20,0 g
Citronan železitý	1,0 g
Deoxycholan sodný	5,0 g
Agar	13,5 g
Červeň neutrální	20 mg
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,3 ± 0,2. Povaří se 1 min, ochladí na 50 °C a rozplní se do Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.
Agarová půda K (deoxycbolanový agar s xylosou a lysinem)

Xylosa	3,5 g
L-lysin	5,0 g
Laktosa monohydrát	7,5 g
Sacharosa	7,5 g
Chlorid sodný	5,0 g
Kvasničný výtažek	3,0 g
Červeň fenolová	80 mg
Agar	13,5 g
Desoxycholan sodný	2,5 g
Thiosíran sodný	6,8 g
Citronan amonno-železitý	0,8 g
Voda	1000 ml

pH se upraví tak, aby po zahřátí bylo 7,4 ± 0,2. Zahřeje se k varu, ochladí na 50 °C a rozplní se do Petriho misek. Nelze zahřívat v autoklávu.
Agarová půda L (agar se zelení brilantní, červení fenolovou, laktosou a sacharosou)

Pepton (z masa a kaseinu)	10,0 g
Kvasničný výtažek	3,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Sacharosa	10,0 g
Agar	20,0 g
Červeň fenolová	80 mg
Zeleň brilantní	12,5 mg
Voda	1000 ml

Povaří se 1 min. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,9 ± 0,2. Bezprostředně před použitím se sterilizuje 15 min v autoklávu při 121 °C, ochladí se na 50 °C a rozplní se do Petriho misek.
Agarová půda M (agarová půda se třemi cukry a železem)

Masový výtažek	3,0 g
Kvasničný výtažek	3,0 g
Pepton (z masa a kaseinu)	20,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Sacharosa	10,0 g
Glukosa monohydrát	1,0 g
Citronan amonno-železitý	0,3 g
Thiosíran sodný	0,3 g
Červeň fenolová	25 mg
Agar	12,0 g
Voda	1000 ml

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,4 ± 0,2. Rozplní se do zkumavek do 1/3 jejich výšky, sterilizuje se v autoklávu 15 min při 121 °C a ochladí se v takové poloze, při které má půda dostatečnou hloubku a šikmý povrch.
Agarová půda N (cetrimidový agar)

Pankreatický hydrolyzát želatiny	20,0 g
Chlorid hořečnatý	1,4 g
Síran draselný	10,0 g
Cetrimid	0,3 g
Agar	13,6 g
Voda	1000 ml
Glycerol	10,0 ml

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,2 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.
Agarová půda O (Baird-Parkerův agar)

Pankreatický hydrolyzát kaseinu	10,0 g
Masový výtažek	5,0 g
Kvasničný výtažek	1,0 g
Chlorid lithný	5,0 g
Agar	20,0 g
Glycin	12,0 g
Pyruvan sodný	10,0 g
Voda	950 ml

Za stálého třepání se zahřeje a 1 min se povaří. pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 6,8 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C, ochladí se na 45 °C až 50 °C a přidá se 10 ml sterilního roztoku teluričitanu draselného (10 g/l) a 50 ml emulze vaječného žloutku.
Živná půda P (obohacená půda pro klostridia)

Masový výtažek	10,0 g
Pepton	10,0 g
Kvasničný výtažek	3,0 g
Rozpustný škrob	1,0 g
Glukosa, monohydrát	5,0 g
Cysteiniumchlorid	0,5 g
Chlorid sodný	5,0 g
Octan sodný	3,0 g
Agar	0,5 g
Voda	1000 ml

Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za stálého míchání. Je-li třeba, upraví se pH tak, aby po sterilizaci bylo asi 6,8. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.
Půda Q (Columbia agar)

Pankreatický hydrolyzát kaseinu	10,0 g
Peptický hydrolyzát masa	5,0 g
Pankreatický hydrolyzát srdce	3,0 g
Kvasničný výtažek	5,0 g
Kukuřičný škrob	1,0 g
Chlorid sodný	5,0 g
Agar podle schopnosti tvořit gel	10,0 až 15,0 g
Voda	1000 ml

Agar se nechá nabobtnat a rozpustí se zahřátím k varu za stálého míchání. Je-li třeba, upraví se pH tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C. Ochladí se na 45 °C až 50 °C; je-li třeba, přidá se gentamiciniumsulfat v množství odpovídajícím 20 mg báze gentamicinu a rozplní se do Petriho misek.
Půda R (laktoso-siřičitanová půda)

Pankreatický hydrolyzát kaseinu	5,0 g
Kvasničný výtažek	2,5 g
Chlorid sodný	2,5 g
Laktosa monohydrát	10,0 g
Cysteiniumchlorid	0,3 g
Voda	1000 ml

Po rozpuštění se upraví pH na 7,1 ± 0,1 a rozplní se po 8 ml do zkumavek délky 160 mm a průměru 16 mm a obsahujících malou Durhamovu zkumavku. Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C a uchovává se při 4 °C. Před použitím se půda zahřívá 5 min ve vodní lázni a ochladí se. Do každé zkumavky se přidá 0,5 ml roztoku disiřičitanu sodného (12 g/l) a 0,5 ml roztoku citronanu železito-amonného (10 g/l). Oba roztoky se připraví v čas potřeby a filtrují se přes membránový filtr (0,45 μm).
Neutralizační činidla
Neutralizační činidla se mohou použít k neutralizaci protimikrobních účinků. Mohou se přidat k tlumivému roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0 přednostně před sterilizací. Jestliže se použijí, prokáže se jejich účinnost a že nejsou pro mikroorganismy toxické.
Typický neutralizační roztok má následující složení:

Polysorbát 80	30 g
Lecitin vaječný	3 g
Histidin hydrochlorid	1 g
Pepton (z masa nebo kaseinu)	1 g
Chlorid sodný	4,3 g
Dihydrogenfosforečnan draselný	3,6 g
Hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	7,2 g
Voda	1000 ml

Sterilizuje se 15 min v autoklávu při 121 °C.
Pokud má roztok nedostatečnou neutralizační schopnost, může se zvýšit množství polysorbátu 80 nebo lecitinu. Jako alternativa se mohou přidat inaktivující látky uvedené v tabulce 2.6.13-2.
Tab. 2.6.13-2 Látky inaktivující protimikrobní účinky, které se mohou přidat k tlumivému roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0

Druh protimikrobní látky	Inaktivující látka	Koncentrace	Poznámka
Fenoly	Laurylsulfat sodný Polysorbát 80 a lecitin Vaječný žloutek	4 g/l 30 g/l a 3 g/l 5 ml/l až 50 ml/l	Přidává se po sterilizaci tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0
Organické sloučeniny rtuti	Thioglykolat sodný	0,5 g/l až 5 g/l
Halogeny	Thiosíran sodný	5 g/l
Kvartérní amoniové sloučeniny	Vaječný žloutek	5 ml/laž 50 ml/l	Přidává se po sterilizaci tlumivého roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0

2.6.14 Bakteriální endotoxiny

Pět metod uvedených v tomto článku je určeno ke zjištění, zda koncentrace endotoxinu v přípravku, který má v lékopise článek obsahující limit pro bakteriální endotoxiny, vyhovuje tomuto limitu. Výrobci, kteří mají v úmyslu se přesvědčit, zda-li např. jejich výrobní postupy snižují koncentraci endotoxinu v přípravku během výroby, nejsou vázáni postupy uvedenými v tomto článku.
Ve zkoušce na bakteriální endotoxiny se používá lyzát z amebocytů ostrorepa, Limulus polyphemus (LAL test). Po přidání roztoku s obsahem endotoxinů k roztoku lyzátu vzniká ve směsi zákal, sraženina nebo gel. Rychlost reakce závisí na koncentraci endotoxinu, hodnotě pH a teplotě. K reakci je nutná přítomnost určitých dvojmocných kationtů, enzymatický komplex podporující srážení a srážlivý protein, které jsou obsaženy v lyzátu. Štěpení chromogenního peptidu v roztoku lyzátu po aktivaci endotoxiny obsaženými v roztoku lze též použít ke stanovení koncentrace endotoxinů z koncentrace uvolněného barviva.
V této kapitole je popsáno pět následujících metod:
Metoda A. Gelová metoda: limitní zkouška
Metoda B. Semikvantitativní gelová metoda
Metoda C. Turbidimetrická kinetická metoda
Metoda D. Chromogenní peptidová kinetická metoda
Metoda E. Chromogenní peptidová metoda konečného bodu
Jestliže je v článku uvedena zkouška na endotoxiny bez uvedení metody, provede se zkoušení gelovou metodou A, která byla pro přípravek validována. Jinak se zkouška provádí metodou validovanou pro přípravek a uvedenou v článku.
V článcích jsou uvedeny požadavky na bakteriální endotoxiny jako limitní koncentrace endotoxinu; přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže neobsahuje více endotoxinu, než je limitní koncentrace. Splnění tohoto požadavku může být ale doloženo jedině důkazem, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než limitní koncentrace endotoxinu.
Zkouška se provádí způsobem, který vylučuje mikrobiální kontaminaci.
Před provedením zkoušky na endotoxiny na zkoušeném přípravku je nutno ověřit:
- zda použité zařízení neadsorbuje endotoxiny,
- hodnotu lambda (λ) použitého lyzátu. Lambda je definována jako deklarovaná citlivost lyzátu uvedená na obalu (gelová metoda) nebo nejnižší koncentrace endotoxinu použitá při přípravě standardní křivky (kvantitativní metoda),
- nepřítomnost interferujících faktorů.
Je-li třeba, očistí se laboratorní zařízení od endotoxinů.
Není-li v článku pro přípravek, který je analyzován, uvedeno jinak, uplatňují se u všech pěti metod stejné požadavky popsané pro metodu A až metodu E.
V této stati jsou označením zkumavka míněny všechny druhy nádob, včetně jamek mikrotitrační destičky.
Ve zkoušce se používá tento referenční přípravek a tato zkoumadla.
Referenční endotoxin BRP. Je kalibrován v mezinárodních jednotkách (m.j.) porovnáním s mezinárodním standardem.
Lyzát z amebocytů limula. Je vyroben podle požadavků odpovědné autority země výrobce. Lyzát se rozpustí podle návodu. U každé šarže se ověří deklarovaná citlivost (λ,); ta je uvedena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru.
Voda pro LAL. Voda má požadovanou jakost, jestliže dává negativní výsledek v podmínkách předepsaných pro zkoušku na endotoxiny ve zkoušeném přípravku. Je možno ji připravit trojnásobnou destilací vody na přístroji vybaveném účinným zařízením, které zabraňuje hromadění kapek, nebo jinými prostředky dávajícími vodu požadované jakosti.
Kyselina chlorovodíková pro LAL 0,1 mol/l a hydroxid sodný pro LAL 0,1 mol/l. Připravují se z kyseliny chlorovodíkové R a hydroxidu sodného R a vody pro LAL. Obě látky jsou vhodné pro zkoušku, jestliže po úpravě pH na 6,0 až 8,0 dávají v podmínkách zkoušky negativní výsledek.
Není-li uvedeno jinak, ve zkoušce se pro přípravu roztoků a ředění použije voda pro LAL.
Gelové metody
Metody A a B jsou založeny na tvorbě pevného gelu v roztoku obsahujícím bakteriální endotoxiny po smíchání a inkubaci s lyzátem. U obou metod je požadováno ověřit citlivost lyzátu udanou výrobcem podle postupu uvedeného v části Citlivost lyzátu a prokázat nepřítomnost interferujících faktorů podle postupu uvedeného v části Interferující faktory.
Metody A a B se odlišují v tom, že metoda A ověřuje, zda oba vzorky zkoušeného přípravku obsahují méně endotoxinu, než je limit koncentrace endotoxinu uvedený v odpovídajícím článku, zatímco v metodě B se koncentrace endotoxinu ve zkoušeném přípravku stanoví semikvantitativně a geometrický průměr ve zkoušeném přípravku koncentrace endotoxinu je nižší, než je limit koncentrace endotoxinu uvedený v lékopisném článku.
Následující části: Postup, Citlivost lyzátu a Interferující faktory se používají u obou metod A a B.
Postup. Odpovídající objem lyzátu se nakape do všech zkumavek nebo jiných vhodných nádob (např. podložní sklo) vyhřátých na teplotu 37 °C ± 1 °C. V dostatečně dlouhých intervalech umožňujících odečtení jednotlivých výsledků se k jednotlivým lyzátům přidá stejný objem zkoušeného roztoku a ihned se opatrně smíchá s lyzátem. Reakční směs se za vyloučení vibrací a odpařování vody inkubuje po konstantní dobu, která byla stanovena experimentálně (obvykle 20 min až 60 min) a poté se odečtou výsledky. Jako pozitivní reakce se hodnotí tvorba pevného gelu, který se neporuší při opatrném převrácení nádoby. Výsledek je negativní, jestliže se takový gel nevytvoří.
Citlivost lyzátu. Připraví se nejméně čtyři sériová dvojnásobná ředění referenčního endotoxinu BRP tak, aby v jednotlivých ředěních byla dosažena koncentrace 2 λ, λ, 0,5 λ a 0,25 λ, kde λ je deklarovaná citlivost použitého lyzátu. Alespoň poslední ředění každé série dává negativní výsledek. Postupem uvedeným v části Postup zkoušky se zkouší všechna ředění a negativní kontrolní roztok, kterým je voda pro LAL. Vypočítá se průměr logaritmů nejnižší koncentrace endotoxinu, u které byla v každé sérii ředění zjištěna pozitivní reakce. Antilogaritmus tohoto průměru vyjadřuje citlivost lyzátu. Pokud se její hodnota neliší více než dvojnásobně od hodnoty deklarované, je uvedená citlivost potvrzena a používá se ve všech zkouškách prováděných s tímto lyzátem.
Interferující faktory. pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla mívá pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem. Postupuje se stejně, jak je popsáno v části Citlivost lyzátu, ale připraví se ředění referenčního endotoxinu BRP v neošetřených vzorcích zkoušeného přípravku, ve kterých již není endotoxin zjistitelný. Tyto vzorky se použijí ve zředění nepřesahujícím nejvyšší účinné ředění (MVD), které se vypočítá ze vzorce:

MVD = \frac{limitní koncentrace endotoxinu}{citlivost lyzátu},

kde jsou obě hodnoty vyjádřeny v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru.
Jestliže je limitní koncentrace endotoxinu v jednotlivém lékopisném článku uvedena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v miligramu přípravku nebo v mezinárodní jednotce přípravku, vynásobí se limit endotoxinu koncentrací přípravku ve zkoušeném roztoku (v miligramech v mililitru nebo v mezinárodních jednotkách zkoušeného přípravku v mililitru), aby se získala limitní koncentrace endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru zkoušeného přípravku. Výše popsaný postup násobení se použije u roztoků přípravků připravených rozpuštěním podle návodu uvedeného na obalu.
Jestliže se citlivost lyzátu stanovená v přítomnosti zkoušeného přípravku neliší více než dvojnásobně od citlivosti stanovené bez přítomnosti zkoušeného přípravku, pak přípravek neobsahuje faktory, které interferují v experimentálních podmínkách, a může se zkoušet bez dalších úprav. V opačném případě, kdy zkoušený přípravek působí inhibici nebo aktivaci, se interferující faktory odstraní vhodným způsobem, jako je ředění, filtrace, neutralizace, dialýza nebo přidání látek schopných uvolnit adsorbované endotoxiny. Použití citlivějšího lyzátu umožňuje vyšší ředění zkoušeného přípravku a usnadňuje tak odstranění interference.
Jestliže zkoušený přípravek nevyhovuje zkoušce v ředění nižším, než je MVD, zkouška se opakuje za použití MVD.
Ultrafiltraci je možno použít tehdy, jestliže interferující faktory procházejí filtrem s nominálním separačním limitem odpovídajícím relativní molekulové hmotnosti 10 000 až 20 000. Je možno použít asymetrické membránové filtry z triacetatcelulosy, které se však musí přezkoušet na přítomnost složek způsobujících falešně pozitivní výsledky. Látky zachycené na filtru, které obsahují endotoxin, se opláchnou vodou pro LAL nebo vhodným tlumivým roztokem a endotoxiny se získají ve vodě pro LAL nebo ve vhodném tlumivém roztoku. Pro každý zkoušený přípravek je stanoven zkoušený objem a konečný objem pro zpětné uvolnění endotoxinu.
Pro ověření, že zvolený způsob účinně odstraňuje interferenci a přitom neodstraňuje endotoxiny, se zkouška na interferující vlivy opakuje se zkoušeným přípravkem, ke kterému se přidá referenční endotoxin BRP a použije se jeden ze zvolených způsobů na odstranění interferujících faktorů.
METODA A. GELOVÁ METODA (LIMITNÍ ZKOUŠKA)
Zkouška na endotoxin ve zkoušeném přípravku. Provádí se dvojmo, jak je popsáno v části Postup zkoušky, při použití takového ředění, které nepřevyšuje maximální účinné ředění zkoušeného přípravku, který v případě nutnosti byl ještě podroben některému ze způsobů odstraňujících interferující faktory.
Zároveň se zkouší negativní kontrola tvořená z vody pro LAL a dvě pozitivní kontroly, které obsahují referenční endotoxin BRP v koncentraci odpovídající dvojnásobku deklarované citlivosti lyzátu a z nichž jedna obsahuje zkoušený přípravek (podrobený, je-li třeba, postupu k odstranění interferujících faktorů po přidání referenčního endotoxinu) v koncentraci použité ve zkoušce. Zkoušku lze hodnotit, jestliže negativní a obě pozitivní kontroly dávají odpovídající výsledek.
Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže obě zkoušené směsi dávají negativní výsledek. Zkoušený přípravek nevyhovuje zkoušce, jestliže obě zkoušené směsi dávají pozitivní výsledek. Jestliže je pozitivní výsledek pouze v jedné zkoušené směsi ave druhé negativní, zkouška se opakuje; zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže v obou zkoušených směsích je zjištěn negativní výsledek.
METODA B. SEMIKVANTITATIVNÍ GELOVÁ METODA
Stanovení endotoxinů ve zkoušeném přípravku. Je-li třeba, vzorky určené ke zkoušení se zpracují postupem odstraňujícím interferující faktory. Připraví se tyto roztoky:
Zkouška se provede postupem uvedeným v části Citlivost lyzátu. Zkoušku lze hodnotit, jsou-li splněny tři následující podmínky:
- výsledek v roztoku (d) je negativní,
- výsledky v roztocích (c) jsou pozitivní,
- geometrický průměr koncentrace endotoxinu v roztocích (b) je v rozmezí 1/2 λ až 2 λ.
Pro každé ředění (a) se stanoví nejnižší koncentrace přípravku, která dává pozitivní výsledek, tedy obsahuje 1 m.j. endotoxinu v mililitru. Jestliže byl původní roztok zkoušeného přípravku ředěn faktorem d₁ aby vyhověl zkoušce na interferující faktory, a tento roztok byl dále ředěn faktorem d₂ k získání nejnižší koncentrace s pozitivním výsledkem, pak množství endotoxinu v m.j./ml v původním roztoku zkoušeného přípravku se rovná λ x d₁ x d₂. Vypočítá se geometrický průměr ze dvou výsledků obou ředění (a). Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže geometrický průměr koncentrací endotoxinu je nižší než limitní koncentrace endotoxinu uvedená v příslušném článku.
Kinetické metody
Obě metody, turbidimetrická kinetická (metoda C) a chromogenní peptidová kinetická metoda (metoda D) používají lineární regresi logaritmu odpovědi na logaritmu koncentrace endotoxinu. Způsob provedení je uveden v části Postup pro každou metodu zvlášť; části Ověření parametrů standardní křivky, Interferující faktory a Stanovení endotoxinu ve zkoušeném přípravku jsou vhodné jak pro turbidimetrickou kinetickou metodu, tak pro chromogenní peptidovou kinetickou metodu.
METODA C. TURBIDIMETRICKÁ KINETICKÁ METODA
Postup. Vhodným zařízením se měří reakční čas potřebný k dosažení předem určeného stupně zákalu v roztoku, ke kterému byl vhodným způsobem přidán lyzát Koncentrace endotoxinu v roztoku se vypočítá z logaritmu reakčního času a kalibrační křivky. Postup pro přípravu kalibrační křivky je uveden v části Ověření parametrů standardní křivky.
Rychlost změny zákalu v lineární části regresní křivky se též může použít ke stanovení koncentrace endotoxinu.
METODA D. CHROMOGENNÍ PEPTIDOVÁ KINETICKÁ METODA
Postup. Měří se reakční čas potřebný k dosažení předem určené intenzity zbarvení po uvolnění barviva z vhodného chromogenního peptidu komplexem endotoxin-lyzát; zbarvení se stanoví spektrofotometricky při vhodné vlnové délce. Koncentrace endotoxinu v roztoku se odvodí z logaritmu reakčního času pomocí kalibrační křivky. Postup pro přípravu kalibrační křivky je uveden v části Ověření parametrů standardní křivky.
METODA C A METODA D
Ověření parametrů standardní křivky. Požaduje se vždy při použití nové šarže lyzátu nebo při změně podmínek, které by mohly ovlivnit výsledek zkoušky.
Připraví se nejméně dvě samostatné řady, každá nejméně o čtyřech koncentracích referenčního endotoxinu BRP v požadovaném rozsahu. Limity uvedené výrobcem by se neměly překročit. Použije se nejméně jedna koncentrace na jednu jednotku v logaritmické stupnici a jako negativní kontrola voda pro LAL. Do každé zkumavky se přidá stejný objem lyzátu a u metody D vhodné množství chromogenního peptidu. Měří se reakční čas, jak bylo uvedeno výše.
Pro každou zkumavku se stanoví logaritmus reakčního času jako funkce logaritmu koncentrace endotoxinu a analyzuje se regrese logaritmu reakčního času na logaritmu koncentrace endotoxinu za použití standardní metody (metoda nejmenších čtverců).
Regresní křivka má signifikantní sklon a je signifikantně lineární; obojí na 95% hladině významnosti pro rozmezí koncentrací endotoxinu uvedené výrobcem lyzátu.
Stanoví se počet logaritmicky stejně vzdálených koncentrací, pro které je regresní křivka lineární. Je-li tímto číslem trojice (λ₁, λ₂, λ₃), použije se druhá koncentrace λ₂ jako λ_m ve zkoušce na interferující faktory a ve stanovení endotoxinů ve zkoušeném přípravku. Jestliže je toto číslo rovno 4 nebo 5, použije se v tomto případě třetí koncentrace λ₃ jako λ_m.
Kromě těchto požadavků se dodržují všechny další zkoušky nebo požadavky uvedené výrobcem lyzátu.
Interferující faktory. Připraví se čtyři samostatná ředění roztoku obsahujícího referenční endotoxin BRP v koncentraci λ_m a zkoušený přípravek ředěný faktorem vypočítaným podle vzorce:

\frac{limitní koncentrace endotoxinu}{λ_{m}} .

Hodnota pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla je pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem. Zkouška se provede se čtveřicí roztoků a vypočítá se průměrná koncentrace endotoxinu jako antilogaritmus průměrné logaritmické koncentrace endotoxinu.
Jestliže je průměrná koncentrace endotoxinu nejméně 50 % hodnoty λ_m zkoušený přípravek neobsahuje faktory, které by interferovaly s lyzátem v podmínkách zkoušky, a vzorky tohoto přípravku se mohou zkoušet bez dalších úprav k vyloučení interferujících faktorů.
Je-li průměrná koncentrace endotoxinu nižší než 50 % hodnoty λ_m je nutno odstranit interferující faktory, jak je uvedeno v metodě A. Jestliže průměrná koncentrace přesahuje nej vyšší koncentraci v lineární části regresní křivky, zkouška se opakuje za použití vyššího ředícího faktoru pro zkoušený přípravek vypočítaného podle vzorce:

\frac{limitní koncentrace endotoxinu}{λ_{m}},

kde λ_l<λ_mˊ< λ_m
Stanovení endotoxinů ve zkoušeném přípravku. Nejprve se, je-li to třeba, odstraní ze zkoušeného přípravku interferující faktory. Hodnota pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla je pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem.
Připraví se tyto roztoky:
Provede se zkouška postupem uvedeným v části Ověření parametrů standardní křivky. Vypočítá se koncentrace endotoxinu pro každou dvojici roztoků (a) a (b) pomocí regresní křivky připravené z kontrolní série (c).
Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou splněny tři následující podmínky:
- výsledek negativní kontroly (d) nepřevyšuje limit pro slepou hodnotu naměřenou při validaci citlivosti lyzátu,
- výsledky kontrolní série (c) vyhovují požadavkům uvedeným v Ověření parametrů standardní křivky,
- množství endotoxinu, vypočítané z geometrického průměru koncentrace endotoxinu v roztocích (b) po odečtení geometrického průměru koncentrace endotoxinu roztoků (a), je vyšší než 50 % a nižší než 200 %. Vypočítá se množství v procentech jako podíl výsledku po odečtení λ_m nebo λ_mˊ(podle toho, která hodnota byla použita) a výsledek se násobí 100.
Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže koncentrace každého z dvojice roztoků (a) je nižší než λ_m nebo λ_mˊ mezinárodních jednotek endotoxinu v mililitru podle toho, která hodnota byla použita. Jestliže koncentrace endotoxinu jednoho z dvojice roztoků je nižší a druhá vyšší než tento limit, zkouška se opakuje. Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže oba roztoky (a) vyhovují limitu.
METODA E. CHROMOGENNÍ PEPTIDOVÁ METODA KONEČNÉHO BODU
Postup. Při vhodné vlnové délce se měří spektrometrem koncentrace barviva uvolněného po inkubaci z roztoku obsahujícího endotoxin, lyzát a chromogenní peptid. Koncentrace endotoxinu se vypočítá z absorbace při zvolené vlnové délce pomocí kalibrační křivky připravené postupem uvedeným v části Ověření parametrů standardní křivky.
Ověření parametrů standardní křivky. Požaduje se vždy při použití nové šarže lyzátu nebo při změně podmínek, které by mohly ovlivnit výsledek zkoušky.
Připraví se čtyři samostatné řady referenčního endotoxinu BRP ve vodě pro LAL tak, aby přesahovala rozmezí uvedené výrobcem lyzátu; rozmezí má obsahovat limit (λ) deklarovaný výrobcem. Použije se kontrolní roztok připravený podle návodu výrobce lyzátu.
Do každé zkumavky se přidají předepsaná množství lyzátu a chromogenního peptidu a směs se inkubuje po dobu stanovenou výrobcem.
Reakce se zastaví a měří se absorbance při vhodné vlnové délce.
Pro každou zkumavku v každé čtveřici ředění se do grafu zaznamená absorbance každé koncentrace jako funkce koncentrace endotoxinu a analyzuje se regrese absorbance na koncentraci použitím standardní analytické metody (metoda nejmenších čtverců). Regresní křivka má signifikantní sklon a je lineární, obojí na 95% hladině významnosti pro rozmezí koncentrací endotoxinu uvedených výrobcem lyzátu. Vypočítá se koncentrace endotoxinu λ_m, což je aritmetický průměr nejvyšší (λ_h) a nejnižší (λ_l) koncentrace endotoxinu, při které je regresní křivka lineární. Všechny hodnoty se uvedou v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru.
Kromě těchto požadavků se dodržují všechny další zkoušky nebo požadavky uvedené výrobcem lyzátu.
Interferující faktory. Připraví se čtyři samostatná ředění roztoku obsahujícího referenční endotoxin BRP v koncentraci λ_m a zkoušený přípravek ředěný faktorem vypočítaným podle vzorce:

\frac{limitní koncentrace endotoxinu}{λ_{m}},

Hodnota pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla je pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem.
Zkouška se provede se čtveřicí roztoků a vypočítá se průměrná koncentrace endotoxinu.
Jestliže je průměrná koncentrace endotoxinu nejméně 50 % a nejvýše 200 % hodnoty λ_m, zkoušený přípravek neobsahuje faktory, které by interferovaly s lyzátem v podmínkách zkoušky, a vzorky tohoto přípravku mohou být zkoušeny bez dalších úprav k vyloučení interferujících faktorů.
Je-li průměrná koncentrace endotoxinu nižší než 50 % nebo vyšší než 200 % hodnoty λ_m, je nutno odstranit interferující faktory, jak je uvedeno v metodě A.
Jestliže průměrná koncentrace přesahuje nejvyšší koncentraci v lineární části regresní křivky, zkouška se opakuje za použití vyššího ředícího faktoru pro zkoušený přípravek vypočítaného podle vzorce:

\frac{limitní koncentrace endotoxinu}{λ_{m}},

kde λ_l<λ_mˊ< λ_m_.
Stanovení endotoxinu ve zkoušeném přípravku. Nejprve se, je-li to třeba, odstraní ze zkoušeného přípravku interferující faktory. Hodnota pH roztoku má být v rozmezí stanoveném výrobcem lyzátu. Zpravidla je pH v rozmezí 6,0 až 8,0. Je-li třeba, upraví se pH vzorku před přidáním lyzátu kyselinou chlorovodíkovou pro LAL 0,1 mol/l nebo hydroxidem sodným pro LAL 0,1 mol/l nebo vhodným tlumivým roztokem.
Připraví se tyto roztoky:
Provede se zkouška postupem uvedeným v části Ověření parametrů standardní křivky. Po inkubaci se ve všech roztocích (a), (b), (c) a (d) změří absorbance. Absorbance roztoků (c) a (d) se použije pro výpočet regresní křivky a vypočítá se koncentrace endotoxinu v roztocích (a) a (b). Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou splněny tři následující podmínky:
- výsledek negativní kontroly (d) nepřevyšuje limit pro slepou hodnotu naměřenou při validaci citlivosti lyzátu,
- výsledky kontrolních roztoků (c) vyhovují požadavkům pro kalibrační křivky použité pro ověření citlivosti lyzátu,
- množství endotoxinu, vypočítané z aritmetického průměru koncentrací endotoxinu v roztocích (b) po odečtení aritmetického průměru koncentrace endotoxinu roztoků (a), je vyšší než 50 % a nižší než 200 %. Vypočítá se procento množství v procentech jako podíl výsledku po odečtení λ_m nebo λ_mˊ podle toho, která hodnota byla použita, a výsledek se násobí 100.
Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže koncentrace každého z dvojice roztoků (a) je nižší než λ_m nebo λ_m_ˊ mezinárodních jednotek endotoxinu v mililitru podle toho, která hodnota byla použita. Jestliže koncentrace endotoxinu jednoho z dvojice roztoků je nižší a druhá vyšší než tento limit, zkouška se opakuje. Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže oba roztoky (a) vyhovují limitu.
Následující část je uvedena pro informaci a jako návod, netvoří závaznou součást lékopisu.
Zkouška na bakteriální endotoxin: směrnice

2.6.16 Důkaz cizích antigenů v humánních virových vakcínách

Pokud tyto zkoušky vyžadují nejprve neutralizaci viru, použijí se specifické protilátky, které nejsou humánního ani opičího původu: jestliže byl virus pomnožen na tkáni ptačího původu, nemohou to být ani protilátky ptačího původu. K přípravě antiséra se užívá imunizační antigen připravený na buněčné kultuře z odlišného druhu, než je kultura užívaná pro přípravu vakcíny a prosté cizích agens. Jestliže je předepsáno použití SPF vajec, tato vejce se získávají z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2).
Virové inokulum
Vzorky virového inokula se odeberou při sklizni, a jestliže se ihned nezkoušejí, uchovávají se při teplotě nižší než –40 °C.
Dospělé myši. Každé z nejméně deseti dospělých myší o hmotnosti 15 g až 20 g se vstříkne intracerebrálně 0,03 ml a intraperitoneálně 0,5 ml virového inokula. Myši se pozorují nejméně 21 dní. U všech myší uhynulých po uplynutí prvních 24 h, nebo které mají příznaky nemoci, se provede pitva, aby se odhalily známky infekčního onemocnění. Postupuje se jednak makroskopickým pozorováním, jednak přeočkováním vhodné tkáňové suspenze intracerebrálně a intraperitoneálně nejméně dalším pěti dospělým myším, které se pozorují 21 dní. Virové inokulum vyhovuje, jestliže žádná myš nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných myší.
Sající myši. Každé z nejméně dvaceti myší mladších než 24 h se vstříkne intracerebrálně 0,01 ml a intraperitoneálně 0,1 ml virového inokula. Myši se pozorují denně nejméně 14 dní. U všech myší uhynulých po uplynutí prvních 24 h, nebo které mají příznaky nemoci, se provede pitva, aby se odhalily známky infekčního onemocnění. Postupuje se jednak makroskopickým pozorováním, jednak přeočkováním vhodné tkáňové suspenze intracerebrálně a intraperitoneálně nejméně dalším pěti sajícím myším, které se denně pozorují 14 dní. Virové inokulum vyhovuje, jestliže žádná sající myš nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných sajících myší.
Morčata. Nejméně pěti morčatům o hmotnosti 350 g až 450 g se vstříkne intraperitoneálně po 5 ml virového inokula. Zvířata se pozorují nejméně 42 dní, aby se odhalily všechny příznaky nemoci. U všech zvířat, která po uplynutí prvních 24 h uhynou, nebo která mají příznaky nemoci, se provede pitva s makroskopickým vyšetřením; tkáně se vyšetří mikroskopicky a kultivačně na přítomnost infekce. Zvířata, která přežila dobu pozorování, se usmrtí a vyšetří se stejným způsobem. Virové inokulum vyhovuje, jestliže žádné morče nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných morčat.
Virové inokulum a sklizený virus
Vzorky se odeberou při sklizni, a jestliže se ihned nezkoušejí, uchovají se při teplotě nižší než –40 °C.
Bakteriální a houbová sterilita. 10 ml vzorku vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).
Mykoplazmata. 10 ml vzorku vyhovuje zkoušce na mykoplazmata (2.6.7).
Mykobakterie (2.6.2). 5 ml vzorku se zkouší na přítomnost Mycobacterium spp. kultivačními metodami uznanými za citlivé pro detekci těchto organismů.
Zkoušky na jiná cizí agens na tkáňových kulturách. Množství neutralizovaného vzorku, jestliže není předepsáno jinak, které odpovídá 500 lidských dávek nebo 50 ml vakcíny, podle toho, co je více, se zkouší na přítomnost cizích agens naočkováním do kultur buněk kontinuální linie opičí ledviny a lidských buněk. Jestliže virus rostl na lidských diploidních buňkách, neutralizovaný sklizený virus se také zkouší na oddělené kultuře diploidních buněk. Jestliže byl vakcinační virus pomnožován v buněčném systému jiném než opičím nebo lidském, naočkují se také buňky tohoto druhu, ale z odlišné šarže. Tyto buňky se kultivují při 36 °C ± 1 °C a prohlížejí se 14 dní. Virové inokulum nebo sklizený virus vyhovují, jestliže žádná z buněčných kultur nevykazuje známky přítomnosti jakéhokoli cizího agens, jež nelze přičíst náhodné kontaminaci. Zkoušku lze hodnotit, jestliže přežívá nejméně 80 % buněčných kultur.
Ptačí viry (pouze pro viry pomnožené na tkáni ptačího původu). Neutralizuje se množství vzorku odpovídající bud’ 100 lidským dávkám, nebo 10 ml, podle toho, co je více. Na jedno kuřecí embryo se použije 0,5 ml. Skupina oplozených SPF vajec 9 až 11 dní starých se inokuluje alantoidní cestou a druhá skupina, 5 až 7 dní starých, do žloutkového vaku. Inkubuje se 7 dní. Virové inokulum nebo sklizený virus vyhovují, jestliže alantoidní tekutiny ani tekutiny žloutkového vaku nevykazují přítomnost hemaglutinačního agens a jestliže všechna embrya a chorioalantoidní membrány makroskopicky vyšetřené, jsou normální. Zkoušku lze hodnotit, jestliže nejméně 80 % embryí přežije 7 dní.
Kultura produkčních buněk: kontrolní buňky
Aby se ověřila nepřítomnost virů způsobujících cytopatickou degeneraci, posuzují se kontrolní buňky mikroskopicky buď po celou dobu inkubace, nebo po nejméně 14 dní od naočkování výrobních nádob, podle toho, která doba je delší. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % kontrolních kultur.
Po 14 dnech nebo v čase poslední sklizně, podle toho, které období je delší, se provedou dále popsané zkoušky.
Zkouška na hemadsorbující viry. Nejméně 25 % kontrolních kultur se zkouší na přítomnost hemadsorbujících virů přidáním morčecích červených krvinek. Jestliže jsou morčecí krvinky skladovány, uchovávají se nejdéle 7 dní při 5 °C ± 3 °C. Polovina kultur se odečítá po 30 min inkubace při 5 °C ± 3 °C, druhá polovina po 30 min inkubace při 20 °C až 25 °C. Nezjistí se přítomnost hemadsorbujících agens.
Zkouška na jiná cizí agens v tkáňových kulturách. Směs supernatantních tekutin z kontrolních buněk se zkouší na přítomnost cizích agens naočkováním do kultur buněk opičí ledviny a lidských buněk. Jestliže byl vakcinační virus pomnožován v buněčném systému jiném než opičím nebo lidském, naočkují se také buňky tohoto druhu, ale z odlišné šarže. V každém buněčném systému se zkouší nejméně 5 ml. Naočkované kultury se inkubují při 36 °C ± 1 °C a pozorují se 14 dní. Nezjistí se přítomnost cizího agens.
Jestliže se kultura produkčních buněk uchovává při jiné teplotě než 36 °C ± 1 °C, provede se doplňující zkouška na cizí agens při produkční teplotě na buňkách stejného typu, jaký se použil pro pomnožení viru.
Viry ptačí leukózy (pouze pro viry pomnožené na tkáni ptačího původu). Zkouška na viry ptačí leukózy se provede s 5 ml supernatantní tekutiny z kontrolních buněk.
Kontrolní vejce
Hemaglutinační agens. 0,25 ml alantoidní tekutiny z každého vejce se zkouší na přítomnost hemaglutinačního agens přímým smísením s kuřecími červenými krvinkami. Po pasáži na SPF vejcích se postupuje takto: 5 ml vzorku ze směsi amniových tekutin z kontrolních vajec se naočkuje po 0,5 ml do alantoidních dutin a do amniových dutin SPF vajec. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže se v žádné z obou zkoušek nezjistí známky přítomnosti hemaglutinačních agens.
Viry ptačí leukózy. Použije se 10 ml směsné amniové tekutiny z kontrolních vajec. Provede se rozhojnění pěti pasážemi na buněčných kulturách z kuřecích embryí, které prokazatelně neobsahují viry ptačí leukózy; zkouška na přítomnost ptačí leukózy se provede použitím buněk z páté pasáže. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže se zkouškou neprokážou žádné známky přítomnosti viru ptačí leukózy.
Ostatní cizorodá agens. 5 ml směsné amniotické tekutiny z kontrolních vajec se naočkuje do lidských a opičích buněčných kultur. Buněčné kultury se pozorují 14 dní. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže se nezjistí přítomnost cizích agens. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % naočkovaných kultur.

2.6.21 Techniky amplifikace nukleových kyselin

(1) Infuze z hovězího srdce

hovězí srdce (pro přípravu infuze)	500 g
pepton	10 g
chlorid sodný	5 g
destilovaná voda do	1000 ml
Sterilizuje se v autoklávu.

(2) Esenciální vitaminy

biotin	100 mg
pantotenan vápenatý	100 mg
choliniumchlorid	100 mg
kyselina listová	100 mg
i-inositol	200 mg
nikotinamid	100 mg
pyridoxoliumchlorid	100 mg
riboflavin	10 mg
thiaminiumchlorid	100 mg
destilovaná voda do	1000 ml

(3) Ionagar
Velmi čistý agar používaný pro mikrobiologii a imunologii se připravuje výměnou iontů, čímž vzniká produkt mající vyšší čistotu, čirost a pevnost gelu.
Obsahuje přibližně:

voda	12,2 %
popel	1,5 %
popel nerozpustný v kyselině	0,2 %
chloridy	0
fosforečnany (jako P₂O₅)	0,3 %
celkový dusík	0,3 %
měď	8 μg/g
železo	170 μg/g
vápník	0,28 %
hořčík	0,32 %

(4) Tlumivý solný roztok podle Hankse (modifikovaný)

chlorid sodný	60,4 g
chlorid draselný	0,32 g
síran hořečnatý heptahydrát	0,08 g
chlorid hořečnatý hexahydrát	0,08 g
chlorid vápenatý bezvodý	0,112 g
hydrogenfosforečnan sodný dihydrát	0,0596 g
dihydrogenfosforečnan draselný, bezvodý	0,048 g
destilovaná voda do	800 ml

(5) Infuze ze srdce a mozku

infuze z telecího mozku	200 g
infuze z hovězího srdce	250 g
pepton (enzymaticky připravený)	10 g
glukosa	2 g
chlorid sodný	5 g
hydrogenfosforečnan sodný, bezvodý	2,5 g
destilovaná voda do	1000 ml

(6) PPLO tekutá půda

infuze z hovězího srdce	50 g
pepton	10 g
chlorid sodný	5 g
destilovaná voda do	1000 ml

a) údaje o mikrobiologické kontrole prostředí, ve kterém jsou prováděny zkoušky na sterilitu, odhalí chybu,

a) Tekutá půda

infuze z hovězího srdce (1)	90,0 ml
koňské sérum (nezahřáté)	20,0 ml
roztok kvasničného výtažku (250 g/l)	10,0 ml
roztok octanu thallného (10 g/l)	1,0 ml
roztok červeně fenolové (0,6 g/l)	5,0 ml
roztok penicilinu (20 000 m.j./ml)	0,25 ml
roztok kyseliny deoxyribonukleové (2 g/l)	1,2 ml
pH se upraví na 7,8.

a) Tekutá půda

infuze z hovězího srdce (1)	90,0 ml
esenciální vitaminy (2)	0,025 ml
roztok glukosy monohydrátu (500 g/l)	2,0 ml
prasečí sérum (inaktivované 30 min při 56 °C)	12,0 ml
roztok β-nikotinamid-adeninu dinukleotidu (10 g/l)	1,0 ml
roztok cysteiniumchloridu (10 g/l)	1,0 ml
roztok červeně fenolové (0,6 g/l)	5,0 ml
roztok penicilinu (20 000 m.j./ml)	0,25 ml

Smíchají se roztoky β-nikotinamid-adeninu dinukleotidu a cystemiumchloridu a za 10 mm se přidají k ostatním složkám.
pH se upraví na 7,8.

a) Tekutá půda

tlumivý solný roztok podle Hankse (modifikovaný) (4)	800 ml
destilovaná voda	67 ml
infuze ze srdce a mozku (5)	135 ml
PPLO tekutá půda (6)	248 ml
roztok kvasničného výtažku (170 g/l)	60 ml
bacitracin	250 mg
meticilin	250 mg
roztok červeně fenolové (5 g/l)	4,5 ml
roztok octanu thallného (56 g/l)	3 ml
koňské sérum	165 ml
prasečí sérum	165 ml
pH se upraví na 7,4 až 7,45.

a) dva samostatně připravené roztoky zkoušeného přípravku v ředění použitém ke kontrole odstranění interferujích faktorů. Použije se voda pro LAL k přípravě dvou nezávislých sériových ředění zkoušeného vzorku po čtyřech zkumavkách v koncentraci 1, 1/2, 1/4 a 1/8 ve vztahu k ředění, se kterým byla provedena kontrola na odstranění interferujících faktorů,

a) dvojice samostatně připravených roztoků zkoušeného přípravku ve stejném ředění jaké bylo použito ke kontrole odstranění interferujících faktorů,

a) dva samostatně připravené roztoky zkoušeného přípravku v ředění použitém ke kontrole odstranění interferujících faktorů,

a) má-li se na sterilitu zkoušet nový přípravek,

b) prověření testovacího postupu užitého během předmětné zkoušky odhalí chybu,

b) Pevná půda
Připraví se stejně jako tekutá půda s tím rozdílem, že infuze z hovězího srdce obsahuje v litru 15 g agaru.

b) Pevná půda

infuze z hovězího srdce (1)	90,0 ml
ionagar (3)	1,4 g
pH se upraví tak, aby bylo 7,8, sterilizuje se v autoklávu a pak se přidají:
esenciální vitaminy (2)	0,025 ml
roztok glukosy monohydrátu (500 g/l)	2,0 ml
prasečí sérum (nezahřáté)	12,0 ml
roztok B-nicotinamid-adeninu dinukleotidu (10 g/l)	1,0 ml
roztok cysteiniumchloridu (10 g/l)	1,0 ml
roztok červeně fenolové (0,6 g/l)	5,0 ml
roztok penicilinu (20 000 m.j./ml)	0,25 ml

b) Pevná půda

Tlumivý solný roztok podle Hankse (modifikovaný) (4)	200 ml
DEAE - dextran	200 mg
ionagar (3)	15,65 g

Dobře se promíchá a sterilizuje v autoklávu. Ochladí se na 100 °C a přidá se do 1740 ml tekuté půdy popsané výše.

b) dvě řady po čtyřech zkumavkách obsahující vodu pro LAL a referenční endotoxin BRP v koncentraci 2 λ, λ, 1/2 λ, a 1/4 λ,

b) dvojice samostatně připravených roztoků obsahujících referenční endotoxin BRP v koncentraci λ_m nebo λ_m_ˊ podle toho, která je třeba, a zkoušený přípravek v ředění, jak je uvedeno v bodě a),

b) dva samostatně připravené roztoky obsahující referenční endotoxin BRP v koncentraci λ_m nebo λ_mˊ podle toho, která je třeba, a zkoušený přípravek v ředění, jak je uvedeno v bodě a),

b) kdykoliv se změní experimentální podmínky zkoušky.

c) dvojici zkumavek se zkoušeným přípravkem v samostatně připraveném ředění, které bylo použito ke kontrole na interferující faktory a s referenčním endotoxinem BRP o koncentraci 2 λ,

c) tři logaritmicky stejně vzdálené koncentrace referenčního endotoxinu BRP pokrývající lineární část regresní křivky. Každé ředění se připraví dvakrát,

c) dvojice roztoků referenčního endotoxinu BRP o koncentraci λ_h a dvojice roztoků o koncentraci λ_l,

c) mikrobiální růst se objeví v negativních kontrolách,

d) voda pro LAL (jako negativní kontrola).

d) voda pro LAL jako negativní kontrola.

d) po identifikaci mikroorganismů izolovaných zkouškou může být růst tohoto nebo těchto druhů jednoznačně připsán chybám materiálu nebo metody užitých při provádění zkoušky na sterilitu.

1. Připraví se kultura v pravidelné hustotě (2 · 10⁴ až 2 · 10⁵ buněk v mililitru, 4 · 10³ až 2,5 · 10⁴buněk/cm²) a inkubuje se při 36 °C ± 1 °C nejméně dva dny. Naočkuje se zkoušený přípravek a inkubuje nejméně dva dny. Provede se nejméně jedna subkultivace. Poslední subkultura se pěstuje na krycím sklíčku ve vhodné nádobě nebo na nějakém jiném povrchu vhodném pro postup zkoušky. U poslední subkultury se nenechá dojít ke splývání nárůstu, protože by to mohlo inhibovat barvení a narušit zobrazení mykoplazmat.

1. Zkouška na klostridie. Zkoušený výrobek se zpracuje tak, jak je popsáno v obecné metodě (2.6.12). Připraví se dvě stejné dávky odpovídající 1 g nebo 1 ml zkoušeného výrobku. Jedna dávka se zahřívá 10 min na 80 °C a potom se rychle ochladí. Po protřepání se z ní naočkuje 10 ml do zkumavky (38 mm x 200 mm) nebo do jiné vhodné nádoby obsahující 100 ml živné půdy P. Druhá dávka se nezahřívá a naočkuje se stejným způsobem do druhé zkumavky. Obě zkumavky se inkubují za anaerobních podmínek 48 h při 35 °C až 37 °C. Po inkubaci se obě zkumavky vyočkují na tekutou půdu Q, do níž byl přidán gentamicin a inkubují se opět 48 h při 35 °C až 37 °C. Výrobek vyhovuje, jestliže není pozorován růst mikroorganismů.
Je-li pozorován růst, přeočkuje se každá odlišná kolonie na tekutou půdu Q bez gentamicinu a inkubuje se ža aerobních a anaerobních podmínek. Dojde-li jenom k anaerobnímu růstu grampozitivních tyčinek (s endosporami nebo bez nich) s negativní katalasovou reakcí, indikuje to přítomnost rodu Clostridium. Je-li to nutné, porovná se růst kolonií na obou plotnách a použije se katalasová zkouška k vyloučení aerobních a fakultativně anaerobních druhů rodu Bacillus, které dávají pozitivní katalasovou reakci. Tato zkouška může být provedena na rozlišení stejných kolonií na agarové půdě nebo nepřímo po přenesení kolonie na podložní sklíčko přidáním kapky peroxidu vodíku zředěného RS. Tvorba bublinek plynu indikuje pozitivní katalasovou reakci.

1. Úvod
Endotoxiny pocházející z gramnegativních bakterií jsou nejčastější příčinou toxických reakcí přisuzovaných kontaminaci farmaceutických přípravků pyrogenními látkami; pyrogenní účinnost endotoxinů je mnohem vyšší než účinnost jiných pyrogenních látek. Endotoxiny jsou lipopolysacharidy. Ačkoli množství pyrogenních látek s odlišnou strukturou je malé, obecně platí, že nepřítomnost bakteriálních endotoxinů v přípravku je známkou absence pyrogenních složek za předpokladu, že lze vyloučit přítomnost neendotoxinových pyrogenních látek.
Přítomnost endotoxinů v přípravku může být zakryta faktory interferujícími s reakcí mezi amebocytárním lyzátem a endotoxiny. Proto analytik, chce-li nahradit zkoušku na pyrogenní látky na králících, která je požadována lékopisným článkem, zkouškou na endotoxin, prokáže, že přípravek lze zkoušet validovaným způsobem, který může obsahovat postup na odstranění interferujících faktorů.
Jak je uvedeno ve zkoušce na bakteriální endotoxiny, je třeba mít dostatečné informace o následujících aspektech dříve, než bude zkouška se vzorkem uznána za validovanou:
Zkouška na bakteriální endotoxin uvádí též způsob odstranění interferujících faktorů (viz Gelové metody); v případě interference se po použití takového postupu provede další zkouška, aby se ověřilo, zda použitá metoda skutečně neutralizovala nebo odstranila interferenci.
Jestliže zkoušený vzorek nevyhovuje zkoušce (pozitivní výsledek), je možno zkoušku opakovat. Zřejmé nevyhovění přípravku požadavkům zkoušky může být způsobeno chybou v jeho přípravě, ředěním nebo jinou náhodnou laboratorní kontaminací.
V této části jsou vysvětleny důvody pro požadavky obsažené ve zkoušce na bakteriální endotoxiny a potom je pojednáno o odečítání a interpretaci výsledků.
Nahrazení lékopisné zkoušky na pyrogenní látky prováděné na králících LAL testem v podstatě představuje použití alternativní metody analýzy, a proto vyžaduje validaci. Některé pokyny k jejímu provedení jsou uvedeny v této části.
Referenční metoda na stanovení bakteriálních endotoxinů je uvedena v článku daného přípravku; není-li metoda uvedena, použije se jako referenční metoda A. Má-li se použít jiná než referenční metoda, musí analytik prokázat, že tato metoda je vhodná pro přípravek a dává výsledky, které jsou shodné s výsledky získanými referenční metodou (viz též část 11).
Ačkoliv ve zkoušce na bakteriální endotoxiny je určen jako zdroj lyzátu druh Limulus polyphemus, je možno aktivní lyzát též získat z blízce příbuzných druhů, jako je rod Tachypleus. Výraz ”amebocytární lyzát” se v textu používá pro označení validovaného amebocytárního lyzátu bez ohledu na jeho biologický původ.

1.1 Prokáže se vhodnost materiálů ke zkoušce. Má se prokázat nepřítomnost endotoxinu ve vodě pro LAL a v ostatních zkoumadlech a má se ověřit citlivost lyzátu, aby se ověřila citlivost deklarovaná výrobcem.

1.2 Protože zkoušený přípravek může ve zkoušce interferovat, přezkouší se citlivost lyzátu v nepřítomnosti i v přítomnosti zkoušeného přípravku. Mezi oběma hodnotami citlivosti se nezjistí signifikantní rozdíl.

1 Úvod
Techniky amplifikace nukleových kyselin jsou založeny na dvou rozdílných přístupech:
V této všeobecné kapitole se jako referenční technika popisuje metoda PCR. Mohou se používat alternativní metody, pokud splňují dále popsané požadavky na kvalitu.

1. amplifikace cílové sekvence nukleové kyseliny používající např. polymerasovou řetězovou reakci (PCR), ligasovou řetězovou reakci (LCR) nebo izotermální amplifikaci ribonukleové kyseliny (RNK),

2. amplifikace hybridizačního signálu používající např. pro kyselinu deoxyribonukleovou metodu tzv. větvené DNK (bDNK). V tomto případě se amplifikace signálu docílí bez vystavení nukleové kyseliny opakovaným amplifikačním cyklům.

2. Odstraní se živná půda.

2. Stanovení počtu Clostridium perfringens
Zkoušený výrobek se zpracuje, jak je popsáno v obecné metodě 2.6.12, a připraví se ještě stonásobné a tisícinásobné zředění v tlumivém roztoku chloridu sodného s peptonem o pH 7,0. Stanoví se nejpravděpodobnější počet bakterií, jak je uvedeno při stanovení celkového počtu živých aerobních mikroorganismů (2.6.12) za použití živné půdy R ve zkumavce nebo v jiné vhodné nádobě s malou Durhamovou zkumavkou. Opatrně se promíchá a inkubuje se 24 h až 48 h při 45,5 °C až 46,5 °C. Zkumavky, které zčernají od sirníku železitého a v nichž je Durhamova zkumavka naplněna plynem (nejméně v jedné desetině objemu), indikují přítomnost Clostridium perfringens. Nejpravděpodobnější počet Cl. perfringens se odečte z tabulky 2.6.12-1.

2. Metoda
Ačkoliv přidání endotoxinu k roztoku amebocytárního lyzátu může vést ke vzniku zákalu, sraženiny nebo gelu, pouze vznik gelu byl zvolen jako rozhodující u prvního typu zkoušky na bakteriální endotoxiny. Výhodou byla jednoduchost založená na rozhodnutí, zda přípravek vyhovuje nebo nevyhovuje na základě prostým okem patrné tvorby nebo nepřítomnosti gelu. Kvantitativní metody uvedené jako metody C, D, E byly vyvinuty později: vyžadují více přístrojového vybavení, ale jsou vhodnější pro automatické zkoušení velkého počtu vzorků jednoho přípravku.
Endotoxiny se mohou adsorbovat na povrch zkumavek nebo pipet z určitých plastů nebo typů skla. Uvolnění látek z plastických materiálů může vyvolat interferenci. Proto se mají používané materiály kontrolovat; složení následujících šarží zkumavek nebo pipet se mohou mírně lišit, a proto se doporučuje, aby laboratorní pracovník opakoval takové zkoušení u každé nové šarže materiálů.
Zatímco výsledky zkoušky na pyrogenní látky na králících jsou závislé na dávce pyrogenu, výsledky zkoušky na bakteriální endotoxiny závisí na koncentraci endotoxinu ve směsi. Rozhodnutí použít zkoušku na bakteriální endotoxiny jako limitní zkoušku je dáno tím, že za prvé musí být definována prahová koncentrace endotoxinu pro zkoušený přípravek a za druhé analytik provádějící zkoušku má vědět, kdy je koncentrace endotoxinu v přípravku pod nebo nad hranicí této prahové hodnoty. Kvantitativními metodami C, D, E je stanovení koncentrace endotoxinu ve zkoušeném vzorku jednoduché, ale v rutinní kontrole kvality je základním požadavkem otázka, zda-li tato koncentrace je nebo není vyšší než požadovaný limit.
Při stanovování prahové koncentrace endotoxinu u zkoušeného přípravku je nutno brát zřetel na lidskou dávku přípravku, s cílem mít jistotu, že pokud je koncentrace endotoxinu v přípravku pod prahovou hodnotou, pak výsledná maximální dávka podaná odpovídajícím způsobem za hodinu neobsahuje dostatečné množství endotoxinu k rozvoji toxické reakce.
Jestliže je koncentrace endotoxinu v přípravku přesně rovna prahové hodnotě, dojde ke vzniku gelu jako v případě, kdy je koncentrace endotoxinu mnohem vyšší a přípravek nevyhoví zkoušce, protože nelze rozlišit mezi koncentrací přesně se rovnající prahové koncentraci a mezi koncentrací vyšší. Pouze v případě, kdy nedojde ke vzniku gelu, může analytik rozhodnout, že koncentrace endotoxinu nepřesáhla koncentraci prahovou.
U pevných přípravků je třeba prahovou koncentraci endotoxinu na jednotku hmotnosti nebo mezinárodní jednotku přípravku převést na koncentraci endotoxinu v mililitru zkoušeného roztoku, neboť zkoušku lze provádět pouze u roztoků. Přípravky, které existují pouze v tekutém stavu, jako jsou infuzní roztoky, jsou uvedeny dále.
Stanovení prahové koncentrace endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu v jednotce přípravku (jednotka hmotnosti nebo mezinárodní jednotka) vyžaduje definovat:
M = maximální dávka přípravku pro dospělé vyjádřená v jednotkách hmotnosti nebo mezinárodních jednotkách na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu, pokud se podává zamýšleným způsobem. Při stanovení maximální dávky pro dospělé se má použít hmotnost 70 kg pro dospělou osobu. Dětská dávka na kilogram hmotnosti za hodinu se má použít jen v případě, jeli vyšší než odpovídající dávka pro dospělé,
K = maximální dávka endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu, kterou může pacient dostat předepsaným způsobem bez nežádoucích účinků (Tabulka 2.6.14-1).
Předpokládá se ke zkoušení roztok obsahující c mg (nebo mezinárodních jednotek) přípravku v mililitru. Potom objem M/c ml je objem obsahující maximální dávku M. Jestliže tento objem obsahuje K mezinárodních jednotek endotoxinu, bude výsledek zkoušky pozitivní.
Proto limitní koncentrace endotoxinu (ELC) v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru, jež je shodná s prahovou koncentrací endotoxinu v miligramu nebo v mezinárodní jednotce přípravku v pevném stavu, je rovna:
$E L C = \frac{K . c}{M},$
v němž značí:
K - nejvyšší přijatelnou dávku endotoxinu v mezinárodních jednotkách na kilogram hmotnosti za hodinu,
c - koncentraci roztoku v miligramech nebo mezinárodních jednotkách přípravku v mililitru,
M - maximální dávku přípravku v miligramech nebo mezinárodních jednotkách na kilogram hmotnosti za hodinu.
U přípravků, které jsou již v tekuté formě, se vyjádří maximální dávka pro dospělého na kilogram hmotnosti za hodinu v mililitrech. Výše uvedené vyjádření limitní koncentrace endotoxinu platí též pro přípravky, u nichž je uvedena maximální dávka v mililitrech na kilogram hmotnosti za hodinu nahrazením M a c hodnotou jedna.
Prahová koncentrace endotoxinu byla v minulosti definována jako maximální povolená koncentrace endotoxinu (MAEC). Avšak prakticky přípravek obsahující množství endotoxinu, které se rovná přesně MAEC, by nevyhověl zkoušce stejně jako přípravek obsahující endotoxinu více. Jediný způsob, jak se přesvědčit, že MAEC v přípravku nebyla překročena, je prokázat, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než MAEC; takže je mnohem logičtější používat termín limitní koncentrace endotoxinu (ELC) jako koncentraci endotoxinu, která nesmí být dosažena.
Limitní koncentrace endotoxinu závisí na druhu přípravku a jeho použití a je uvedena v jednotlivých článcích, do nichž je třeba nahlédnout. Hodnoty K jsou uvedeny v tabulce 2.6.14-1.
Tab. 2.6.14-1

Zamýšlený způsob podání	K v mezinárodních jednotkách endotoxinu na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu
Intravenózní	5,0
Intravenózní pro radiofarmaka	2,5
Intrathekalní	0,2

Které ředění přípravku se má použít ve zkoušce, aby byla naprostá jistota, že negativní výsledek zkoušky znamená, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než ELC a že pozitivní výsledek znamená, že lyzát detegoval alespoň ELC. Toto ředění závisí na ELC a na citlivosti lyzátu: označuje se jako maximální platné ředění (MVD) a tato hodnota se může vypočítat ze vzorce.

M V D = \frac{E L C}{λ} = \frac{K . c}{M . λ},

v němž značí:
λ - uvedenou citlivost lyzátu v mezinárodních jednotách endotoxinu v mililitru.
Jestliže hodnota maximálního platného ředění není celým číslem, pak je možno pro rutinní účel zvolit odpovídající celé číslo nižší, než je MVD (čímž je míněna hodnota ředění roztoku přípravku nižší, než je udaná hodnota MVD). V tomto případě negativní výsledek zkoušky ukazuje, že koncentrace endotoxinu v přípravku se nachází pod hladinou limitní hodnoty. Je-li však koncentrace endotoxinu v přípravku v takovéto zkoušce nižší než ELC, ale dostatečně vysoká k tomu, aby při reakci s lyzátem došlo k tvorbě gelu, může být zkouška hodnocena za těchto podmínek jako pozitivní. Tudíž, je-li zkouška s tímto "vhodným" ředícím faktorem pozitivní, je nutno přípravek ředit na MVD a zkoušku opakovat. V jakémkoli případě pochybností nebo sporu se použije MVD.
To zdůrazňuje důležitost potvrzení citlivosti lyzátu.
Příklad
Zkouší se roztok sodné soli fenytoinu obsahující 50 mg/ml (zamýšlený pro intravenózní podání). Stanoví se MVD za použití následujících proměnných:
M - maximální lidská dávka = 15 mg na kilogram hmotnosti za hodinu,
c - 50 mg/ml,
K - 5 m.j. endotoxinu na kilogram za hodinu v mezinárodních jednotkách,
λ - 0,4 m.j. endotoxinu v mililitru.
Řešení:

E L C = \frac{K . c}{M} = \frac{5.50}{15}

M V D = \frac{E L C}{λ} = \frac{5.50}{15} . \frac{1}{0,4} = 41,67

Pro rutinní zkoušení tohoto přípravku je vhodné ředit 1 ml roztoku ke zkoušce na 20 ml (MVD/2 zaokrouhleno na nejbližší menší celé číslo). Je-li však zkouška pozitivní, bude analytik muset ředit 1 ml na 41,67 ml a opakovat zkoušku. Ředění na 41,67 ml je rovněž nutné, jestliže se zkoušením má vyřešit sporný výsledek.

2 Rozsah působnosti
Tato stať zavádí požadavky na přípravu vzorku, na amplifikaci sekvencí DNK in vitro a na detekci specifického produktu PCR. Za pomoci PCR se mohou detegovat definované sekvence DNK. Rovněž sekvence RNK se mohou detegovat po reverzní transkripci RNK na komplementární DNK (cDNK) a následné amplifikaci.

3. Nárůst se promyje tlumivým roztokem fosforečnanovým o pH 7,4 a potom směsí stejných objemových dílů tohoto tlumivého roztoku a vhodného fixačního roztoku a nakonec fixačním roztokem. Pokud se pro barvení používá bisbenzimid R, pak je vhodným fixačním roztokem čerstvě připravená směs objemových dílů kyseliny octové ledové R a methanolu R (1 +3).

3. Referenční materiál
Referenční endotoxin BRP je určen pro použití jako porovnávací přípravek. Byl přezkoušen proti mezinárodnímu standardu endotoxinu a jeho účinnost je vyjádřena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru. Mezinárodní jednotka endotoxinu je definována jako specifická účinnost obsažená v definovaném množství mezinárodního standardu.
Pro rutinní účely je možno použít jiný přípravek endotoxinu, jestliže byl přezkoušen proti mezinárodnímu standardu endotoxinu nebo endotoxinu BRP a jeho účinnost je vyjádřena v mezinárodních jednotkách endotoxinu.
Jedna ampule referenčního přípravku obvykle obsahuje větší množství, než je množství potřebné pro jednu zkoušku, a analytik potřebuje vědět, jak dlouho lze obsah otevřené ampule používat. Pokles účinnosti nebyl pozorován v ampulích, které byly otevřeny v laminárním boxu, uzavřeny vhodným materiálem a dva týdny skladovány při +4 °C. Analytik samozřejmě musí ověřit účinnost takovéto ampule při rutinním laboratorním režimu, je-li odkázán na prodloužené používání otevřené ampule.

3 Princip metody
PCR je postup umožňující in vitro specifickou amplifikaci segmentů DNK nebo segmentů RNK po jejich reverzní transkripci na cDNK.
Po denaturaci dvouřetězcové DNK na jednořetězcovou DNK dva syntetické oligonukleotidové primery opačné polarity se přihybridizují k odpovídajícím komplementárním sekvencím DNK, která má být amplifikována. Krátké dvouřetězcové úseky, které jsou výsledkem specifického párování mezi primerem a komplementární sekvencí DNK, ohraničují segment DNK, který bude amplifikován a slouží jako výchozí body pro syntézu DNK in vitro pomocí tepelně stabilní DNK polymerasy.
Amplifikace DNK probíhá v cyklech, které tvoří:
- tepelná denaturace nukleové kyseliny (cílové sekvence) na dva jednoduché řetězce,
- specifické přihybridizování primerů k cílové sekvenci za vhodných reakčních podmínek,
- prodloužení primerů, které jsou navázány na oba jednoduché řetězce, DNK polymerasou při vhodné teplotě (syntéza DNK).
Opakované cykly tepelné denaturace, přihybridizování primerů a syntéza DNK vedou k exponenciální amplifikaci segmentu DNK omezeného primery.
Specifický produkt PCR známý jako amplikon může být detegován různými metodami s vhodnou specifitou a citlivostí.

4. Přidá se fixační roztok a nechá se 10 min stát.

4. Voda pro LAL
Zkoušení na nepřítomnost endotoxinu v této látce zkouškou na pyrogenní látky na králíku bylo vyloučeno z praktických a teoretických důvodů:
- králík není dostatečně citlivý, aby mohl detegovat endotoxin ve vodě pro LAL určené ke zkoušení přípravků s velice nízkou limitní koncentrací endotoxinu,
- relativně nízká přesnost teplotní odpovědi u králíka vede k opakování na mnoha králících,
- termíny “pyrogenní látky“ a “endotoxiny“ označují skupiny látek, které nejsou zcela totožné.
Text zkoušky na bakteriální endotoxiny ukazuje, že i jiná metoda, než je trojnásobná destilace, se může použít k přípravě vody pro LAL. Reverzní osmosa byla použita s dobrým výsledkem; někteří analytici mohou dávat přednost vodě destilované více než třikrát. V každém případě použitá metoda musí zaručit, že výsledný produkt je prost zjistitelných endotoxinů.

4 Zkoušený materiál
Z důvodu vysoké citlivosti PCR je nutno vzorky optimálně chránit před vnější kontaminací cílovými sekvencemi.
Vzorkování, uchovávání a doprava zkoušeného materiálu se provádějí za podmínek minimalizujících degradaci cílové sekvence. Pro cílové sekvence RNK je třeba zvláštní opatrnost, neboť RNK je vysoce citlivá na degradaci ribonukleasami. Je třeba věnovat pozornost i tomu, že některé přidávané látky, jako jsou zkoumadla, antikoagulancia nebo konzervační látky, mohou interferovat v postupu zkoušky.

5. Fixační roztok se odstraní.

5. Hodnota pH směsi
Ve zkoušce na bakteriální endotoxiny dochází ke vzniku gelu nejvhodněji při pH 6,0 až 7,5. Při přidání lyzátu ke vzorku může však dojít k poklesu pH. Proto, aby byla jistota, že pH směsi není nižší než 6,0, má se analytik přesvědčit o tom, že hodnota pH zkoušeného vzorku není nižší než 6,5.

5 Zkušební metoda

5.1 Zamezení kontaminaci
Riziko kontaminace vyžaduje přísné oddělení prostor podle zpracovávaného materiálu a používané technologie. Faktory, které je třeba uvážit, jsou pohyb personálu, pracovní oděv, pohyb materiálu, větrání a dekontaminační postupy.
Systém se má rozdělit do několika oddělení, jako jsou např.:
- prostor, kde se připravují základní zkoumadla, jako jsou např. primery, tlumivé roztoky, a kde se zachází výhradně s materiály neobsahujícími matrice,
- pre-PCR - prostor, kde se zachází se zkoumadly, vzorky a kontrolami,
- PCR-amplifikace - s amplifikovaným materiálem se zachází v uzavřeném systému,
- detekce post-PCR - jediný prostor, kde se zachází s amplifikovaným materiálem v otevřeném systému.

5.2 Příprava vzorku
Při přípravě vzorku se cílová sekvence extrahuje nebo uvolňuje z testovaného materiálu účinným a reprodukovatelným způsobem tak, aby bylo možné za zvolených reakčních podmínek provést amplifikaci.
Mohou se použít různé způsoby fyzikálně-chemické extrakce anebo obohacovací metody. Aditivá přítomná ve zkoušeném materiálu mohou interferovat s PCR. Pro kontrolu nepřítomnosti inhibitorů pocházejících ze zkoušeného materiálu se použijí postupy uvedené v odstavci 7.3.2.
V případě matric RNK je třeba zabránit působení ribonukleas.

5.3 Amplifíkace
Amplifikace cílové sekvence metodou PCR se provádí opakovanými cykly v optimalizovaných podmínkách (teplotní profil pro denaturaci dvouřetězcové DNK, přihybridizování primerů a jejich prodlužování, inkubační časy při zvolených teplotách, rychlost nabíhání zvolených teplot).
Tyto podmínky závisejí na různých parametrech, jako jsou:
- délka a složení bází primerů a cílových sekvencí;
- typ DNK polymerasy, složení tlumivého roztoku a reakční objemy použité pro amplifikaci;
- typ použitého termocykleru a koeficient teplotní vodivosti mezi přístrojem, reakční zkumavkou a reagující tekutinou.

5.4 Detekce
Amplikon vytvořený PCR se může identifikovat velikostí, sekvencí, chemickou modifikací nebo kombinací těchto parametrů. Charakterizace na základě velikosti se může dosáhnout gelovou elektroforézou (použije se vrstva agarosového nebo polyakrylamidového gelu nebo kapilární elektroforéza), nebo chromatografií na koloně (např. HPLC). Charakterizace na základě složení sekvencí se může provést specifickou hybridizací vzorků majících komplementární sekvence k cílové sekvenci nebo štěpením amplifikovaného materiálu restrikčním enzymem ve specifických místech pro cílovou sekvenci.
Charakteristika chemickou modifikací se může provést např. inkorporací fluoroforu do amplikonu a následnou detekcí fluorescence po excitaci.
Detekce amplikonů se může provést použitím značených vzorků umožňujících následnou radioizotopovou nebo imunoenzymatickou detekci.

6. Jestliže se nárůst bude barvit později, úplně se vysuší. Zvláštní péči potřebuje barvení na sklíčku po vysušení, protože mohou vznikat artefakty.

6. Validace lyzátu
Při přípravě roztoku lyzátu je důležité se řídit návodem výrobce.
Poslední pozitivní ředění u gelové metody A a B se převedou na logaritmy. Důvodem toho graficky znázorněné rozložení četnosti těchto logaritmických hodnot dává obvykle normální distribuční křivku mnohem vyrovnanější, než je distribuční rozložení ředících faktorů jako takových; v podstatě jde o tak podobné hodnoty, že je přijatelné použít normální frekvenční distribuci jako matematický model a stanovit interval spolehlivosti Studentovým t-testem.
Kinetické metody C a D používají logaritmus koncentrace endotoxinu, protože lze použít model lineární regrese log reakčního času na log koncentrace endotoxinu. Chromogenní metoda konečného bodu, metoda E, používá odlišný model. V tomto případě výsledek (absorbance závislá na uvolněném barvivu) může být hodnocen jako lineární funkce koncentrace endotoxinu v použitém koncentračním rozmezí.

6 Hodnocení a interpretace výsledků
Výsledky jsou platné pouze tehdy, jsou-li pozitivní kontroly jednoznačně pozitivní a negativní kontroly jednoznačně negativní. Vysoká citlivost PCR metody a potenciální riziko kontaminace vyžaduje potvrzení pozitivních výsledků dvojím opakováním celého zkušebního postupu, pokud možno s novým množstvím vzorku. Vzorky se považují za pozitivní, jestliže alespoň jedna z opakovaných zkoušek je pozitivní.

7. Jestliže se nárůst barví ihned, vymyje se fixační roztok dvakrát sterilní vodou, která se odstraní.

7. Předběžná zkouška na interferující faktory
Některé přípravky nelze přímo zkoušet na přítomnost endotoxinu, protože je nelze smíchat se zkoumadly, nelze u nich upravit hodnotu pH v rozmezí 6,5 až 7,5 nebo inhibují nebo aktivují tvorbu gelu. Proto je nutno provést předběžnou zkoušku na zjištění přítomnosti interferujících faktorů: jsou-li nalezeny, pak analytik prokáže, že postup použitý k jejich odstranění byl dostatečně účinný.
Předmětem předběžného zkoušení je nulová hypotéza, že citlivost lyzátu v přítomnosti zkoušeného přípravku se signifikantně neliší od citlivosti lyzátu bez přítomnosti vzorku. Jednoduché kritérium je použito v metodě A a B: nulovou hypotézu lze přijmout, jestliže citlivost lyzátu v přítomnosti přípravku je nejméně poloviční a nejvýše dvojnásobná, než je citlivost lyzátu samotného.
Klasickým způsobem se stanoví průměrné hodnoty logaritmů ředících faktorů lyzátu pro citlivost s přípravkem a bez něho a vypočítá se rozdíl mezi oběma průměrnými hodnotami Studentovým t-testem.
Zkouška na interferující faktory v gelových metodách A a B vyžaduje použití vzorku přípravku, u něhož nebyla zjištěna přítomnost endotoxinu. To představuje teoretický problém, když se má zkoušet zcela nový přípravek. V důsledku různých přístupů byly navrženy kvantitativní metody C, D, E.

7 Jištění jakosti

7.1 Validace systému zkoušky PCR
Validační program zahrnuje validaci přístrojů a validaci použitých metod PCR. Doporučení jsou obsažena v Předpisu ICH (hlava Q2B) Validace analytických metod: Metodologie.
Vhodné národní referenční přípravky nebo pracovní referenční přípravky se kalibrují proti mezinárodnímu standardu na cílové sekvence, pro které bude zkouška používána, a tato kalibrace je nezbytná pro validaci PCR zkoušky.
Při validaci se stanoví pozitivní limitní hodnota. Pozitivní limitní hodnota je definována jako minimální počet cílových sekvencí v objemu vzorku, které mohou být detegovány v 95 % zkušebních sérií. Pozitivní limitní hodnota závisí na vzájemně souvisejících faktorech, jako jsou objem extrahovaného vzorku a účinnost extrakční metody, přepis cílové RNK na cDNK, amplifikační postup a detekce.
Pro stanovení detekčního limitu zkušebního systému se uvede odkaz na pozitivní limitní hodnotu pro každou cílovou sekvenci a provedení zkoušky nad a pod tímto bodem.

7.2 Kontrola jakosti zkoumadel
Všechna zkoumadla potřebná pro metodiku se kontrolují dříve, než se běžně použijí. Jejich vhodnost nebo nepřijatelnost je dána předem definovanými kritérii jakosti.
Primery jsou klíčovou složkou zkoušky PCR a je nutné věnovat pečlivou pozornost jejich složení, čistotě a validaci jejich použití ve zkoušce PCR. Každá nová šarže primem se před přijetím zkouší na specificitu, amplifikační účinnost a inhibiční nečistoty. Primery mohou být modifikovány (např. konjugací s fluoroforem nebo antigenem), aby umožnily použití specifické metody detekce amplikonu a to za předpokladu, že tyto modifikace neinhibují přesnost a účinnost amplifíkace cílové sekvence.

7.3 Průběžná kontrola

7.3.1 Vnější kontroly
Ke snížení rizika kontaminace a zajištění dostatečné citlivosti jsou do každé PCR zkoušky zařazeny následující vnější kontroly:
- pozitivní kontrola: obsahuje definovaný počet kopií cílových sekvencí, jejichž počet je stanoven zvlášť pro každý zkušební systém a je určen jako násobek pozitivní limitní hodnoty zkušebního systému,
- negativní kontrola: vzorek téže matrice prokazatelné neobsahující cílové sekvence.

7.3.2 Vnitřní kontroly
Vnitřní kontroly jsou definované sekvence nukleových kyselin obsahující vazebná místa pro příměry. Vnitřní kontroly jsou amplifikovány s podobnou účinností jako zkoušená cílová sekvence, ale amplikony jsou jasně rozpoznatelné. Vnitřní kontroly jsou téhož typu nukleové kyseliny (DNK/RNK) jako zkoušený materiál. Vnitřní kontrola se přidává ke zkoušenému materiálu před izolací nukleové kyseliny, a slouží proto jako celková kontrola (extrakce, reverzní transkripce, amplifikace, detekce).

7.4 Vnější hodnocení jakosti
Účast v programech vnějšího hodnocení jakosti je důležitým postupem jištění jakosti PCR pro každou laboratoř a každého pracovníka.

8. Přidá se bisbenzimid pracovní roztok R nebo nějaký jiný vhodný roztok barvící DNK a nechá se stát 10 min.

8. Odstranění interferujících faktorů
Postup k odstranění interference nemá ani zvyšovat ani snižovat množství endotoxinu ve zkoušeném přípravku (např. nesmí dojít ke snížení vlivem adsorbce). Správný způsob jak toto ověřit je, že se do zkoušky zařadí vzorek přípravku, ke kterému se přidá známé množství endotoxinu a poté se měří zpětně koncentrace endotoxinu.
Metody C a D. Jestliže zkoušený přípravek vykazuje interferenci, kterou nelze odstranit klasickými metodami, provede se CSE křivka se stejným typem přípravku zbaveného endotoxinů vhodným způsobem nebo ředěním přípravku. Zkouška na endotoxiny se provede porovnáním s touto standardní křivkou.
Ukazálo se, že v mnoha případech je dostatečně účinná ultrafiltrace přípravku na asymetrických membránových filtrech z triacetatcelulosy. Filtry mají být patřičně validovány, protože v některých případech mohou deriváty celulosy (β-D-glykany) způsobovat falešně pozitivní výsledky.
Polysulfonové filtry uvedené v dřívějším textu byly shledány nevhodnými, protože někteří uživatelé při jejich použití získali falešně pozitivní výsledky.

9. Odstraní se barvivo a nárůst se promyje vodou.

9. Poslání kontrol
Účelem kontroly vody pro LAL a referenčního přípravku endotoxinu ve dvojnásobné koncentraci, než je vyznačená citlivost lyzátu, je ověřit aktuální citlivost lyzátu v podmínkách zkoušky. Účelem negativní kontroly je ověřit nepřítomnost měřitelné koncentrace endotoxinu ve vodě pro LAL.
Druhá pozitivní kontrola, která obsahuje zkoušený přípravek v koncentraci použité ve zkoušce, je zařazena proto, aby byla prokázána nepřítomnost interferujících faktorů v průběhu a v podmínkách prováděné zkoušky.

10. Každé podložní sklíčko, je-li to vhodné, se pokryje kapkou směsi stejných objemových dílů glycerolu R a tlumivého roztoku fosforečnan-citronanového o pH 5,5, přebytečná kapalina se odsaje z rohů podložního sklíčka.

10. Hodnocení a interpretace výsledků
Jak je uvedeno v úvodním odstavci textu, zkouška s lyzátem z amebocytů se používá jako limitní test a stanovení limitu závisí na popsaných faktorech. Nepatrné množství endotoxinu ve vodě pro LAL nebo v některém jiném zkoumadle nebo materiálu, jemuž je vystaven lyzát při zkoušce, nemusí být zjištěno, pokud nedosáhne limitu citlivosti lyzátu. Může však zvyšovat množství endotoxinu v roztoku se zkoušeným přípravkem právě na hranici hodnoty citlivosti lyzátu a způsobovat pozitivní reakci.
Riziko tohoto případu lze snížit přezkoušením vody pro LAL a ostatních zkoumadel a materiálů s co nejcitlivějším lyzátem, který je dostupný, nebo s takovým, který je mnohem citlivější, než je lyzát použitý pro zkoušený přípravek. Ani takto nelze zcela vyloučit riziko falešně pozitivního výsledku. Tento postup by měl být zařazen, aby byla zajištěna bezpečná interpretace výsledků oproti případu falešně negativního testu, který může vést k propuštění nevyhovujícího přípravku ohrožujícího zdraví pacienta.

11. Vyšetří se epifluorescencí (330 nm/380 nm excitační filtr, LP 440 nm clona) při 100 až 400 násobném zvětšení nebo větším.

11. Náhrada zkoušky na pyrogenní látky na králících nebo zkoušky na endotoxin předepsané v lékopisném článku
V článcích na přípravky pro parenterální použití, které mohou obsahovat toxická množství bakteriálních endotoxinů, se požaduje buď zkouška na pyrogenní látky na králících, nebo zkouška na bakteriální endotoxiny. Je-li předepsána zkouška na bakteriální endotoxiny a není uvedena žádná z pěti metod (A až E) popsaných ve stati 2.6.14, pak se pro tento přípravek validovala gelová limitní metoda A. Je-li uvedena jedna z dalších metod (B až E), je to ta, která byla validována pro tento přípravek. Náhrada zkoušky na pyrogenní látky na králících zkouškou na bakteriální endotoxin nebo náhrada uvedené či předpokládané metody na stanovení endotoxinu jinou metodou je považována za použití alternativní metody místo lékopisné zkoušky, jak je uvedeno v části

1. Obecné zásady:
Zkoušky na čistotu a stanovení obsahu nebo účinnosti popsané v lékopisu jsou oficiální metody, na nichž jsou založeny lékopisné normy. Se souhlasem oprávněné autority se pro kontrolní účely mohou použít alternativní analytické metody za předpokladu, že bude dosaženo shody s metodami oficiálními. V případě pochybností nebo sporu jsou rozhodující pouze oficiální metody analýzy.
Pro validaci jiné zkoušky na bakteriální endotoxin, než je obsažena nebo určena v lékopisném článku, jsou navrženy následující postupy:

11.1 Postup, materiály a zkoumadla používané v metodě se validují, jak je popsáno v příslušné zkoušce.

11.2 Přítomnost interferujících faktorů (a je-li to třeba, postupy k jejich odstranění) se prověří na vzorkách nejméně ze tří výrobních šarží. Je vhodné pamatovat na to, že metody D a E používají chromogenní peptid a vyžadují zkoumadla, která chybějí u metody A, B a C, takže vyhovující výsledek v metodě A, B nebo C v metodě na interferující faktory nelze vztáhnout na metodu D nebo E bez dalšího zkoušení.

11.3 Jestliže jsou dostupné vzorky z výrobní šarže, které ve zkoušce na pyrogenní látky na králících byly pozitivní, měly by se také přezkoušet na bakteriální endotoxiny metodou, o níž se uvažuje jako o alternativní. Nejsou-li tyto vzorky dostupné, pak je rozhodující zkouška na pyrogenní látky a zkouška na bakteriální endotoxiny zbytečná.

12. Mikroskopický vzhled zkoušené kultury se porovná s negativní a pozitivní kontrolou a vyšetří na mimojadernou fluorescenci. Mykoplazmata se jeví jako body nebo vlákna v cytoplasmě a občas i v mezibuněčném prostoru.
Zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže není prokázána přítomnost mykoplazmat v kulturách jím očkovaných. Zkoušku lze hodnotit, jestliže pozitivní kontroly ukážou přítomnost použitých zkušebních organismů.
Následující část se uvádí pro informaci a jeho návod, netvoří závaznou součást obecných metod.

12. Validace zkoušky pro nové přípravky
Postup uvedený v části 11.1 a 11.2 se použije u všech nových přípravků pro parenterální podání, které se mají zkoušet na přítomnost bakteriálních endotoxinů podle požadavků lékopisu.

13. Nové přípravky ovlivňující tělní teplotu
Jestliže se u nového přípravku během jeho vývoje ukáže, že by mohl ovlivňovat tělní teplotu, je možno použít jednu z metod (A až E) k důkazu nepřítomnosti bakteriálních endotoxinů; zejména kvantitativní metoda (B, C, D nebo E) může dát užitečnou informaci. V tomto případě se postupuje, jak je uvedeno v části 11.1 a 11.2. Avšak jsou-li patrné známky kontaminace přípravku neendotoxinovými pyrogenními látkami, je nutno získat podklady z mnohem rozsáhlejšího zkoušení.

2.7 Metody stanovení účinnosti

2.7.2 Mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik

Účinnost antibiotika se stanoví porovnáním inhibice růstu citlivých mikroorganismů vyvolané známými koncentracemi zkoušeného antibiotika a referenční látky.
Referenční látky použité ke stanovení jsou ty, jejichž účinnost byla přesně stanovena v poměru k odpovídajícímu mezinárodnímu standardu nebo mezinárodnímu referenčnímu přípravku.
Plán stanovení je takový, aby dovolil ověřit validitu matematického modelu, na němž je založeno porovnání účinnosti. Je-li vybrán model rovnoběžných přímek, dvě logaritmické přímky dávky a odpovědi (nebo transformované odpovědi) zkoušeného přípravku a referenčního přípravku jsou rovnoběžné a jsou lineární v intervalu dávek použitých k výpočtu. Tyto podmínky se validují pro danou hladinu pravděpodobnosti, obvykle P = 0,05. Jiné matematické modely, jako model např. regresního poměru, mohou být též použity, je-li prokázána validita zkoušky.
Pokud není v článku uvedeno jinak, je interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovení nejméně 95 % a nejvýše 105 % stanovené účinnosti.
Stanovení se provádí metodou A nebo metodou B.
Doporučené mikroorganismy
Následující text uvádí doporučené mikroorganismy a podmínky jejich použití. Jiné mikroorganismy se mohou použít, pokud mají prokazatelně stejnou citlivost na zkoušené antibiotikum a použijí se ve vhodné živné půdě a ve vhodných podmínkách teploty a pH. Výběr koncentrací roztoků se má provést tak, aby zaručil, že v podmínkách zkoušky existuje lineární vztah mezi logaritmem dávky a odpovědí.
Příprava inokula
Bacillus subtilis a Bacillus pumilus. Suspenze spor mikroorganismu použitého k naočkování se připraví takto:
Mikroorganismy se kultivují 7 dní při 35 °C až 37 °C na vhodné pevné půdě, do které byl přidán síran manganatý R (1 mg/l). Nárůst, který obsahuje zejména spory, se spláchne sterilní vodou R. Suspenze se 30 min zahřívá při 70 °C a potom se zředí na přiměřenou koncentraci spor, obvykle 10.10⁶ až 100.10⁶ v ml. Suspenze spor se mohou uchovávat po dlouhou dobu při teplotě nepřevyšující 4 °C.
Alternativně se mohou suspenze spor připravit kultivací mikroorganismů v půdě C při 26 °C po dobu 4 dní až 6 dní. Potom se asepticky přidá dostatek síranu manganatého R do koncentrace 1 mg/l a inkubuje se dalších 48 h. V suspenzi se mikroskopicky zjistí, zda proběhla přiměřená tvorba spor (asi 80 %), a suspenze se odstředí. Sediment se resuspenduje ve sterilní vodě R tak, aby se dosáhla koncentrace spor v ml 10.10⁶ až 100.10⁶, a potom se zahřívá 30 min na 70 °C. Suspenze se uchovává při teplotě nepřevyšující 4 °C.
Bordetella bronchiseptica. Testovací mikroorganismus se kultivuje na půdě B 16 h až 18 h při 35 °C až 37 °C. Nárůst se smyje sterilní vodou R a zředí na vhodný zákal.
Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Micrococcus flavus, Staphylococcus epidermidis. Připraví se stejně, jak je popsáno v odstavci Bordetella bronchiseptica, ale použije se půda A a naředí se na takový zákal, který při turbidimetrickém stanovení prokazatelně poskytuje uspokojující vztah dávky k odpovědi nebo při difuzním stanovení vytváří zřetelně ohraničené inhibiční zóny postačujícího průměru.
Sacharomyces cerevisiae, Candida tropicalis. Testovací mikroorganismus se kultivuje 24 h na půdě F při 30 °C až 37 °C. Nárůst se smyje sterilním roztokem chloridu sodného R (9 g/l) a zředí se jím na vhodný zákal.
Tlumivé roztoky
Tlumivé roztoky o pH v rozmezí 5,8 až 8,0 se připraví smícháním 50,0 ml dihydrogenfosforečnanu draselného 0,2 mol/l RS s množstvím hydroxidu sodného 0,2 mol/l RS, uvedeným v následující tabulce a doplněním čerstvě připravenou vodou destilovanou R na 200,0 ml.
Tab. 2.7.2-3

pH	množství hydroxidu sodného 0,2 mol/l RS v ml
5,8	3,72
6,0	5,70
6,2	8,60
6,4	12,60
6,6	17,80
6,8	23,65
7,0	29,63
7,2	35,00
7,4	39,50
7,6	42,80
7,8	45,20
8,0	46,80

Tyto tlumivé roztoky se použijí pro všechny mikrobiologické zkoušky uvedené v tabulce 2.7.2-1 s výjimkou:
1) bleomyciniumsulfatu, pro který se tlumivý roztok o pH 6,8 připraví takto: rozpustí se 6,4 g dihydrogenfosforečnanu draselného R a 18,9 g hydrogenfosforečnanu sodného R ve vodě R a zředí se jí na 1000,0 ml.
2) amfotericinu, na který se tlumivý roztok o pH 10,5 (0,2 mol/l) připraví takto: 35,08 g hydrogenfosforečnanu draselného R se rozpustí ve vodě destilované R, přidá se 1,12 g hydroxidu draselného R a zředí se vodou destilovanou R na 1000,0 ml.
Živné půdy
Mohou se použít následující půdy nebo půdy jím rovnocenné.

Půda A
pepton	6 g
pankreatický hydrolyzát kaseinu	4 g
hovězí výtažek	1,5 g
kvasničný výtažek	3 g
glukosa monohydrát	1 g
agar	15 g
voda	do 1000 ml
Půda B
pankreatický hydrolyzát kaseinu	17 g
papainový hydrolyzát sóji	3 g
chlorid sodný	5 g
hydrogenfosforečnan draselný	2,5 g
glukosa monohydrát	2,5 g
agar	15 g
polysorbát 80	10 g
voda	do 1000 ml

Polysorbát 80 se přidá k horkému roztoku ostatních složek po jejich rozvaření a bezprostředně před upravením objemu.

Půda C
pepton	6 g
hovězí výtažek	1,5 g
kvasničný výtažek	3 g
chlorid sodný	3,5 g
glukosa monohydrát	1 g
hydrogenfosforečnan draselný	3,68 g
dihydrogenfosforečnan draselný	1,32 g
voda	do 1000 ml
Půda D
výtažek ze srdce	1,5 g
kvasničný výtažek	1,5 g
pepton z kaseinu	5,0 g
glukosa monohydrát	1 g
chlorid sodný	3,5 g
hydrogenfosforečnan draselný	3,68 g
dihydrogenfosforečnan draselný	1,32 g
dusičnan draselný	2 g
voda	do 1000 ml

Půda E
pepton	5 g
masový výtažek	3 g
hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát	26,9 g
agar	10 g
voda	do 1000 ml

Hydrogenfosforečnan sodný se přidá jako sterilní roztok po sterilizaci půdy.

Půda F
pepton	9,4 g
kvasničný výtažek	4,7 g
hovězí výtažek	2,4 g
chlorid sodný	30,0 g
glukosa monohydrát	10,0 g
agar	23,5 g
voda	do 1000 ml
Půda G
glycerol	10 g
pepton	10 g
masový výtažek	10 g
chlorid sodný	3 g
agar	15 g
voda	do 1000 ml

pH 7 ± 0,1 po sterilizaci

2.7.10 Stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru VII

Podstata zkoušky. Při stanovení účinnosti koagulačního faktoru VII se využívá jeho biologické aktivity v komplexu faktor Vlla-tkáňový faktor při aktivaci faktoru X za přítomnosti vápenatých iontů a fosfolipidů. Účinnost přípravku faktoru VII se stanoví porovnáním množství přípravku potřebného k dosažení určitého stupně tvorby faktoru Xa ve zkoušené směsi obsahující látky účastnící se aktivace faktoru X s množstvím mezinárodního standardu nebo porovnávacího přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, které je zapotřebí ke stejnému stupni tvorby faktoru Xa.
Mezinárodní jednotka je účinnost faktoru VII obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaná plazma. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.
Metoda chromogenního stanovení účinnosti se skládá ze dvou fází: z aktivace reakční směsi faktoru X, která obsahuje tkáňový faktor, fosfolipidy a vápenaté ionty a závisí na faktoru VII, a z následného enzymatického rozštěpení chromogenního substrátu faktoru Xa na chromofor, jehož množství se může stanovit spektrofotometricky.
Za vhodných podmínek stanovení účinnosti je lineární závislost mezi stupněm tvorby faktoru Xa a koncentrací faktoru VII. Stanovení účinnosti je shrnuto ve schématu na obrázku 2.7.10-1.
V obou fázích se používají zkoumadla, která lze získat komerčně z různých zdrojů. Ačkoliv se složení jednotlivých zkoumadel může lišit, existují jejich nezbytné vlastnosti, které jsou dále podrobně popsány.
Fáze 1: a) faktor VII

\overset{t k á ň o v ý fa k t o r + {C a}^{+ +}}{\to}

faktor VIIa
Fáze 2: chromogenní substrát

\overset{f a k t o r X a}{\to}

peptid + chromofor
Obr. 2.7.10-1. Schematické znázornění stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru VII
Zkoumadla
Názvem zkoumadla koagulačního faktoru se označuje skupina přečištěných bílkovin lidského či hovězího původu. Zahrnuje faktor X a tromboplastinový tkáňový faktor/fosfolipid jako aktivátor faktoru VII. Tyto bílkoviny jsou částečně přečištěny a neobsahují nečistoty, které zasahují do aktivace faktoru VII nebo faktoru X. Faktor X je přítomen v množství, které během první fáze stanovení dává konečnou koncentraci 10 nmol/l až 350 nmol/l, přednostně 14 nmol/l až 70 nmol/l. Jako tkáňový faktor/fosfolipid se mohou používat tromboplastin přírodního původu (hovězí nebo králičí mozek) nebo syntetické přípravky. Tromboplastin vhodný ke stanovení tromboplastinového času se ředí 1 : 5 až 1 : 50 tlumivým roztokem tak, aby konečná koncentrace vápenatých iontů byla 15 mmol/l až 25 mmol/l. Konečná tvorba faktoru Xa probíhá v roztoku, který obsahuje lidský nebo hovězí albumin v takové koncentraci, že nedochází k adsorpčním ztrátám, a jehož pH je vhodně upraveno na 7,3 až 8,0. V konečné inkubační směsi je faktor VII jedinou složkou limitující stupeň tvorby faktoru Xa a žádná reakční složka nemá mít vlastní schopnost tvořit faktor Xa.
Ve druhé fázi se určí množství vzniklého faktom Xa za použití chromogenního substrátu, který je specifický pro faktor Xa. Obvykle je tvořen krátkým peptidem o třech až pěti aminových kyselinách vázaným na chromoforovou skupinu. Při odštěpení této skupiny od peptidového substrátu se její absorpční maximum posune k vlnové délce umožňující spektrofotometrické stanovení množství. Substrát se obvykle rozpustí ve vodě R a používá se ve výsledné koncentraci 0,2 mmol/l až 2 mmol/l. Substrát může také obsahovat vhodné inhibitory k zastavení další tvorby faktoru Xa (přidání edetanu).
Postup stanovení účinnosti
Celý obsah jedné ampule porovnávacího přípravku a zkoušeného přípravku se rozpustí přidáním vhodného množství vody R; použije se během 1 h. Rozpuštěné přípravky se dále naředí tak, aby vznikly roztoky obsahující 0,5 m.j. až 2,0 m.j. faktoru VII v mililitru.
Připraví se další ředění porovnávacího a zkoušeného přípravku za použití izotonického tlumivého roztoku nevázajícího vápník, která obsahují 1 % hovězího nebo lidského albuminu a přednostně mají pH 7,3 až 8,0. Připraví se nejméně tři oddělená nezávislá ředění pro každý přípravek, nejlépe ve dvojici. Ředění se připraví tak, aby konečná koncentrace faktoru VII byla nižší než 0,005 m.j. v mililitru.
Připraví se kontrolní roztok, který obsahuje všechny složky kromě faktoru VII.
Všechna ředění se připravují ve zkumavkách z plastů a použijí se během 1 h.

2.7.11 Stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru IX

Podstata zkoušky. Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví porovnáním množství přípravku potřebného ke zkrácení srážecího času zkušební směsi obsahující jiné látky než faktor IX, jež se podílejí na srážení krve, s množstvím porovnávacího přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, které je zapotřebí k vyvolání stejného účinku.
Mezinárodní jednotka je účinnost deklarovaného množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaný koncentrát lidského koagulačního faktoru IX. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.
Postup stanovení. Zkoušený přípravek a porovnávací přípravek se odděleně rozpustí podle návodu uvedeného v označení na obalu a ihned se použijí. Pokud přípravek obsahuje heparin, stanoví se jeho množství (2.7.12) a heparin se neutralizuje přidáním protaminiumsulfatu R (10 μg protaminiumsulfatu neutralizuje 1 m.j. heparinu). Zkoušený přípravek a porovnávací přípravek se zředí dostatečným množstvím tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 tak, aby se získaly roztoky obsahující 0,5 m.j. až 2,0 m.j. v mililitru. Směsí objemových dílů roztoku citronanu sodného R (38 g/l) a tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 (1 + 5) se připraví řada dvojnásobných ředění v rozmezí 1 : 10 až 1 : 80. Tato ředění je třeba připravit přesně a ihned je použít.
Použijí se např. inkubační zkumavky, které se ponechají ve vodní lázni při 37 °C. Do každé z nich se dá 0,1 ml plazmy substrátu RS2 a 0,1 ml příslušného ředění zkoušeného nebo porovnávacího přípravku. Do každé zkumavky se přidá 0,1 ml vhodného ředění zkoumadla cefalinového R nebo krevních destiček náhrady R a 0,1 ml suspenze 0,5 g kaolinu lehkého R ve 100 ml roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Pak se obsah zkumavek inkubuje 10 min za stálého protřepávání. Do každé zkumavky se přidá 0,1 ml chloridu vápenatého R (7,4 g/l).
Pomocí stopek se změří srážecí čas, tj. interval mezi přidáním chloridu vápenatého a prvními známkami tvorby fibrinu, což je možno určit vizuálně nebo vhodným přístrojem. K výpočtu účinnosti se použijí obvyklé statistické metody (např. 5.3 Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek).
Aby se zajistilo, že plazma substrát RS2 neobsahuje zjistitelnou kontaminaci faktorem IX, provede se slepá zkouška, v níž se místo zkoušeného přípravku použije odpovídající množství směsi objemových dílů roztoku citronanu sodného R (38 g/l) a tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 R (1 + 5). Zkoušku lze hodnotit, jestliže srážecí čas slepé zkoušky je v rozmezí 100 s až 200 s.

2.7.12 Stanovení účinnosti heparinu v koncentrátech koagulačních faktorů

Podstata zkoušky. Měří se absorbance při 405 nm roztoku zkoušeného vzorku a roztoku referenčního přípravku heparinu po inkubaci s definovaným nadbytkem trombinu a chromogenního substrátu specifického pro trombin. Nárůst absorbance (v závislosti na množství uvolněného p-nitroanilinu) při 405 nm je nepřímo úměrný množství heparinu ve vzorku.
Zkoušené roztoky. Přípravek se rozpustí předepsaným způsobem a naředí se vhodným tlumivým roztokem (např. roztok chloridu sodného R (7 g/l) a citronanu sodného R (6 g/l) o pH 7,3) na koncentraci asi 0,25 m.j. heparinu v mililitru. Připraví se řada ředění (až do 1 : 32) za použití vhodného tlumivého roztoku (např. roztok trometamolu R (6 g/l), kyseliny edetové R (2,2 g/l), chloridu sodného R (11,3 g/l) o pH 8,4). Naředěné roztoky se nechají stát 30 min.
Porovnávací roztoky. Referenční přípravek heparinu se naředí vhodným tlumivým roztokem (např. roztok trometamolu R (6 g/l), kyseliny edetové R (2,2 g/l), chloridu sodného R (11,3 g/l) o pH 8,4) na koncentraci asi 0,25 m.j. heparinu v mililitru a připraví se řada ředění (až do 1 : 32).
Postup stanovení. Do řady zkumavek z plastu se napipetuje po 200 μl zkoušeného roztoku nebo porovnávacího roztoku nebo kontrolního roztoku (tlumivý roztok použitý k ředění) a po 200 μl roztoku antitrombinu III R (3 m.j./ml). Směs se nechá stát 30 min a přidá se po 200 μl roztoku trombinu hovězího R (20 m.j./ml). Řádně se promíchá pomocí vibrační míchačky a nechá se stát 90 s při 37 °C.
Připraví se roztok chromogenního substrátu specifického pro trombin v koncentraci odpovídající nejméně dvojnásobku hodnoty K_m (Michaelisovy konstanty).
Substrátový roztok se ohřeje na 37 °C a přidá se po 200 μl do každé zkumavky, která obsahuje zkoušený roztok, porovnávací roztok nebo kontrolní roztok. Vše se řádně promíchá pomocí vibrační míchačky. Inkubuje se 90 s při 37 °C a reakce se zastaví přidáním po 200 μl roztoku kyseliny octové R (500 g/l C₂H₄O₂) a změří se absorbance při 405 nm.
Obsah heparinu ve zkoušeném přípravku se vypočítá za použití obvyklých statistických metod (např. 5.3. Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek).

b) faktor X $\overset{f a k t o r V I I a + {C a}^{+ +} + t k á ň o v ý f a k t o r / f o s f o l i p i d}{\to}$ faktor Xa

A. Difuzní metoda
Živná půda vhodná pro stanovení se rozehřeje a při vhodné teplotě, např. 48 °C až 50 °C pro vegetativní formy, se naočkuje suspenzí mikroorganismů citlivých na zkoušené antibiotikum v takovém množství, které vytváří zřetelně ohraničené inhibiční zóny o průměru přiměřeném koncentraci zkoušeného antibiotika. Naočkovaná půda se ihned vylije do Petriho misek nebo velkých pravoúhlých misek (ploten) v takovém množství, aby se vytvořila jednolitá vrstva silná 2 mm až 5 mm. Živná půda může být též vylita ve dvou vrstvách, z nichž jenom vrchní je naočkována. Takto připravené misky se uchovávají tak, aby před použitím nedošlo k viditelnému růstu mikroorganismů nebo k jejich usmrcení a aby povrch půd byl v čase použití suchý.
Pro přípravu roztoků stejných účinností a známých koncentrací zkoušeného antibiotika a referenční látky se použijí rozpouštědla a tlumivé roztoky uvedené v tabulce 2.7.2-1. Roztoky se nanesou buď na povrch půdy, např. do sterilních cylindříků z porcelánu, z nerezavějící oceli, případně z jiných vhodných materiálů, nebo do otvorů vyříznutých v živné půdě. Do každého cylindříku nebo otvoru se přidá stejný objem roztoků. Lze též použít sterilní disky z absorbujícího papíru vhodné kvality, které se před položením na půdu napustí roztoky referenční látky nebo zkoušeného antibiotika.
K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři rozdílné dávky referenční látky a tři odpovídající dávky zkoušeného antibiotika s předpokládanou stejnou účinností jako dávky referenční látky. Doporučuje se používat geometrickou řadu dávek. Při běžných stanoveních, u nichž je prokázán lineární průběh systému na přiměřeném počtu třídávkových stanovení, a pokud s tím souhlasí oprávněná autorita, může postačovat i dvoudávkové stanovení. Ve všech sporných případech se však použije metoda třídávková, jak je předepsáno výše.
Do každé Petriho misky nebo pravoúhlé misky se nanesou roztoky podle statisticky vhodného plánu. V případě malých misek, které nepojmou více než šest roztoků, se doporučuje měnit umístění roztoku zkoušeného antibiotika a referenční látky, aby se zabránilo interakcím koncentrovanějších roztoků.
Inkubuje se při vhodné teplotě asi 18 h. Doba předinkubační difuze, obvykle 1 h až 4 h, při pokojové teplotě nebo 4 °C, jak je vhodné, se může použít k potlačení účinku časových rozdílů mezi aplikací roztoků a tak zlepšit regresi.
Změří se průměry kruhových inhibičních zón s přesností nejméně 0,1 mm nebo jejich plochy s přesností. Pomocí vhodných statistických metod se vypočítá účinnost zkoušeného antibiotika.
V každé zkoušce se použije pro každou dávku tolik inhibičních zón, aby byla zajištěna požadovaná přesnost. Stanovení účinnosti se může opakovat a výsledky mohou být statisticky sloučeny, aby se dosáhlo požadované přesnosti stanovení a ověřilo se, že účinnost zkoušeného antibiotika není menší než požadované minimum.
Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda

Antibiotikum	Referenční látka	Rozpouštědlo k přípravě základního roztoku	Tlumívý roztok (pH)	Mikroorganis-mus	Půda a konečné pH (± 0,1)	Inkubační teplota (°C)
Amphotericinum B	Amphotericinum B CRL	Dimethyl-formamid R	pH 10,5 (0,2 mol/l)	Saccharomy-cescerevisiae IP 1432.83 ATCC 9763 CCM 8191 CNCTC 51/65	F – pH 6,1	35 až 37
Bacitracinum zincium	Bacitracinum zincicum CRL	kyselina chlorovodíková 0,01 mol/l VS	pH 7,0 (0,05 mol/l)	Micrococcus flavus NCTC 7743 CIP 53.160 ATCC 10240 CCM 732 CNCTC M 8/58	A – pH 7,0	35 až 39
Bleomycini sulfas	Bleomycini sulfas CRL	voda R	pH 6,8 (0,1 mol/l)	Mycobacterium smegmatis ATCC 607 CCM 4622 CNCTC My 23/64	G – pH 7,0	35 až 37
Colistini sulfas	Colistini sulfas CRL			Bordetella bronchiseptica NCTC 8344 CIP 53.157 ATCC 4617	B – pH 7,3	35 až 39
Colistimethatum natricum	Colistimethatum natricum CRL	voda R	pH 6,0 (0,05 mol/l)	CCM 4416 CNCTC Brb 5/63 Escherichia coli NCIB 8879 CIP 54.127 ATCC 10536 CCM 3988 CNCTC Ec 326/71	B – pH 7,3	35 až 39
Dihydro- streptomycini sulfas	Dihydro-streptomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 8236 CIP 1.83 CCM 2217	A – pH 7,9	30 až 37
Dihydro- streptomycini sulfas	Dihydro-streptomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	CNCTC Bs 17/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A – pH 7,9	30 až 37
Erythromycini estolas	Erythromycinum CRL	methanol R viz články		Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65	A – pH 7,9	30 až 37
Erythromycini ethylsuccinas		methanol R	pH 8,0 (0,05 mol/l)		A – pH 7,9	30 až 37
				Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A – pH 7,9	30 až 37
Erythromycini stearas					A – pH 7,9	30 až 37
Framycetini sulfas	Framycetini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis	E – pH 7,9	30 až 37
				NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65	E – pH 7,9	30 až 37
Gentamicini sulfas	Gentamicini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 Staphylococcus epidermidis NCIB 8853 CEP 68.21 ATCC 12228 CCM 4418 NCTC M 12/63	A – pH 7,9 A – pH 7,9	35 až 39 35 až 39
Kanamycini monosulfas				Bacillus Subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 Staphylo coccus aureus NCTC 7447 CEP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	A – pH 7,9	30 až 37
Kanamycini monosulfas	Kanamycini monosulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)		A – pH 7,9	30 až 37
Kanamycini sulfas acidus					A – pH 7,9	35 až 39
Kanamycini sulfas acidus					A – pH 7,9	35 až 39
Neomycini sulfas	Neomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	E – pH 7,9	30 až 37

					E – pH 7,9	30 až 37




Netilmicini sulfas	Netilmicini sulfas CRL	voda R	pH 8 ± 0,1	Staphylococcus aureus CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	A – pH 7,9	32 až 35
Nystatinum	Nystatinum CRL	dimethyl-formamid R	pH 6,0 (0,05 mol/l) obsahující 5 % (V/V) dimethyl-formamidu R	Candida tropicalis CIP 1433-83 NCYC 1393 CCM8223 Saccharomyces cerevisiae NCYC 87 CIP 1432.83 ATCC 9763 CCM 8191 CNCTC 51/65	F – pH 6,0	30 až 37 30 až 32
Polymyxini B sulfas	Polymyxini B sulfas CRL	voda R	pH 6,0 (0,05 mol/l)	Bordetella bronchiseptica NCTC 8344 CEP 53.157 ATCC 4617 CCM 4416 CNCTC Brb 5/63	B – pH 7,3	35 až 39
Rifamycinum natricum	Rifamycinum natricum CRL	methanol R	pH 7,0 (0,05 mol/l)	Micrococcus flavus NCTC 8340 CIP 53.45 ATCC 9341 CCM 552 CNCTC Sar 5/58	A – pH 6,6	35 až 39
Spiramycinum	Spiramycinum CRL	methanol R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A – pH 7,9	30 až 32
Streptomycini sulfas	Streptomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 8236 CIP 1.83 CCM 2217 CNCTC Bs 17/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A – pH 7,9	30 až 32


					A – pH 7,9	30 až 32



Tobramycinum	Tobramycinum CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A – pH 7,9	30 až 37
Tylosinum a.u.v.	Tylosinum CRL	roztok methanolu R (2,5 % (V/V)) v tlumivém roztoku fosforečnano-vém o pH 7,0 (0,1 mol/l)	směs objemových dílů methanolu R a tlumivého roztoku fosforečnanové-ho o pH 8,0 (0,1 mol/l) (40 + 60)	Micrococcus flavus NCTC 8340 CIP 53.45 ATCC 9341 CCM 552 CNCTC Sar 5/58	A – pH 8,0	32 až 35


Tylosini tartras a.u.v.

Vancomycini hydrochloridum	Vancomycini hydrochloridum CRL	voda R	pH 8,0	Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A – pH 8,0	37 až 39

B. Turbidimetrická metoda
Vhodná živná půda se naočkuje suspenzí vybraného mikroorganismu, který je citlivý na zkoušené antibiotikum tak, aby se v podmínkách zkoušky docílilo vhodně rozsáhlého potlačení růstu mikrobiální kultury. Použije se známé množství suspenze vybrané tak, aby byl asi po čtyřhodinové inkubaci dobře měřitelný zákal.
Naočkovaná půda se použije ihned po naočkování.
Pro přípravu roztoků referenční látky a roztoků zkoušeného antibiotika ve známých koncentracích, u nichž se předpokládá stejná účinnost, se použije rozpouštědlo a tlumivý roztok uvedený v tabulce 2.7.2-2. K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři dávky referenční látky a tři dávky zkoušeného antibiotika s předpokládanou stejnou účinností jako dávky referenční látky. Doporučuje se použít geometrickou řadu dávek. K dosažení linearity je někdy nutné vybrat z většího počtu tři následující dávky za použití odpovídajících dávek referenční látky a zkoušeného antibiotika.
Použijí se stejné zkumavky. Do každé z nich se převede stejný objem jednoho z roztoků a stejný objem naočkované živné půdy (např. 1 ml roztoku a 9 ml živné půdy).
Zároveň se připraví dvě kontrolní zkumavky bez antibiotika s naočkovanou živnou půdou a do jedné se ihned přidá 0,5 ml formaldehydu R. Tyto zkumavky slouží ke standardizaci optického přístroje použitého k měření růstu.
Zkumavky se umístí buď náhodně, nebo podle latinského čtverce, nebo náhodného bloku do vodní lázně nebo jiného vhodného přístroje, dovolujícího uvést rychle všechny zkumavky na uvedenou inkubační teplotu. Uchovávají se při této teplotě 3 h až 4 h a zabezpečí se stejná teplota a stejná doba inkubace.
Po inkubaci se zastaví ve všech zkumavkách růst mikroorganismů přidáním 0,5 ml formaldehydu R nebo zahřátím a změří se zákal s přesností na tři místa za použití vhodného optického přístroje. Alternativně lze použít jiný postup, který dovoluje měřit zákal každé zkumavky po přesně stejné době inkubace.
Vypočítá se účinnost za pomoci vhodných statistických metod.
Linearita vztahu dávka – odpověď, transformovaná nebo netransformovaná, je často získána pouze ve velmi omezeném intervalu; je to ten interval, který se má použít pro výpočet účinnosti a obsahuje nejméně tři následné dávky dovolující ověřit linearitu. Při běžných stanoveních, u nichž je prokázán lineární průběh systému, pokud byla na přiměřeném počtu třídávkových stanovení a pokud s tím souhlasí oprávněná autorita, může postačovat dvoudávkové stanovení. Ve všech sporných případech se však použije třídávková metoda.
V každé zkoušce se použije pro každou dávku tolik zkumavek, aby byla zajištěna požadovaná přesnost. Stanovení účinnosti se může opakovat a výsledky mohou být statisticky sloučeny, aby se dosáhlo požadované přesnosti stanovení a ověřilo se, že účinnost zkoušeného antibiotika není menší než požadované minimum.
Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda

Antibiotikum	Referenční látka	Rozpouštědlo k přípravě základního roztoku	Tlumivý roztok (pH)	Mikroorganis-mus	Půda a konečné pH (± 0,1)	Inkubační teplota (°C)
Colistini sulfas Colistimethatum natricum	Colistini sulfas CRL Colistimethatum natricum CRL	voda R	pH 7,0	Escherichia coli NCIB 8666 CIP 2.83 ATCC 9637 CCM 2024	C – pH 7,0	35 až 37
Dihydrostrep- tomycini sulfas	Dihydrostrepto-mycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0	Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415 CNCTC Klp 85/69	C – pH 7,0	35 až 37
Erythromycini estolas Erythromycini ethylsuccinas	Erythromycin CRL	methanol R viz články	pH 8,0	Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415	D – pH 7,0	35 až 37
Erythromycini stearas				CNCTC Klp 85/69 Staphylococcus aureus NCTC 7447 CEP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C – pH 7,0	35 až 37
Framycetini sulfas	Framycetini sulfas CRL	voda R	pH 8,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C – pH 7,0	35 až 37
Gentamicini sulfas	Gentamicini sulfas CRL	voda R	pH 7,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C – pH 7,0	35 až 37
Gramicidinum	Gramicidinum CRL	methanol R	pH 7,0 K zamezení ztrát způsobených adsorpcí v průběhu ředění může být nutná přísada detergentu, např. poly-sorbátu 80 R (0,1 mg/ml)	Streptococcus faecalis ATCC 10541 CCM 4533 CNCTC Str 6/58 Staphylococcus aureus ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C – pH 7,0	35 až 37
Kanamycini monosulfas	Kanamycini monosulfas CRL	voda R	pH 8,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C – pH 7,0	35 až 37
Kanamycini sulfas acidus	Kanamycini monosulfas CRL	voda R	pH 8,0		C – pH 7,0	35 až 37
Neomycini sulfas	Neomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C – pH 7,0	35 až 37
Rifamycinum natricum	Rifamycinum natricum CRL	methanol R	pH 7,0	Escherichia coli NICB 8879 CIP 54.127 ATCC 10536 CCM 3988 CNCTC Ec 326/71	C – pH 7,0	35 až 37
Spiramycinum	Spiramycinum CRL	methanol R	pH 7,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C – pH 7,0	35 až 37
Streptomycini sulfas	Streptomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0	Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415 CNCTC Klp 85/69	C – pH 7,0	35 až 37
Tobramycinum	Tobramycinum CRL	voda R	pH 7,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C – pH 7,0	35 až 37
Tylosinum a.u.v. Tylosini tartras a.u.v.	Tylosinum CRL	roztok methanolu R (2,5 % (V/V)) v tlumivém roztoku fosforečnano-vém o pH 7,0 (0,1 mol/l)	směs objemových dílů methanolu R a tlumivého roztoku fosforečnanové-ho o pH 8,0 (0,1 mol/l) (40 + 60)	Staphyloco-ccusaureus NCTC 6571 CIP 53.154 ATCC 9144 CCM 2107 CNCTC Mau 76/69	C – pH 7,0	37
Vancomycini hydrochloridum	Vancomycini hydrochloridům CRL	voda R	pH 8,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C – pH 7,0	37 až 39

Následující část se uvádí pro informaci a jako návod, netvoří závaznou součást obecné metody.

1. fáze. Ředění porovnávacího přípravku faktoru VII a zkoušeného přípravku se smíchají s vhodným objemem předehřátého zkoumadla koagulačního faktoru nebo s kombinací jeho jednotlivých složek a směs se inkubuje ve zkumavkách z plastů nebo na mikrotitračních deskách při 37 °C. Koncentrace různých složek během tvorby faktoru Xa odpovídá specifikaci uvedené v popisu zkoumadla.
Aktivace faktoru X se nechá probíhat po vhodnou dobu. Obvykle se reakce ukončí předtím, než koncentrace faktoru Xa dosáhne své maximální hladiny, aby se docílila uspokojivá lineární závislost mezi dávkou a odpovědí. Doba aktivace se volí také tak, aby tvorba faktoru Xa byla lineárně závislá na čase. Vhodné doby aktivace obvykle kolísají mezi 2 min a 5 min, ale jsou přípustné odchylky, pokud je dosaženo přijatelné linearity ve vztahu mezi dávkou a odpovědí.

2. fáze. Aktivace se ukončí přidáním předehřátého zkoumadla s obsahem chromogenního substrátu. Provádí se hodnocení stupně štěpení substrátu, které musí být lineární s koncentrací vzniklého faktoru Xa, měřením změny absorbance při vhodné vlnové délce za použití spektrofotometru. Použije se bud’ průběžné sledování absorbance, které umožňuje vypočítat počáteční stupeň štěpení substrátu, nebo se po vhodné době ukončí hydrolýza snížením pH po přidání vhodné látky, jako je kyselina octová (500 g/l C₂H₄O₂) nebo roztok citronanu (1mol/l) na pH 3. Doba hydrolýzy se nastaví tak, aby se dosáhlo lineární závislosti tvorby chromoforu na čase. Vhodné trvání hydrolýzy obvykle kolísá mezi 3 min a 15 min, ale jsou přípustné odchylky, pokud se dosáhne lepší lineární závislosti mezi dávkou a odpovědí.
Zkontroluje se validita stanovení a vypočítá se účinnost zkoušeného přípravku obvyklými statistickými metodami (např. 5.3. Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek).

2.9 Metody farmaceutické technologie

2.9.18 Přípravky k inhalaci: aerodynamické stanovení jemných částic

Podstata zkoušky. Zkouškou se stanovují jemné částice charakterizující obláčky aerosolů vytvářené přípravky k inhalaci.
Pokud není uvedeno a schváleno jinak, použijí se ke zkoušce níže uvedené přístroje a zkušební postupy.
Přístroj 1. Vícestupňový kapalinový odlučovač
Přístroj se skládá z prvního patra (předseparátoru), odlučovacích pater 2, 3, 4 a z filtračního patra 5, které s nimi tvoří celek, viz obrázky 2.9.18-1/3.
K odlučovacímu patru patří horní kovová přepážka (B), kterou prochází vstupní kovová trubice – tryska (A) s odlučovací deskou (D), skleněný válec (E) opatřený vzorkovacím okénkem (F), tvořící svislou stěnu patra, a vodorovná spodní kovová přepážka (G), kterou prostupuje trubice (H) spojující patro s nejblíže nižším patrem. Trubice (U) vedoucí do 4. patra je zakončena sadou trysek. Odlučovací deska (D) je zajištěna kovovým rámem (J) upevněným dvěma dráty (K) k objímce (L) na přepadové trubce (C). Vodorovný povrch sběrné desky je kolmý k ose přepadové trubky. Sběrné desky mají soustředné uspořádání.
Horní povrch odlučovací desky poněkud převyšuje okraj kovového rámu. Vybrání podél obvodu vodorovné příčky slouží ke správnému umístění skleněného válce. Skleněné válce jsou v přepážkách zajištěny těsněním (M) a dohromady jsou sepnuty šesti svorníky (N). Vzorkovací okénka se uzavírají zátkami. Spodní strana nižší přepážky čtvrtého patra má soustředný výstupek opatřený gumovým kroužkem (P), který utěsňuje okraj filtru zachycený v držáku filtru. Držák filtru (R) je konstruován jako miska se soustředným vybráním, v němž je zapuštěna perforovaná podpěra filtru (S). Soustava odlučovacích pater je sepnuta s držákem filtru pomocí dvou úchytných uzávěrů (T). Držák filtru je upraven pro filtry o průměru 76 mm. Na vstup do prvního patra se připojí vstupní díl tvořený trubkou s pravoúhlým kolenem - viz obrázek 2.9.18-4. Vzduchotěsnost spojení se zajistí pryžovým těsnicím kroužkem. Ke vstupnímu dílu, pomocí vhodného adaptéru, se vzduchotěsně připojí náustek inhalačního přípravku. Konec náustku je zarovnán s čelem vstupního dílu.

Obr. 2.9.18-1 Vícestupňový kapalinový odlučovač
Tab. 2.9.18-1 Specifikace dílů k obrázkům 2.9.18-1/3

Označení⁽¹⁾	Předmět	Popis	Rozměry⁽²⁾
A, Η	tryska-trubice	kovová trubice zašroubovaná do	viz obrázek 2.9.18-2
B, G	mezistěna	kruhová kovová deska	120
C	těsnění	např. PTFE	dle potřeby k utěsnění trysky
D	odlučovací deska	disk ze slinutého skla porozita 0	viz obrázek 2.9.18-2
E	skleněný válec	skleněná leštěná trubice
		- výška, včetně těsnění	46
		- vnější průměr	100
		- tloušťka stěny	3,5
		- vzorkovací okénko (F)
		- průměr	18
		- zátka do okénka	ISO 24/25
J	kovový rám	kruhový rám profilu L se zářezem
		- vnitřní průměr	pro zachycení odluč, desky
		- výška	4
		- tloušťka horizontální části	0,5
		- tloušťka vertikální části	2
K	drát	ocelový drát spojující kovový rám
K	drát	- průměr	1
L	objímka	kovová objímka připojená šrou-
		- vnitřní průměr	vhodný k upevnění trysky
		- výška	6
		- tloušťka	5
M	těsnění	např. silikonové	k upevnění skleněn. válce
N	svorník	kovový svorník s maticí (6 párů)
		- délka	205
		- průměr	4
P	O-kroužek	gumový kroužek
P	O-kroužek	- průměr x tloušťka	66,34 x 2,62
Q	O-kroužek	gumový kroužek
Q	O-kroužek	- průměr x tloušťka	29,1 x 1,6
R	držák filtru	Kovové pouzdro s podstavcem	viz obrázek 2.9.18-3
S	podpěra filtru	perforovaná kovová destička
		- průměr	65
		- průměr otvoru	3
		- vzdálenost mezi středy otvorů	4
T	úchytné uzávěry
U	soustava trysek	trubice (H) zakončená soustavou	viz obrázek 2.9.18-2

⁽¹⁾ Vztaženo na obrázek 2.9.18-1.
⁽²⁾ Rozměry v milimetrech, tolerance dle ISO 2768-m, pokud není uvedeno jinak.

Obr. 2.9.18-2 Detaily kovové trubice a sběrné desky
Vlevo detaily zakončení trubice U vedoucí do 4. patra (vysvětlivky označení a rozměry viz obrázek 2.9.18-1)

Obr. 2.9.18-3 Detaily filtračního patra (5. patro)
Uvedeny rozměry ( Ø průměr). Návaznost na označení v tab. 2.9.18-1.
Tab. 2.9.18-2 Rozměry ⁽¹⁾ trysky s odlučovací deskou

Druh	Označení	1. patro	2. patro	3. patro	4. patro	Filtr (5. patro)
Vzdálenost	1	9,5(-,0+,5)	5,5(-,0+,5)	4,0(-,0+,5)	6,0(-,0+,5)	n
Vzdálenost	2	26	31	33	30,5	0
Vzdálenost	3	8	5	5	5	5
Vzdálenost	4	3	3	3	3	n
Vzdálenost	5	0	3	3	3	3
Vzdálenost	6⁽³⁾	20	25	25	25	25
Vzdálenost	7	n	n	n	8,5	n
Průměr	c	25	14	8,0(±,1)	21	14
Průměr	d	50	30	20	30	n
Průměr	e	27,9	16,5	10,5	23,9	n
Průměr	f	31,75 (,0+,5)	22	14	31	22
Průměr	g	25,4	21	13	30	21
Průměr	h	n	n	n	2,70(±,5)	n
Průměr	j	n	n	n	6,3	n
Průměr	k	n	n	n	12,6	n
Poloměr⁽⁴⁾	r	16	22	27	28,5	0
Poloměr	s	46	46	46	46	n
Poloměr	t	n	50	50	50	50
Úhel	w	10°	53°	53°	53°	53°
Úhel	u	n	n	n	45°	n
Úhel	v	n	n	n	60°	n

⁽¹⁾ Rozměry v milimetrech, tolerance dle ISO 2768-m, pokud není uvedeno jinak.
⁽²⁾ Vztahuje se k obrázku 2.9.18-2.
⁽³⁾ Včetně těsnění.
⁽⁴⁾ Vztaženo na střed komory.
n - nevztahuje se na tuto položku

Obr. 2.9.18-4 Vstupní díl
Rozměry v milimetrech, není-li určeno jinak.
Poznámky
(1) Materiál je z hliníku nebo nerezové oceli.
(2) Strojní opracování z materiálu tvaru tyč kulatá (v průřezu) průměr 38 mm (15").
(3) Díra 19 mm procházející celou tyčí.
(4) Seříznutí trubice přesně 45°.
(5) Vnitřek trubice a úkosu musí být hladký – cca 0,40 μm (16 μm) – leštěný.
(6) Zabroušení spojovacích míst trubice k dosažení vodotěsnosti.
(7) Dva díly trubice s vnitřním otvorem 19 mm se sestaví a po vyvrtání a vyřezání otvorů a závitů šrouby M4 x 0,7 nebo 8-32 se sešroubují. Spoj uvnitř trubice musí být dokonalý, bez převisů a dutin.
Postup pro dávkované tlakové přípravky pro inhalaci
Do každého ze čtyř horních pater přístroje se odměří 20 ml vhodného rozpouštědla schopného rozpustit účinnou látku a nasadí se zátky. Nakloněním přístroje se navlhčí zátky, tím se neutralizují elektrostatické náboje. Na patro č. 5 se vloží vhodný filtr a přístroj se sestaví. Na konci vstupního dílu se upevní vhodný adaptér náustku do takové polohy, aby konec náustku rozprašovače (inhalačního přípravku) byl po zasunutí ve vodorovné poloze shodné s osou vstupního dílu a rozprašovač byl v poloze odpovídající jeho použití. Výpust přístroje se spojí s vhodným odsávacím zařízením (vývěvou) a průtok vzduchu přístrojem se upraví tak, aby do vstupního dílu přicházelo (30 ± 1,5) 1/min vzduchu. Pak se průtok vzduchu vypne.
Není-li v instrukcích pro pacienty předepsáno jinak, protřepává se 5 s inhalátorem, vystříkne se jednou do odpadu. Zapne se odsávání z přístroje. Konec náustku se vsune do spojovacího adaptéru přístroje a stlačí se ventil po dobu zaručující kompletní výstřik (podání). Odpojí se inhalátor od adaptéru a postup se opakuje. Má se uskutečnit jen minimální počet podání, běžně je tento počet nejvíce deset. Při tomto počtu podání má však být zamčeno přesné a správné stanovení dávky jemných částic. Po posledním podání se čeká 5 s a pak se vypne odsávání.
Filtrační patro přístroje se rozebere, opatrně se vyjme filtr a účinná složka se rozpouštědlem kvantitativně vyextrahuje. Pak se z přístroje vyjme vstupní díl a adaptér pro náustek a léčivá látka se opět vyextrahuje. Je-li třeba, vnitřek trubice vedoucí na první patro se propláchne rozpouštědlem, které je na prvním patře a které se pak nechá stéci na patro zpět. Léčivá látka se pak vyextrahuje i z vnitřních stěn a sběrných desek všech čtyř horních pater přístroje, vždy do roztoku, který je na daném patře tak, že se přístroj naklání a otáčí, přičemž je třeba dbát na to, aby tekutina nepřetekla na jiné patro.
Za použití vhodné analytické metody se stanoví množství účinné složky obsažené v každém z šesti objemů roztoku.
Vypočte se množství účinné složky (viz níže uvedené).
Postup pro inhalátory prášku
Na páté patro se vloží vhodný nízkoodporový filtr schopný kvantitativně zachytit léčivou látku a přístroj se sestaví. Přístroj se připojí k odsávacímu systému podle schématu na obrázku 2.9.18-5. Není-li předepsáno jinak, uskuteční se zkouška při průtokové rychlosti Q použité ve zkoušce Stejnoměrnosti podané dávky prosáním 4 litrů vzduchu přes přístroj.
Ke vstupnímu dílu přístroje se připojí průtokoměr kalibrovaný na průtočný objem na výstupu z měřiče. Průtočný kontrolní ventil se nastaví tak, aby průtoková rychlost dosahovala požadované hodnoty Q (± 5 %). Pak se vypne průtok.
Nastaví se kritický průtok přes průtočný kontrolní ventil. U přístroje s připojeným inhalátorem se měří absolutní hodnoty tlaků na obou stranách kontrolního ventilu (odečítací místa P2 a P3 na obrázku 2.9.18-5). Poměr P3/P2 ≤ 0,5 určuje kritický průtok. Když není dosaženo požadovaných hodnot, použije se účinnější vakuová pumpa a měření se opakuje.
Do každého ze čtyř horních pater přístroje se odměří 20 ml vhodného rozpouštědla a nasadí se zátky. Nakloněním přístroje se navlhčí zátky, tím se vyruší elektrostatické náboje. Na konec vstupního dílu se nasadí vhodný adaptér pro náustek přípravku.
Inhalační práškový přípravek se připraví k použití podle instrukcí pro pacienty. Při běžícím odsávání a uzavření dvoucestného ventilu vsune se náustek přípravku do adaptéru vstupního dílu. Otevřením ventilu po doporučenou dobu T (± 5 %) se vefoukne (insufluje) prášek do přístroje. Postup se opakuje. Má se uskutečnit jen minimální počet podání, běžně je tento počet nejvíce deset. Při tomto počtu podání má však být zaručeno přesné a správné stanovení dávky jemných částic. Po posledním podání se čeká 5 s a pak se vypne odsávání.
Filtrační patro přístroje se rozebere, opatrně se vyjme filtr a léčivá látka se rozpouštědlem kvantitativně vyextrahuje. Pak se z přístroje vyjme vstupní díl a adaptér pro náustek a léčivá látka se opět vyextrahuje. Je-li třeba, vnitřek trubice vedoucí na první patro se propláchne rozpouštědlem, které je na prvním patře a které se pak nechá stéci na patro zpět. Léčivá látka se pak vyextrahuje i z vnitřních stěn a sběrných desek všech čtyř horních pater přístroje, vždy do roztoku, který je na daném patře tak, že se přístroj naklání a otáčí, přičemž je třeba dbát na to, aby tekutina nepřetekla na jiné patro.
Za použití vhodné analytické metody se stanoví množství léčivé látky obsažené v každém z šesti objemů roztoku.
Vypočte se množství léčivé látky (viz dále uvedené).

Obr. 2.9.18-5 Aparatura k měření prášků pro inhalaci
Tab. 2.9.18-3 Specifikace dílů k obrázku 2.9.18-5

Označení	Název	Popis
Aa	spojka	vnitřní průměr ≥8 mm, např. krátká kovová spojka s odbočkou o menším průměru k P3
B	vakuová hadice	Vnitřní průměr (8 ± 0,5) mm, délka (50 ± 10) cm, např. silikonová hadice vnějšího průměru 14 mm a vnitřního průměru 8 mm
C	dvoucestný solenoidový ventil	ústí s minimálním odporem průtoku vzduchu, vnitřní průměr ≥8 mm a maximální reakční dobou 100 ms (např. typ 256 A08, Bürkert GmbH, D7118), nebo ekvivalentní
D	vývěva	vyhovuje kapacitou pro požadovanou rychlost toku vzduchu přes sestavenou aparaturu s práškovým inhalačním přípravkem připojeným k adaptéru náustku (např. výrobky typ 1023, 1423 nebo 2565, Gast Manufacturing Inc., Benton Harbor, MI 49022), nebo ekvivalentní. Spojení vývěvy se solenoid, ventilem pomocí krátké a/nebo široké (≥10 mm vnitřní průměr) vakuové hadice, spoje minimalizující ztrátu kapacity vývěvy
E	časový spínač	schopný řízení solenoidového ventilu v požadovaných intervalech (např. typ G814, RS Components International, Corby, NN17 9RS, UK), nebo ekvivalentní
P2, P3	manometry	měření za podmínek stálého toku s převodníkem na absolutní tlak
F	průtočný kontrolní ventil	nastavitelný regulační ventil s maximem Cv ≥1, (např. typ 8FV 12LNSS, Parker Hannifin plc., Barnstaple, EX31 1NP, UIK), nebo ekvivalentní

Přístroj 2 - “Andersenův“ vzorkovač velikostí
Andersenův 1 ACFM vzorkovač velikostí neživých částic z prostředí tvoří 8 hliníkových pater společně s konečnou filtrací. Jednotlivá patra jsou spojena a utěsněna těsněním (O-kroužek). V provedení používaném pro tlakové inhalátory, viz obrázku 2.9.18-6, kuželový vstup vzorkovače je připojen k pravoúhlému, kovovému vstupnímu dílu popsanému na obrázku 2.9.18-4. Použije se vhodný adaptér ke vzduchotěsnému spojení náustku a vstupního dílu. Čelo náustku musí být zarovnáno s čelem vstupního dílu. V sestavě přístroje pro hodnocení práškových inhalačních přípravků umístí se na horní patro předseparátor sloužící k zachycení velkých, nevdechnutelných částic prášku. Připojí se ke vstupnímu dílu, viz obrázek 2.9.18-7. K dosažení vysoké tokové rychlosti přes vzorkovač se připojí přístroj k odsávacímu systému přípojkou o vnitřním průměru ≥8 mm.

Obr. 2.9.18-6 Andersenův vzorkovač velikostí v úpravě pro tlakové přípravky pro inhalaci

Obr. 2.9.18-7 Přípojka vstupního dílu k předseparátoru Andersenova přístroje
Materiál: hliník (lze poniklovat z důvodu chemické inertnosti).
S výjimkou označené, všechny další hrany srazit.
Povrchy strojově leštěné.
Vnitřek trubice zaleštěný na Ra 0,40 μm.
O-kroužek: rozměry: vnitřní průměr 29 mm, vnější průměr 32 mm, šířka 1,8 mm.
Postup pro tlakové inhalační přípravky
Andersenův přístroj se sestaví, včetně vhodného filtru, a zajistí se jeho vzduchotěsnost. Na konci vstupního dílu se upevní vhodný adaptér náustku do takové polohy, aby konec náustku rozprašovače byl po zasunutí ve vodorovné poloze shodné s osou vstupního dílu a rozprašovač byl v poloze odpovídající jeho použití. Výstup z přístroje se spojí s vhodným odsávacím zařízením (vakuovou pumpou) a průtok vzduchu přístrojem se upraví tak, aby do vstupního dílu přicházelo (28,3 ± 1,5) 1/min vzduchu. Pak se průtok vzduchu vypne.
Není-li v instrukcích pro pacienty předepsáno jinak, protřepává se 5 s inhalátorem a vystříkne se jednou do odpadu. Zapne se odsávání z přístroje. Náustek se vsune do adaptéru a z nádobky přípravu v převrácené poloze, stisknutím ventilu po dostatečnou dobu se uskuteční úplný výstřik. Vyjme se inhalační přípravek z adaptéru a postup se opakuje. Má se uskutečnit jen minimální počet podání, běžně je tento počet nejvíce deset. Při tomto počtu podání má však být zamčeno přesné a správné stanovení dávky jemných částic. Po posledním podání se čeká 5 s a pak se vypne odsávání.
Přístroj se rozebere, opatrně se vyjme filtr a léčivá látka se rozpouštědlem kvantitativně vyextrahuje. Vyjme se vstupní díl a adaptér pro náustek a léčivá látka se opět vyextrahuje. Léčivá látka se pak vyextrahuje i z vnitřních stěn a sběrných desek všech pater přístroje.
Za použití vhodné analytické metody se stanoví množství léčivé látky obsažené v každém z devíti objemů roztoku.
Vypočte se množství léčivé látky (viz dále uvedené).
Postup pro inhalátory prášku
Aby Andersenův přístroj mohl být použit pro stanovení u práškových inhalačních přípravků, volí se jiná průtoková rychlost než 28,3 l/min. Dosud nejsou k dispozici všeobecná kalibrační data, a tudíž každý uživatel musí validovat zařízení při jím použitých podmínkách. Lze použít následující postup.
Přístroj se sestaví, připojí se předseparátor, vloží se vhodný filtr a zajistí se vzduchotěsnost zařízení. K zajištění dostatečného zachycení částic se pokryjí povrchy všech desek glycerolem nebo jinou vhodnou viskózní tekutinou. Stejně se pokryje i předseparátor, případně by mohl obsahovat 10 ml vhodného rozpouštědla. Přístroj se připojí k odsávacímu systému tak, jak je uvedeno na obrázku 2.9.18-5.
Není-li předepsáno jinak, uskuteční se zkouška při průtokové rychlosti použité ve zkoušce Stejnoměrnost podané dávky prosáním 4 litrů vzduchu přes přístroj. K dosažení vyšší průtokové rychlosti, je-li potřebné, lze odstranit nejnižší patro ze sestavy přístroje. Ke vstupnímu dílu přístroje se připojí průtokoměr kalibrovaný na průtočný objem na výstupu z měřiče. Průtočný kontrolní ventil se nastaví tak, aby průtoková rychlost dosahovala požadované hodnoty Q (± 5 %). Kritická hodnota průtoku přes kontrolní ventil se nastaví tak, jak je popsáno pro přístroj 1. Vypne se průtok.
Inhalační práškový přípravek se připraví k použití podle instrukcí pro pacienty. Při běžícím odsávání a uzavření dvoucestného ventilu, se vsune náustek přípravku do adaptéru vstupního dílu. Otevřením ventilu po doporučenou dobu T (± 5%) se vefoukne (insufluje) prášek do přístroje. Postup se opakuje. Má se uskutečnit jen minimální počet podání, běžně je tento počet nejvíce deset. Při tomto počtu podání má však být zamčeno přesné a správné stanovení dávky jemných částic. Po posledním podání se čeká 5 s a pak se vypne odsávání.
Přístroj se rozebere, opatrně se vyjme filtr a léčivá látka se rozpouštědlem kvantitativně vyextrahuje. Vyjme se vstupní díl a adaptér pro náustek a léčivá látka se opět vyextrahuje. Léčivá látka se pak vyextrahuje i z vnitřních stěn a sběrných desek všech pater přístroje.
Za použití vhodné analytické metody se stanoví množství léčivé látky obsažené v každém z devíti objemů roztoku.
Vypočte se množství léčivé látky (viz dále uvedené).
Výpočty
Po analýzách všech roztoků se vypočte množství léčivé látky na jedno podání (vstříknutí nebo insuflaci) pro každé patro a množství léčivé látky na jedno podání ve vstupním dílu, adaptéru náustku a i předseparátoru, kde byl použit. Celkové množství léčivé látky není menší než 75 % a není větší než 125 % průměrné podané dávky stanovené při zkoušce na Stejnoměrnost podané dávky. Je-li celkové množství mimo uvedené rozmezí, zkouška se opakuje.
Počínaje filtrem, počítají se kumulativní množství léčivé látky pro vzorkové průměry částic na příslušných patrech (viz tabulka 2.9.18-4 pro přístroj 1 a tabulka 2.9.18-5 pro přístroj 2). Interpolací se vypočte množství léčivé látky pro částice menší než 5 μm, což je dávka jemných částic (anglická zkratka FPD).
Podle potřeby, kde je to vhodné, nakreslí se graf kumulativních frakcí léčivé látky v závislosti na vzorkovém průměru (viz tabulka 2.9.18-4/5) na logaritmickém pravděpodobnostním papíře a tento graf se použije ke stanovení množstevního středního aerodynamického průměru částic a geometrické standardní odchylky. Lze také použít i vhodných výpočetních metod.
Tab. 2.9.18-4 Výpočty pro přístroj 1. Použití

q_{1} = \sqrt{(60 / Q)}

, kde Q je průtoková rychlost v l/min

Vzorkový průměr částic (μm)	Množství usazené léčivé látky na jedno podání	Kumulativní množství usazené léčivé látky na jedno podání	Kumulativní podíl léčivé látky (%)
d₄= 1,7.q₁	z 5. patra, m₅^*	c₄ = m₅	f₄ = (c₄/c).100
d₃ = 3,1.q₁	z 4. patra, m₄	c₃ = c₄ + m₄	f₃ = (c₃/c).100
d₂ = 6,8.q₁	z 3. patra, m₃	c₂= c₃ + m₃	f₂= (c₂/c).100
	z 2. patra, m₂	c₂= c₂ + m₂	100

* 5. patro je filtrační
Tab. 2.9.18-5 Výpočty pro přístroj 2, za podmínky použití 28,3 l/min

Vzorkový průměr částic (μm)	Množství usazené léčivé látky na jedno podání	Kumulativní množství léčivé látky	Kumulativ.podíl léčivé látky (%)
d₇ = 0,4	z 8. patra, m₈	c₇= m₈	f₇= (c₇/c).100
d₆ = 0,7	z 7. patra, m₇	c₆= c₇+ m₇	f₆= (c₆/c).100
d₅= 1,1	z 6. patra, m₆	c₅ = c₆+m₆	f₅ = (c₅/c).100
d₄ = 2,1	z 5. patra, m₅	c₄= c₅ + m₅	f₄ = (c₄/c).100
d₃ = 3,3	z 4. patra, m₄	c₃= c₄ + m₄	f₃ = (c₃/c).100
d₂ = 4,7	z 3. patra, m₃	c₂= c₃ + m₃	f₂= (c₂/c).100
d₁ = 5,8	z 2. patra, m₂	c₁ = c₂+ m₂	f₁ = (c₁/c).100
d₀ = 9,0	z 1. patra, m₁	c₀= c₁ + m₁	f₀= (c₀/c).100
	z 0. patra, m₀	c = c₀+ m₀	100

2.9.20 Hodnocení kontaminace viditelnými částicemi

Podstata zkoušky. Zkouškou se vizuálně hodnotí jakost parenterálních roztoků z hlediska jejich nezáměrné kontaminace cizorodými pohyblivými nerozpuštěnými částicemi, jinými než plynové bubliny. Zkouška umožňuje jednoduchou detekci viditelných částic za níže popsaných podmínek. Lze použít i jiné validované metody.
Zařízení. Zařízením, viz obrázek 2.9.20-1, je pozorovací jednotka, kterou tvoří následující části:
- matná černá deska o příslušné velikosti upevněná ve svislé poloze,
- neoslňující bílá deska o příslušné velikosti upevněná ve svislé poloze vedle černé desky,
- nastavitelný držák osvětlení s vhodným stínítkem, zdroj bílého světla a vhodný difuzor (pozorovací světelný zdroj se dvěma zářivkami 13 W, vhodná délka zářivky je 525 mm). Intenzita osvětlení v místě pozorování je udržována při 2000 luxů až 3750 luxů, vyšší hodnoty jsou vhodnější pro nádoby z barevného skla a plastů.

Obr. 2.9.20-1. Zařízení pro pozorování viditelných částic
Postup zkoušky. Odstraní se nalepené štítky a vnějšek nádoby se umyje a usuší. Opatrně se rozvíří obsah každé pozorované nádoby, nebo se nádoba opatrně obrátí, aby se netvořily vzduchové bubliny, a obsah se pozoruje asi 5 s proti bílé desce. Celý postup se opakuje před černou deskou. Zaznamenává se přítomnost všech částic.

2.9.22 Stanovení doby deformace lipofilních čípků

Podstata zkoušky. Účelem zkoušky je za definovaných podmínek stanovit čas potřebný k deformaci čípku umístěného ve vodném prostředí a vystaveného definované zátěži, která na něj působí.
Přístroj. Přístroj, obrázek 2.9.22-1, se skládá ze skleněné trubice s plochým dnem, která má vnitřní průměr 15,5 mm a délku přibližně 140 mm. Trubice je nahoře uzavřena snímatelným plastickým krytem s otvorem o průměru 5,2 mm. Součástí přístroje je tyč o průměru 5,0 mm, která je u svého dolního konce rozšířená na průměr 12 mm. V jejím plochém dnu je upevněna kovová jehla délky 2 mm a o průměru 1 mm.
Tyč se skládá ze dvou částí, spodní část je z plastického materiálu a horní část je z plastického materiálu nebo kovu s diskem působícím jako zatížení. Horní a dolní část jsou spojeny (ruční verze) nebo rozpojeny (automatická verze). Hmotnost celé tyče je 30 g ± 0,1 g. Na horní části tyče je posuvná prstencová značka. Když se tyč zasune do skleněné trubice tak, aby se dotkla dna, prstencová značka se kryje s horním okrajem plastického krytu.
Postup. Skleněná trubice obsahující 10 ml vody se svisle umístí do vodní lázně vyhřáté na (36,5 ± 0,5) °C do hloubky nejméně 7 cm pod hladinu, aniž by se dotkla dna vodní lázně. Čípek se vloží do trubice špičkou napřed a následně se volně provlékne otvorem krytu tyč do skleněné trubice tak, až se kovová jehla dotkne plochého konce čípku. Upevní se kryt na trubici. Zaznamená se čas, kdy dojde k poklesu tyče na dno skleněné trubice, tj. kdy se prstencová značka kryje s horním okrajem plastického krytu.

Obr. 2.9.22-1 Rozměry v milimetrech

2.9.23 Pyknometrické stanovení hustoty tuhých látek

Podstata zkoušky
Stanoví se objem plynu vytlačeného za definovaných podmínek práškem o známé hmotnosti a vypočítá se pyknometrická hustota tohoto prášku.
Zařízení
Zařízení (viz obrázek 2.9.23-1) je tvořeno:
- hermeticky uzavíratelnou zkušební nádobkou o objemu (V_c) v prázdném stavu spojenou ventilem s referenční nádobkou o referenčním objemu (V_r),
- systémem schopným naplnit zkušební nádobku měřicím plynem do dosažení definovaného tlaku (P), který je měřen manometrem,
- připojením ke zdroji měřicího plynu, jímž je přednostně helium, pokud není předepsán jiný plyn⁽¹⁾.
Teplota plynového pyknometru je 15 °C až 30 °C a nesmí se během měření měnit o více než 2 °C. Zařízení je kalibrováno, to znamená, že objemy (V_c) a (V_r) jsou stanoveny za použití kalibrovaných vyleštěných ocelových kuliček, jejichž celkový objem (asi 6 cm³) je znám s přesností 0,001 cm³. Postup popsaný dále se provádí dvakrát. Nejprve s prázdnou zkušební nádobkou a potom s nádobkou naplněnou ocelovými zkušebními kuličkami. Objemy (V_c) a (V_r) se vypočítají za použití rovnice pro objem vzorku, přičemž je nutno brát v úvahu, že při první zkoušce je objem rovný nule.
Pracovní postup
Zváží se zkušební nádobka pyknometru a zaznamená se její hmotnost. Nádobka se naplní daným množstvím prášku zkoušené látky. Zkušební nádobka pyknometru se neprodyšně uzavře. Těkavé nečistoty v prášku se odstraní jeho odplyněním konstantním proplachováním plynem, někdy musí být zpočátku plyn z prášků odstraněn ve vakuu. Zaznamená se referenční tlak systému (P_r) odečtený na manometru, přičemž je ventil spojující referenční nádobku se zkušební nádobkou otevřený. Ventil se uzavře, čímž se oddělí referenční nádobka od zkušební nádobky. Zkušební nádobka se naplní plynem pod tlakem do počátečního tlaku (P_i) a získaný údaj se zaznamená. Ventil spojující zkušební a referenční nádobky se otevře a zaznamená se konečný tlak (P_f). Postup měření se pro stejný vzorek prášku opakuje, až po sobě následující vypočítané objemy vzorku (V_s) se neliší o více než 0,5 %. Objem vzorku se vyjadřuje v cm³. Zkušební nádobka se vyprázdní a konečná hmotnost (m) prášku se vyjádří v gramech.
Vyjádření výsledků
Objem vzorku (V_s) je dán jedním z následujících dvou výrazů (které jsou ekvivalentní):

V_{s} = V_{c} + \frac{V_{r}}{\frac{P_{i} - P_{r}}{P_{f} - P_{r}} - 1}, V_{s} = V_{c} - \frac{V_{r}}{\frac{P_{i} - P_{r}}{P_{f} - P_{r}} - 1} .

Hustota (ρ) je vyjádřena rovnicí:

ρ = \frac{m}{V_{s}} .

Obr. 2.9.23-1 Schéma plynového pyknometru

V_r - referenční objem	V_c - objem nádobky
V_s - objem vzorku	M - manometr

⁽¹⁾ Jsou-li použity jiné plyny než helium, nemělo by překvapit, když se obdrží hodnoty jiné, než získáné s heliem, protože průnik plynu je závislý na velikosti pórů stejně jako na průřezové ploše pronikající molekuly. Např. hustota porézních materiálů stanovena pyknometricky bude nadhodnocena při měření s použitím dusíku v porovnání s heliem.

2.9.24 Pevnost čípků a vaginálních kuliček

Podstata zkoušky. Zkouška za definovaných podmínek stanoví hmotnost zatížení, při kterém dochází u čípků a vaginálních kuliček k mechanickému porušení.
Používá se pro hydrofobní čípky a hydrofobní vaginální kuličky. Není vhodná pro hydrofilní čípky a hydrofilní vaginální kuličky, např. ze směsi želatiny a glycerolu.
Přístroj. Přístroj (viz obrázky 2.9.24-1 a 2.9.24-2) se skládá z těchto částí:
- temperovaná komora vpředu uzavřená skleněným okénkem a obsahující zařízení k upevnění čípku nebo vaginální kuličky,
- dvě proti sobě postavené čelisti, z nichž horní klesá vertikálně k dolní. Drtící plochy čelistí jsou ploché, kolmé ke směru pohybu a větší než oblast kontaktu s čípkem nebo vaginální kuličkou. Vložka z plastické hmoty je upevněna ve středu čelistí (jedna polovina vložky na každé čelisti). Horní čelist je připojena k závěsu, k němuž je možné přidávat kotouče, z nichž každý váží 200 g. Výchozí hmotnost zatížení je 600 g. Mechanické porušení vzorku se provádí postupným přidáváním kotoučů o hmotnosti 200 g k výchozí hmotnosti zatížení 600 g.

Obr. 2.9.24-1 Přístroj pro měření pevnosti čípků a vaginálních kuliček
Postup. Ověří se, že přístroj je ve vertikální poloze. Komora se ohřeje na 25 °C.
Léková forma, která se má zkoušet, se uchovává nejméně 24 h při požadované teplotě měření. Čípek nebo vaginální kulička se vloží vertikálně mezi čelisti do držáku vzorku špičkou vzhůru. Horní tlakový blok tyče závěsu, na kterou se dává zátěž, se opatrně dá do výchozí polohy a skleněné okénko testovací komory se zavře; pro každé stanovení se čípek nebo vaginální kulička umístí stejným způsobem vzhledem ke směru působící síly.
Po 1 min se přidá první kotouč o hmotnosti 200 g. Opět se počká 1 min a přidá se další kotouč. Tento postup se opakuje, až se čípek nebo vaginální kulička poruší.
Hmotnost potřebná k mechanickému porušení čípku nebo vaginální kuličky se vypočítá jako součet hmotností závaží působících na čípek nebo vaginální kuličku v okamžiku, kdy došlo k mechanickému porušení (včetně výchozí hmotnosti zátěže), podle následujícího postupu:
- jestliže u čípku nebo vaginální kuličky došlo k porušení do 20 s po umístění posledního kotouče, nebere se jeho hmotnost v úvahu,
- jestliže u čípku nebo vaginální kuličky došlo k porušení v době od 20 s do 40 s po umístění posledního kotouče, použije se pro výpočet pouze poloviční hodnota jeho hmotnosti, tj. 100 g,
- jestliže u čípku nebo vaginální kuličky nedošlo k porušení do 40 s po umístění posledního kotouče, použije se pro výpočet celá jeho hmotnost.
Každé stanovení se provede s deseti čípky nebo vaginálními kuličkami a před každým stanovením se odstraní zbytky.

Obr. 2.9.24-2 Vložky pro uchycení vzorku