1. Připraví se kultura v pravidelné hustotě (2 · 10⁴ až 2 · 10⁵ buněk v mililitru, 4 · 10³ až 2,5 · 10⁴ buněk/cm²) a inkubuje se při 36 °C ± 1 °C nejméně dva dny. Naočkuje se zkoušený přípravek a inkubuje nejméně dva dny. Provede se nejméně jedna subkultivace. Poslední subkultura se pěstuje na krycím sklíčku ve vhodné nádobě nebo na nějakém jiném povrchu vhodném pro postup zkoušky. U poslední subkultury se nenechá dojít ke splývání nárůstu, protože by to mohlo inhibovat barvení a narušit zobrazení mykoplazmat.