3 Princip metody
PCR je postup umožňující in vitro specifickou amplifikaci segmentů DNK nebo segmentů RNK po jejich reverzní transkripci na cDNK.
Po denaturaci dvouřetězcové DNK na jednořetězcovou DNK dva syntetické oligonukleotidové primery opačné polarity se přihybridizují k odpovídajícím komplementárním sekvencím DNK, která má být amplifikována. Krátké dvouřetězcové úseky, které jsou výsledkem specifického párování mezi primerem a komplementární sekvencí DNK, ohraničují segment DNK, který bude amplifikován a slouží jako výchozí body pro syntézu DNK in vitro pomocí tepelně stabilní DNK polymerasy.
Amplifikace DNK probíhá v cyklech, které tvoří:
- tepelná denaturace nukleové kyseliny (cílové sekvence) na dva jednoduché řetězce,
- specifické přihybridizování primerů k cílové sekvenci za vhodných reakčních podmínek,
- prodloužení primerů, které jsou navázány na oba jednoduché řetězce, DNK polymerasou při vhodné teplotě (syntéza DNK).
Opakované cykly tepelné denaturace, přihybridizování primerů a syntéza DNK vedou k exponenciální amplifikaci segmentu DNK omezeného primery.
Specifický produkt PCR známý jako amplikon může být detegován různými metodami s vhodnou specifitou a citlivostí.