7 Jištění jakosti

7.1 Validace systému zkoušky PCR
Validační program zahrnuje validaci přístrojů a validaci použitých metod PCR. Doporučení jsou obsažena v Předpisu ICH (hlava Q2B) Validace analytických metod: Metodologie.
Vhodné národní referenční přípravky nebo pracovní referenční přípravky se kalibrují proti mezinárodnímu standardu na cílové sekvence, pro které bude zkouška používána, a tato kalibrace je nezbytná pro validaci PCR zkoušky.
Při validaci se stanoví pozitivní limitní hodnota. Pozitivní limitní hodnota je definována jako minimální počet cílových sekvencí v objemu vzorku, které mohou být detegovány v 95 % zkušebních sérií. Pozitivní limitní hodnota závisí na vzájemně souvisejících faktorech, jako jsou objem extrahovaného vzorku a účinnost extrakční metody, přepis cílové RNK na cDNK, amplifikační postup a detekce.
Pro stanovení detekčního limitu zkušebního systému se uvede odkaz na pozitivní limitní hodnotu pro každou cílovou sekvenci a provedení zkoušky nad a pod tímto bodem.

7.2 Kontrola jakosti zkoumadel
Všechna zkoumadla potřebná pro metodiku se kontrolují dříve, než se běžně použijí. Jejich vhodnost nebo nepřijatelnost je dána předem definovanými kritérii jakosti.
Primery jsou klíčovou složkou zkoušky PCR a je nutné věnovat pečlivou pozornost jejich složení, čistotě a validaci jejich použití ve zkoušce PCR. Každá nová šarže primem se před přijetím zkouší na specificitu, amplifikační účinnost a inhibiční nečistoty. Primery mohou být modifikovány (např. konjugací s fluoroforem nebo antigenem), aby umožnily použití specifické metody detekce amplikonu a to za předpokladu, že tyto modifikace neinhibují přesnost a účinnost amplifíkace cílové sekvence.

7.3 Průběžná kontrola

7.3.1 Vnější kontroly
Ke snížení rizika kontaminace a zajištění dostatečné citlivosti jsou do každé PCR zkoušky zařazeny následující vnější kontroly:
- pozitivní kontrola: obsahuje definovaný počet kopií cílových sekvencí, jejichž počet je stanoven zvlášť pro každý zkušební systém a je určen jako násobek pozitivní limitní hodnoty zkušebního systému,
- negativní kontrola: vzorek téže matrice prokazatelné neobsahující cílové sekvence.

7.3.2 Vnitřní kontroly
Vnitřní kontroly jsou definované sekvence nukleových kyselin obsahující vazebná místa pro příměry. Vnitřní kontroly jsou amplifikovány s podobnou účinností jako zkoušená cílová sekvence, ale amplikony jsou jasně rozpoznatelné. Vnitřní kontroly jsou téhož typu nukleové kyseliny (DNK/RNK) jako zkoušený materiál. Vnitřní kontrola se přidává ke zkoušenému materiálu před izolací nukleové kyseliny, a slouží proto jako celková kontrola (extrakce, reverzní transkripce, amplifikace, detekce).

7.4 Vnější hodnocení jakosti
Účast v programech vnějšího hodnocení jakosti je důležitým postupem jištění jakosti PCR pro každou laboratoř a každého pracovníka.