A. Difuzní metoda
Živná půda vhodná pro stanovení se rozehřeje a při vhodné teplotě, např. 48 °C až 50 °C pro vegetativní formy, se naočkuje suspenzí mikroorganismů citlivých na zkoušené antibiotikum v takovém množství, které vytváří zřetelně ohraničené inhibiční zóny o průměru přiměřeném koncentraci zkoušeného antibiotika. Naočkovaná půda se ihned vylije do Petriho misek nebo velkých pravoúhlých misek (ploten) v takovém množství, aby se vytvořila jednolitá vrstva silná 2 mm až 5 mm. Živná půda může být též vylita ve dvou vrstvách, z nichž jenom vrchní je naočkována. Takto připravené misky se uchovávají tak, aby před použitím nedošlo k viditelnému růstu mikroorganismů nebo k jejich usmrcení a aby povrch půd byl v čase použití suchý.
Pro přípravu roztoků stejných účinností a známých koncentrací zkoušeného antibiotika a referenční látky se použijí rozpouštědla a tlumivé roztoky uvedené v tabulce 2.7.2-1. Roztoky se nanesou buď na povrch půdy, např. do sterilních cylindříků z porcelánu, z nerezavějící oceli, případně z jiných vhodných materiálů, nebo do otvorů vyříznutých v živné půdě. Do každého cylindříku nebo otvoru se přidá stejný objem roztoků. Lze též použít sterilní disky z absorbujícího papíru vhodné kvality, které se před položením na půdu napustí roztoky referenční látky nebo zkoušeného antibiotika.
K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři rozdílné dávky referenční látky a tři odpovídající dávky zkoušeného antibiotika s předpokládanou stejnou účinností jako dávky referenční látky. Doporučuje se používat geometrickou řadu dávek. Při běžných stanoveních, u nichž je prokázán lineární průběh systému na přiměřeném počtu třídávkových stanovení, a pokud s tím souhlasí oprávněná autorita, může postačovat i dvoudávkové stanovení. Ve všech sporných případech se však použije metoda třídávková, jak je předepsáno výše.
Do každé Petriho misky nebo pravoúhlé misky se nanesou roztoky podle statisticky vhodného plánu. V případě malých misek, které nepojmou více než šest roztoků, se doporučuje měnit umístění roztoku zkoušeného antibiotika a referenční látky, aby se zabránilo interakcím koncentrovanějších roztoků.
Inkubuje se při vhodné teplotě asi 18 h. Doba předinkubační difuze, obvykle 1 h až 4 h, při pokojové teplotě nebo 4 °C, jak je vhodné, se může použít k potlačení účinku časových rozdílů mezi aplikací roztoků a tak zlepšit regresi.
Změří se průměry kruhových inhibičních zón s přesností nejméně 0,1 mm nebo jejich plochy s přesností. Pomocí vhodných statistických metod se vypočítá účinnost zkoušeného antibiotika.
V každé zkoušce se použije pro každou dávku tolik inhibičních zón, aby byla zajištěna požadovaná přesnost. Stanovení účinnosti se může opakovat a výsledky mohou být statisticky sloučeny, aby se dosáhlo požadované přesnosti stanovení a ověřilo se, že účinnost zkoušeného antibiotika není menší než požadované minimum.
Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda
| Antibiotikum | Referenční látka | Rozpouštědlo k přípravě základního roztoku | Tlumívý roztok (pH) | Mikroorganis-mus | Půda a konečné pH (± 0,1) | Inkubační teplota (°C) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Amphotericinum B | Amphotericinum B CRL | Dimethyl-formamid R | pH 10,5 (0,2 mol/l) | Saccharomy-cescerevisiae IP 1432.83 ATCC 9763 CCM 8191 CNCTC 51/65 | F – pH 6,1 | 35 až 37 |
| Bacitracinum zincium | Bacitracinum zincicum CRL | kyselina chlorovodíková 0,01 mol/l VS | pH 7,0 (0,05 mol/l) | Micrococcus flavus NCTC 7743 CIP 53.160 ATCC 10240 CCM 732 CNCTC M 8/58 | A – pH 7,0 | 35 až 39 |
| Bleomycini sulfas | Bleomycini sulfas CRL | voda R | pH 6,8 (0,1 mol/l) | Mycobacterium smegmatis ATCC 607 CCM 4622 CNCTC My 23/64 | G – pH 7,0 | 35 až 37 |
| Colistini sulfas | Colistini sulfas CRL | Bordetella bronchiseptica NCTC 8344 CIP 53.157 ATCC 4617 | B – pH 7,3 | 35 až 39 | ||
| Colistimethatum natricum | Colistimethatum natricum CRL | voda R | pH 6,0 (0,05 mol/l) | CCM 4416 CNCTC Brb 5/63 Escherichia coli NCIB 8879 CIP 54.127 ATCC 10536 CCM 3988 CNCTC Ec 326/71 | B – pH 7,3 | 35 až 39 |
| Dihydro- streptomycini sulfas | Dihydro-streptomycini sulfas CRL | voda R | pH 8,0 (0,05 mol/l) | Bacillus subtilis NCTC 8236 CIP 1.83 CCM 2217 | A – pH 7,9 | 30 až 37 |
| CNCTC Bs 17/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 | A – pH 7,9 | 30 až 37 | ||||
| Erythromycini estolas | Erythromycinum CRL | methanol R viz články | Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 | A – pH 7,9 | 30 až 37 | |
| Erythromycini ethylsuccinas | methanol R | pH 8,0 (0,05 mol/l) | ||||
| Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 | A – pH 7,9 | 30 až 37 | ||||
| Erythromycini stearas | ||||||
| Framycetini sulfas | Framycetini sulfas CRL | voda R | pH 8,0 (0,05 mol/l) | Bacillus subtilis | E – pH 7,9 | 30 až 37 |
| NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 | E – pH 7,9 | 30 až 37 | ||||
| Gentamicini sulfas | Gentamicini sulfas CRL | voda R | pH 8,0 (0,05 mol/l) | Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 Staphylococcus epidermidis NCIB 8853 CEP 68.21 ATCC 12228 CCM 4418 NCTC M 12/63 | A – pH 7,9 A – pH 7,9 | 35 až 39 35 až 39 |
| Kanamycini monosulfas | Bacillus Subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 Staphylo coccus aureus NCTC 7447 CEP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 | A – pH 7,9 | 30 až 37 | |||
| Kanamycini monosulfas CRL | voda R | pH 8,0 (0,05 mol/l) | ||||
| Kanamycini sulfas acidus | A – pH 7,9 | 35 až 39 | ||||
| Neomycini sulfas | Neomycini sulfas CRL | voda R | pH 8,0 (0,05 mol/l) | Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 | E – pH 7,9 | 30 až 37 |
| E – pH 7,9 | 30 až 37 | |||||
| Netilmicini sulfas | Netilmicini sulfas CRL | voda R | pH 8 ± 0,1 | Staphylococcus aureus CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 | A – pH 7,9 | 32 až 35 |
| Nystatinum | Nystatinum CRL | dimethyl-formamid R | pH 6,0 (0,05 mol/l) obsahující 5 % (V/V) dimethyl-formamidu R | Candida tropicalis CIP 1433-83 NCYC 1393 CCM8223 Saccharomyces cerevisiae NCYC 87 CIP 1432.83 ATCC 9763 CCM 8191 CNCTC 51/65 | F – pH 6,0 | 30 až 37 30 až 32 |
| Polymyxini B sulfas | Polymyxini B sulfas CRL | voda R | pH 6,0 (0,05 mol/l) | Bordetella bronchiseptica NCTC 8344 CEP 53.157 ATCC 4617 CCM 4416 CNCTC Brb 5/63 | B – pH 7,3 | 35 až 39 |
| Rifamycinum natricum | Rifamycinum natricum CRL | methanol R | pH 7,0 (0,05 mol/l) | Micrococcus flavus NCTC 8340 CIP 53.45 ATCC 9341 CCM 552 CNCTC Sar 5/58 | A – pH 6,6 | 35 až 39 |
| Spiramycinum | Spiramycinum CRL | methanol R | pH 8,0 (0,05 mol/l) | Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 | A – pH 7,9 | 30 až 32 |
| Streptomycini sulfas | Streptomycini sulfas CRL | voda R | pH 8,0 (0,05 mol/l) | Bacillus subtilis NCTC 8236 CIP 1.83 CCM 2217 CNCTC Bs 17/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 | A – pH 7,9 | 30 až 32 |
| A – pH 7,9 | 30 až 32 | |||||
| Tobramycinum | Tobramycinum CRL | voda R | pH 8,0 (0,05 mol/l) | Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 | A – pH 7,9 | 30 až 37 |
| Tylosinum a.u.v. | Tylosinum CRL | roztok methanolu R (2,5 % (V/V)) v tlumivém roztoku fosforečnano-vém o pH 7,0 (0,1 mol/l) | směs objemových dílů methanolu R a tlumivého roztoku fosforečnanové-ho o pH 8,0 (0,1 mol/l) (40 + 60) | Micrococcus flavus NCTC 8340 CIP 53.45 ATCC 9341 CCM 552 CNCTC Sar 5/58 | A – pH 8,0 | 32 až 35 |
| Tylosini tartras a.u.v. | ||||||
| Vancomycini hydrochloridum | Vancomycini hydrochloridum CRL | voda R | pH 8,0 | Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 | A – pH 8,0 | 37 až 39 |