2.7 Metody stanovení účinnosti
| 2.7.2 Mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik |
Účinnost antibiotika se stanoví porovnáním inhibice růstu citlivých mikroorganismů vyvolané známými koncentracemi zkoušeného antibiotika a referenční látky.
Referenční látky použité ke stanovení jsou ty, jejichž účinnost byla přesně stanovena v poměru k odpovídajícímu mezinárodnímu standardu nebo mezinárodnímu referenčnímu přípravku.
Plán stanovení je takový, aby dovolil ověřit validitu matematického modelu, na němž je založeno porovnání účinnosti. Je-li vybrán model rovnoběžných přímek, dvě logaritmické přímky dávky a odpovědi (nebo transformované odpovědi) zkoušeného přípravku a referenčního přípravku jsou rovnoběžné a jsou lineární v intervalu dávek použitých k výpočtu. Tyto podmínky se validují pro danou hladinu pravděpodobnosti, obvykle P = 0,05. Jiné matematické modely, jako model např. regresního poměru, mohou být též použity, je-li prokázána validita zkoušky.
Pokud není v článku uvedeno jinak, je interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovení nejméně 95 % a nejvýše 105 % stanovené účinnosti.
Stanovení se provádí metodou A nebo metodou B.
Doporučené mikroorganismy
Následující text uvádí doporučené mikroorganismy a podmínky jejich použití. Jiné mikroorganismy se mohou použít, pokud mají prokazatelně stejnou citlivost na zkoušené antibiotikum a použijí se ve vhodné živné půdě a ve vhodných podmínkách teploty a pH. Výběr koncentrací roztoků se má provést tak, aby zaručil, že v podmínkách zkoušky existuje lineární vztah mezi logaritmem dávky a odpovědí.
Příprava inokula
Bacillus subtilis a Bacillus pumilus. Suspenze spor mikroorganismu použitého k naočkování se připraví takto:
Mikroorganismy se kultivují 7 dní při 35 °C až 37 °C na vhodné pevné půdě, do které byl přidán síran manganatý R (1 mg/l). Nárůst, který obsahuje zejména spory, se spláchne sterilní vodou R. Suspenze se 30 min zahřívá při 70 °C a potom se zředí na přiměřenou koncentraci spor, obvykle 10.106 až 100.106 v ml. Suspenze spor se mohou uchovávat po dlouhou dobu při teplotě nepřevyšující 4 °C.
Alternativně se mohou suspenze spor připravit kultivací mikroorganismů v půdě C při 26 °C po dobu 4 dní až 6 dní. Potom se asepticky přidá dostatek síranu manganatého R do koncentrace 1 mg/l a inkubuje se dalších 48 h. V suspenzi se mikroskopicky zjistí, zda proběhla přiměřená tvorba spor (asi 80 %), a suspenze se odstředí. Sediment se resuspenduje ve sterilní vodě R tak, aby se dosáhla koncentrace spor v ml 10.106 až 100.106, a potom se zahřívá 30 min na 70 °C. Suspenze se uchovává při teplotě nepřevyšující 4 °C.
Bordetella bronchiseptica. Testovací mikroorganismus se kultivuje na půdě B 16 h až 18 h při 35 °C až 37 °C. Nárůst se smyje sterilní vodou R a zředí na vhodný zákal.
Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Micrococcus flavus, Staphylococcus epidermidis. Připraví se stejně, jak je popsáno v odstavci Bordetella bronchiseptica, ale použije se půda A a naředí se na takový zákal, který při turbidimetrickém stanovení prokazatelně poskytuje uspokojující vztah dávky k odpovědi nebo při difuzním stanovení vytváří zřetelně ohraničené inhibiční zóny postačujícího průměru.
Sacharomyces cerevisiae, Candida tropicalis. Testovací mikroorganismus se kultivuje 24 h na půdě F při 30 °C až 37 °C. Nárůst se smyje sterilním roztokem chloridu sodného R (9 g/l) a zředí se jím na vhodný zákal.
Tlumivé roztoky
Tlumivé roztoky o pH v rozmezí 5,8 až 8,0 se připraví smícháním 50,0 ml dihydrogenfosforečnanu draselného 0,2 mol/l RS s množstvím hydroxidu sodného 0,2 mol/l RS, uvedeným v následující tabulce a doplněním čerstvě připravenou vodou destilovanou R na 200,0 ml.
Tab. 2.7.2-3
| pH | množství hydroxidu sodného 0,2 mol/l RS v ml |
|---|---|
| 5,8 | 3,72 |
| 6,0 | 5,70 |
| 6,2 | 8,60 |
| 6,4 | 12,60 |
| 6,6 | 17,80 |
| 6,8 | 23,65 |
| 7,0 | 29,63 |
| 7,2 | 35,00 |
| 7,4 | 39,50 |
| 7,6 | 42,80 |
| 7,8 | 45,20 |
| 8,0 | 46,80 |
Tyto tlumivé roztoky se použijí pro všechny mikrobiologické zkoušky uvedené v tabulce 2.7.2-1 s výjimkou:
1) bleomyciniumsulfatu, pro který se tlumivý roztok o pH 6,8 připraví takto: rozpustí se 6,4 g dihydrogenfosforečnanu draselného R a 18,9 g hydrogenfosforečnanu sodného R ve vodě R a zředí se jí na 1000,0 ml.
2) amfotericinu, na který se tlumivý roztok o pH 10,5 (0,2 mol/l) připraví takto: 35,08 g hydrogenfosforečnanu draselného R se rozpustí ve vodě destilované R, přidá se 1,12 g hydroxidu draselného R a zředí se vodou destilovanou R na 1000,0 ml.
Živné půdy
Mohou se použít následující půdy nebo půdy jím rovnocenné.
| Půda A | |
|---|---|
| pepton | 6 g |
| pankreatický hydrolyzát kaseinu | 4 g |
| hovězí výtažek | 1,5 g |
| kvasničný výtažek | 3 g |
| glukosa monohydrát | 1 g |
| agar | 15 g |
| voda | do 1000 ml |
| Půda B | |
| pankreatický hydrolyzát kaseinu | 17 g |
| papainový hydrolyzát sóji | 3 g |
| chlorid sodný | 5 g |
| hydrogenfosforečnan draselný | 2,5 g |
| glukosa monohydrát | 2,5 g |
| agar | 15 g |
| polysorbát 80 | 10 g |
| voda | do 1000 ml |
Polysorbát 80 se přidá k horkému roztoku ostatních složek po jejich rozvaření a bezprostředně před upravením objemu.
| Půda C | |
|---|---|
| pepton | 6 g |
| hovězí výtažek | 1,5 g |
| kvasničný výtažek | 3 g |
| chlorid sodný | 3,5 g |
| glukosa monohydrát | 1 g |
| hydrogenfosforečnan draselný | 3,68 g |
| dihydrogenfosforečnan draselný | 1,32 g |
| voda | do 1000 ml |
| Půda D | |
| výtažek ze srdce | 1,5 g |
| kvasničný výtažek | 1,5 g |
| pepton z kaseinu | 5,0 g |
| glukosa monohydrát | 1 g |
| chlorid sodný | 3,5 g |
| hydrogenfosforečnan draselný | 3,68 g |
| dihydrogenfosforečnan draselný | 1,32 g |
| dusičnan draselný | 2 g |
| voda | do 1000 ml |
| Půda E | |
|---|---|
| pepton | 5 g |
| masový výtažek | 3 g |
| hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát | 26,9 g |
| agar | 10 g |
| voda | do 1000 ml |
Hydrogenfosforečnan sodný se přidá jako sterilní roztok po sterilizaci půdy.
| Půda F | |
|---|---|
| pepton | 9,4 g |
| kvasničný výtažek | 4,7 g |
| hovězí výtažek | 2,4 g |
| chlorid sodný | 30,0 g |
| glukosa monohydrát | 10,0 g |
| agar | 23,5 g |
| voda | do 1000 ml |
| Půda G | |
| glycerol | 10 g |
| pepton | 10 g |
| masový výtažek | 10 g |
| chlorid sodný | 3 g |
| agar | 15 g |
| voda | do 1000 ml |
pH 7 ± 0,1 po sterilizaci
| 2.7.10 Stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru VII |
Podstata zkoušky. Při stanovení účinnosti koagulačního faktoru VII se využívá jeho biologické aktivity v komplexu faktor Vlla-tkáňový faktor při aktivaci faktoru X za přítomnosti vápenatých iontů a fosfolipidů. Účinnost přípravku faktoru VII se stanoví porovnáním množství přípravku potřebného k dosažení určitého stupně tvorby faktoru Xa ve zkoušené směsi obsahující látky účastnící se aktivace faktoru X s množstvím mezinárodního standardu nebo porovnávacího přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, které je zapotřebí ke stejnému stupni tvorby faktoru Xa.
Mezinárodní jednotka je účinnost faktoru VII obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaná plazma. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.
Metoda chromogenního stanovení účinnosti se skládá ze dvou fází: z aktivace reakční směsi faktoru X, která obsahuje tkáňový faktor, fosfolipidy a vápenaté ionty a závisí na faktoru VII, a z následného enzymatického rozštěpení chromogenního substrátu faktoru Xa na chromofor, jehož množství se může stanovit spektrofotometricky.
Za vhodných podmínek stanovení účinnosti je lineární závislost mezi stupněm tvorby faktoru Xa a koncentrací faktoru VII. Stanovení účinnosti je shrnuto ve schématu na obrázku 2.7.10-1.
V obou fázích se používají zkoumadla, která lze získat komerčně z různých zdrojů. Ačkoliv se složení jednotlivých zkoumadel může lišit, existují jejich nezbytné vlastnosti, které jsou dále podrobně popsány.
Fáze 1: a) faktor VIIfaktor VIIa
Fáze 2: chromogenní substrátpeptid + chromofor
Obr. 2.7.10-1. Schematické znázornění stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru VII
Zkoumadla
Názvem zkoumadla koagulačního faktoru se označuje skupina přečištěných bílkovin lidského či hovězího původu. Zahrnuje faktor X a tromboplastinový tkáňový faktor/fosfolipid jako aktivátor faktoru VII. Tyto bílkoviny jsou částečně přečištěny a neobsahují nečistoty, které zasahují do aktivace faktoru VII nebo faktoru X. Faktor X je přítomen v množství, které během první fáze stanovení dává konečnou koncentraci 10 nmol/l až 350 nmol/l, přednostně 14 nmol/l až 70 nmol/l. Jako tkáňový faktor/fosfolipid se mohou používat tromboplastin přírodního původu (hovězí nebo králičí mozek) nebo syntetické přípravky. Tromboplastin vhodný ke stanovení tromboplastinového času se ředí 1 : 5 až 1 : 50 tlumivým roztokem tak, aby konečná koncentrace vápenatých iontů byla 15 mmol/l až 25 mmol/l. Konečná tvorba faktoru Xa probíhá v roztoku, který obsahuje lidský nebo hovězí albumin v takové koncentraci, že nedochází k adsorpčním ztrátám, a jehož pH je vhodně upraveno na 7,3 až 8,0. V konečné inkubační směsi je faktor VII jedinou složkou limitující stupeň tvorby faktoru Xa a žádná reakční složka nemá mít vlastní schopnost tvořit faktor Xa.
Ve druhé fázi se určí množství vzniklého faktom Xa za použití chromogenního substrátu, který je specifický pro faktor Xa. Obvykle je tvořen krátkým peptidem o třech až pěti aminových kyselinách vázaným na chromoforovou skupinu. Při odštěpení této skupiny od peptidového substrátu se její absorpční maximum posune k vlnové délce umožňující spektrofotometrické stanovení množství. Substrát se obvykle rozpustí ve vodě R a používá se ve výsledné koncentraci 0,2 mmol/l až 2 mmol/l. Substrát může také obsahovat vhodné inhibitory k zastavení další tvorby faktoru Xa (přidání edetanu).
Postup stanovení účinnosti
Celý obsah jedné ampule porovnávacího přípravku a zkoušeného přípravku se rozpustí přidáním vhodného množství vody R; použije se během 1 h. Rozpuštěné přípravky se dále naředí tak, aby vznikly roztoky obsahující 0,5 m.j. až 2,0 m.j. faktoru VII v mililitru.
Připraví se další ředění porovnávacího a zkoušeného přípravku za použití izotonického tlumivého roztoku nevázajícího vápník, která obsahují 1 % hovězího nebo lidského albuminu a přednostně mají pH 7,3 až 8,0. Připraví se nejméně tři oddělená nezávislá ředění pro každý přípravek, nejlépe ve dvojici. Ředění se připraví tak, aby konečná koncentrace faktoru VII byla nižší než 0,005 m.j. v mililitru.
Připraví se kontrolní roztok, který obsahuje všechny složky kromě faktoru VII.
Všechna ředění se připravují ve zkumavkách z plastů a použijí se během 1 h.
| 2.7.11 Stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru IX |
Podstata zkoušky. Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví porovnáním množství přípravku potřebného ke zkrácení srážecího času zkušební směsi obsahující jiné látky než faktor IX, jež se podílejí na srážení krve, s množstvím porovnávacího přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, které je zapotřebí k vyvolání stejného účinku.
Mezinárodní jednotka je účinnost deklarovaného množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaný koncentrát lidského koagulačního faktoru IX. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.
Postup stanovení. Zkoušený přípravek a porovnávací přípravek se odděleně rozpustí podle návodu uvedeného v označení na obalu a ihned se použijí. Pokud přípravek obsahuje heparin, stanoví se jeho množství (2.7.12) a heparin se neutralizuje přidáním protaminiumsulfatu R (10 μg protaminiumsulfatu neutralizuje 1 m.j. heparinu). Zkoušený přípravek a porovnávací přípravek se zředí dostatečným množstvím tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 tak, aby se získaly roztoky obsahující 0,5 m.j. až 2,0 m.j. v mililitru. Směsí objemových dílů roztoku citronanu sodného R (38 g/l) a tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 (1 + 5) se připraví řada dvojnásobných ředění v rozmezí 1 : 10 až 1 : 80. Tato ředění je třeba připravit přesně a ihned je použít.
Použijí se např. inkubační zkumavky, které se ponechají ve vodní lázni při 37 °C. Do každé z nich se dá 0,1 ml plazmy substrátu RS2 a 0,1 ml příslušného ředění zkoušeného nebo porovnávacího přípravku. Do každé zkumavky se přidá 0,1 ml vhodného ředění zkoumadla cefalinového R nebo krevních destiček náhrady R a 0,1 ml suspenze 0,5 g kaolinu lehkého R ve 100 ml roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Pak se obsah zkumavek inkubuje 10 min za stálého protřepávání. Do každé zkumavky se přidá 0,1 ml chloridu vápenatého R (7,4 g/l).
Pomocí stopek se změří srážecí čas, tj. interval mezi přidáním chloridu vápenatého a prvními známkami tvorby fibrinu, což je možno určit vizuálně nebo vhodným přístrojem. K výpočtu účinnosti se použijí obvyklé statistické metody (např. 5.3 Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek).
Aby se zajistilo, že plazma substrát RS2 neobsahuje zjistitelnou kontaminaci faktorem IX, provede se slepá zkouška, v níž se místo zkoušeného přípravku použije odpovídající množství směsi objemových dílů roztoku citronanu sodného R (38 g/l) a tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 R (1 + 5). Zkoušku lze hodnotit, jestliže srážecí čas slepé zkoušky je v rozmezí 100 s až 200 s.
| 2.7.12 Stanovení účinnosti heparinu v koncentrátech koagulačních faktorů |
Podstata zkoušky. Měří se absorbance při 405 nm roztoku zkoušeného vzorku a roztoku referenčního přípravku heparinu po inkubaci s definovaným nadbytkem trombinu a chromogenního substrátu specifického pro trombin. Nárůst absorbance (v závislosti na množství uvolněného p-nitroanilinu) při 405 nm je nepřímo úměrný množství heparinu ve vzorku.
Zkoušené roztoky. Přípravek se rozpustí předepsaným způsobem a naředí se vhodným tlumivým roztokem (např. roztok chloridu sodného R (7 g/l) a citronanu sodného R (6 g/l) o pH 7,3) na koncentraci asi 0,25 m.j. heparinu v mililitru. Připraví se řada ředění (až do 1 : 32) za použití vhodného tlumivého roztoku (např. roztok trometamolu R (6 g/l), kyseliny edetové R (2,2 g/l), chloridu sodného R (11,3 g/l) o pH 8,4). Naředěné roztoky se nechají stát 30 min.
Porovnávací roztoky. Referenční přípravek heparinu se naředí vhodným tlumivým roztokem (např. roztok trometamolu R (6 g/l), kyseliny edetové R (2,2 g/l), chloridu sodného R (11,3 g/l) o pH 8,4) na koncentraci asi 0,25 m.j. heparinu v mililitru a připraví se řada ředění (až do 1 : 32).
Postup stanovení. Do řady zkumavek z plastu se napipetuje po 200 μl zkoušeného roztoku nebo porovnávacího roztoku nebo kontrolního roztoku (tlumivý roztok použitý k ředění) a po 200 μl roztoku antitrombinu III R (3 m.j./ml). Směs se nechá stát 30 min a přidá se po 200 μl roztoku trombinu hovězího R (20 m.j./ml). Řádně se promíchá pomocí vibrační míchačky a nechá se stát 90 s při 37 °C.
Připraví se roztok chromogenního substrátu specifického pro trombin v koncentraci odpovídající nejméně dvojnásobku hodnoty Km (Michaelisovy konstanty).
Substrátový roztok se ohřeje na 37 °C a přidá se po 200 μl do každé zkumavky, která obsahuje zkoušený roztok, porovnávací roztok nebo kontrolní roztok. Vše se řádně promíchá pomocí vibrační míchačky. Inkubuje se 90 s při 37 °C a reakce se zastaví přidáním po 200 μl roztoku kyseliny octové R (500 g/l C2H4O2) a změří se absorbance při 405 nm.
Obsah heparinu ve zkoušeném přípravku se vypočítá za použití obvyklých statistických metod (např. 5.3. Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek).
b) faktor Xfaktor Xa
A. Difuzní metoda
Živná půda vhodná pro stanovení se rozehřeje a při vhodné teplotě, např. 48 °C až 50 °C pro vegetativní formy, se naočkuje suspenzí mikroorganismů citlivých na zkoušené antibiotikum v takovém množství, které vytváří zřetelně ohraničené inhibiční zóny o průměru přiměřeném koncentraci zkoušeného antibiotika. Naočkovaná půda se ihned vylije do Petriho misek nebo velkých pravoúhlých misek (ploten) v takovém množství, aby se vytvořila jednolitá vrstva silná 2 mm až 5 mm. Živná půda může být též vylita ve dvou vrstvách, z nichž jenom vrchní je naočkována. Takto připravené misky se uchovávají tak, aby před použitím nedošlo k viditelnému růstu mikroorganismů nebo k jejich usmrcení a aby povrch půd byl v čase použití suchý.
Pro přípravu roztoků stejných účinností a známých koncentrací zkoušeného antibiotika a referenční látky se použijí rozpouštědla a tlumivé roztoky uvedené v tabulce 2.7.2-1. Roztoky se nanesou buď na povrch půdy, např. do sterilních cylindříků z porcelánu, z nerezavějící oceli, případně z jiných vhodných materiálů, nebo do otvorů vyříznutých v živné půdě. Do každého cylindříku nebo otvoru se přidá stejný objem roztoků. Lze též použít sterilní disky z absorbujícího papíru vhodné kvality, které se před položením na půdu napustí roztoky referenční látky nebo zkoušeného antibiotika.
K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři rozdílné dávky referenční látky a tři odpovídající dávky zkoušeného antibiotika s předpokládanou stejnou účinností jako dávky referenční látky. Doporučuje se používat geometrickou řadu dávek. Při běžných stanoveních, u nichž je prokázán lineární průběh systému na přiměřeném počtu třídávkových stanovení, a pokud s tím souhlasí oprávněná autorita, může postačovat i dvoudávkové stanovení. Ve všech sporných případech se však použije metoda třídávková, jak je předepsáno výše.
Do každé Petriho misky nebo pravoúhlé misky se nanesou roztoky podle statisticky vhodného plánu. V případě malých misek, které nepojmou více než šest roztoků, se doporučuje měnit umístění roztoku zkoušeného antibiotika a referenční látky, aby se zabránilo interakcím koncentrovanějších roztoků.
Inkubuje se při vhodné teplotě asi 18 h. Doba předinkubační difuze, obvykle 1 h až 4 h, při pokojové teplotě nebo 4 °C, jak je vhodné, se může použít k potlačení účinku časových rozdílů mezi aplikací roztoků a tak zlepšit regresi.
Změří se průměry kruhových inhibičních zón s přesností nejméně 0,1 mm nebo jejich plochy s přesností. Pomocí vhodných statistických metod se vypočítá účinnost zkoušeného antibiotika.
V každé zkoušce se použije pro každou dávku tolik inhibičních zón, aby byla zajištěna požadovaná přesnost. Stanovení účinnosti se může opakovat a výsledky mohou být statisticky sloučeny, aby se dosáhlo požadované přesnosti stanovení a ověřilo se, že účinnost zkoušeného antibiotika není menší než požadované minimum.
Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda
| Antibiotikum | Referenční látka | Rozpouštědlo k přípravě základního roztoku | Tlumívý roztok (pH) | Mikroorganis-mus | Půda a konečné pH (± 0,1) | Inkubační teplota (°C) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Amphotericinum B | Amphotericinum B CRL | Dimethyl-formamid R | pH 10,5 (0,2 mol/l) | Saccharomy-cescerevisiae IP 1432.83 ATCC 9763 CCM 8191 CNCTC 51/65 | F – pH 6,1 | 35 až 37 |
| Bacitracinum zincium | Bacitracinum zincicum CRL | kyselina chlorovodíková 0,01 mol/l VS | pH 7,0 (0,05 mol/l) | Micrococcus flavus NCTC 7743 CIP 53.160 ATCC 10240 CCM 732 CNCTC M 8/58 | A – pH 7,0 | 35 až 39 |
| Bleomycini sulfas | Bleomycini sulfas CRL | voda R | pH 6,8 (0,1 mol/l) | Mycobacterium smegmatis ATCC 607 CCM 4622 CNCTC My 23/64 | G – pH 7,0 | 35 až 37 |
| Colistini sulfas | Colistini sulfas CRL | Bordetella bronchiseptica NCTC 8344 CIP 53.157 ATCC 4617 | B – pH 7,3 | 35 až 39 | ||
| Colistimethatum natricum | Colistimethatum natricum CRL | voda R | pH 6,0 (0,05 mol/l) | CCM 4416 CNCTC Brb 5/63 Escherichia coli NCIB 8879 CIP 54.127 ATCC 10536 CCM 3988 CNCTC Ec 326/71 | B – pH 7,3 | 35 až 39 |
| Dihydro- streptomycini sulfas | Dihydro-streptomycini sulfas CRL | voda R | pH 8,0 (0,05 mol/l) | Bacillus subtilis NCTC 8236 CIP 1.83 CCM 2217 | A – pH 7,9 | 30 až 37 |
| CNCTC Bs 17/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 | A – pH 7,9 | 30 až 37 | ||||
| Erythromycini estolas | Erythromycinum CRL | methanol R viz články | Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 | A – pH 7,9 | 30 až 37 | |
| Erythromycini ethylsuccinas | methanol R | pH 8,0 (0,05 mol/l) | ||||
| Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 | A – pH 7,9 | 30 až 37 | ||||
| Erythromycini stearas | ||||||
| Framycetini sulfas | Framycetini sulfas CRL | voda R | pH 8,0 (0,05 mol/l) | Bacillus subtilis | E – pH 7,9 | 30 až 37 |
| NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 | E – pH 7,9 | 30 až 37 | ||||
| Gentamicini sulfas | Gentamicini sulfas CRL | voda R | pH 8,0 (0,05 mol/l) | Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 Staphylococcus epidermidis NCIB 8853 CEP 68.21 ATCC 12228 CCM 4418 NCTC M 12/63 | A – pH 7,9 A – pH 7,9 | 35 až 39 35 až 39 |
| Kanamycini monosulfas | Bacillus Subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 Staphylo coccus aureus NCTC 7447 CEP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 | A – pH 7,9 | 30 až 37 | |||
| Kanamycini monosulfas CRL | voda R | pH 8,0 (0,05 mol/l) | ||||
| Kanamycini sulfas acidus | A – pH 7,9 | 35 až 39 | ||||
| Neomycini sulfas | Neomycini sulfas CRL | voda R | pH 8,0 (0,05 mol/l) | Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 | E – pH 7,9 | 30 až 37 |
| E – pH 7,9 | 30 až 37 | |||||
| Netilmicini sulfas | Netilmicini sulfas CRL | voda R | pH 8 ± 0,1 | Staphylococcus aureus CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 | A – pH 7,9 | 32 až 35 |
| Nystatinum | Nystatinum CRL | dimethyl-formamid R | pH 6,0 (0,05 mol/l) obsahující 5 % (V/V) dimethyl-formamidu R | Candida tropicalis CIP 1433-83 NCYC 1393 CCM8223 Saccharomyces cerevisiae NCYC 87 CIP 1432.83 ATCC 9763 CCM 8191 CNCTC 51/65 | F – pH 6,0 | 30 až 37 30 až 32 |
| Polymyxini B sulfas | Polymyxini B sulfas CRL | voda R | pH 6,0 (0,05 mol/l) | Bordetella bronchiseptica NCTC 8344 CEP 53.157 ATCC 4617 CCM 4416 CNCTC Brb 5/63 | B – pH 7,3 | 35 až 39 |
| Rifamycinum natricum | Rifamycinum natricum CRL | methanol R | pH 7,0 (0,05 mol/l) | Micrococcus flavus NCTC 8340 CIP 53.45 ATCC 9341 CCM 552 CNCTC Sar 5/58 | A – pH 6,6 | 35 až 39 |
| Spiramycinum | Spiramycinum CRL | methanol R | pH 8,0 (0,05 mol/l) | Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 | A – pH 7,9 | 30 až 32 |
| Streptomycini sulfas | Streptomycini sulfas CRL | voda R | pH 8,0 (0,05 mol/l) | Bacillus subtilis NCTC 8236 CIP 1.83 CCM 2217 CNCTC Bs 17/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 | A – pH 7,9 | 30 až 32 |
| A – pH 7,9 | 30 až 32 | |||||
| Tobramycinum | Tobramycinum CRL | voda R | pH 8,0 (0,05 mol/l) | Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 | A – pH 7,9 | 30 až 37 |
| Tylosinum a.u.v. | Tylosinum CRL | roztok methanolu R (2,5 % (V/V)) v tlumivém roztoku fosforečnano-vém o pH 7,0 (0,1 mol/l) | směs objemových dílů methanolu R a tlumivého roztoku fosforečnanové-ho o pH 8,0 (0,1 mol/l) (40 + 60) | Micrococcus flavus NCTC 8340 CIP 53.45 ATCC 9341 CCM 552 CNCTC Sar 5/58 | A – pH 8,0 | 32 až 35 |
| Tylosini tartras a.u.v. | ||||||
| Vancomycini hydrochloridum | Vancomycini hydrochloridum CRL | voda R | pH 8,0 | Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 | A – pH 8,0 | 37 až 39 |
B. Turbidimetrická metoda
Vhodná živná půda se naočkuje suspenzí vybraného mikroorganismu, který je citlivý na zkoušené antibiotikum tak, aby se v podmínkách zkoušky docílilo vhodně rozsáhlého potlačení růstu mikrobiální kultury. Použije se známé množství suspenze vybrané tak, aby byl asi po čtyřhodinové inkubaci dobře měřitelný zákal.
Naočkovaná půda se použije ihned po naočkování.
Pro přípravu roztoků referenční látky a roztoků zkoušeného antibiotika ve známých koncentracích, u nichž se předpokládá stejná účinnost, se použije rozpouštědlo a tlumivý roztok uvedený v tabulce 2.7.2-2. K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři dávky referenční látky a tři dávky zkoušeného antibiotika s předpokládanou stejnou účinností jako dávky referenční látky. Doporučuje se použít geometrickou řadu dávek. K dosažení linearity je někdy nutné vybrat z většího počtu tři následující dávky za použití odpovídajících dávek referenční látky a zkoušeného antibiotika.
Použijí se stejné zkumavky. Do každé z nich se převede stejný objem jednoho z roztoků a stejný objem naočkované živné půdy (např. 1 ml roztoku a 9 ml živné půdy).
Zároveň se připraví dvě kontrolní zkumavky bez antibiotika s naočkovanou živnou půdou a do jedné se ihned přidá 0,5 ml formaldehydu R. Tyto zkumavky slouží ke standardizaci optického přístroje použitého k měření růstu.
Zkumavky se umístí buď náhodně, nebo podle latinského čtverce, nebo náhodného bloku do vodní lázně nebo jiného vhodného přístroje, dovolujícího uvést rychle všechny zkumavky na uvedenou inkubační teplotu. Uchovávají se při této teplotě 3 h až 4 h a zabezpečí se stejná teplota a stejná doba inkubace.
Po inkubaci se zastaví ve všech zkumavkách růst mikroorganismů přidáním 0,5 ml formaldehydu R nebo zahřátím a změří se zákal s přesností na tři místa za použití vhodného optického přístroje. Alternativně lze použít jiný postup, který dovoluje měřit zákal každé zkumavky po přesně stejné době inkubace.
Vypočítá se účinnost za pomoci vhodných statistických metod.
Linearita vztahu dávka – odpověď, transformovaná nebo netransformovaná, je často získána pouze ve velmi omezeném intervalu; je to ten interval, který se má použít pro výpočet účinnosti a obsahuje nejméně tři následné dávky dovolující ověřit linearitu. Při běžných stanoveních, u nichž je prokázán lineární průběh systému, pokud byla na přiměřeném počtu třídávkových stanovení a pokud s tím souhlasí oprávněná autorita, může postačovat dvoudávkové stanovení. Ve všech sporných případech se však použije třídávková metoda.
V každé zkoušce se použije pro každou dávku tolik zkumavek, aby byla zajištěna požadovaná přesnost. Stanovení účinnosti se může opakovat a výsledky mohou být statisticky sloučeny, aby se dosáhlo požadované přesnosti stanovení a ověřilo se, že účinnost zkoušeného antibiotika není menší než požadované minimum.
Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda
| Antibiotikum | Referenční látka | Rozpouštědlo k přípravě základního roztoku | Tlumivý roztok (pH) | Mikroorganis-mus | Půda a konečné pH (± 0,1) | Inkubační teplota (°C) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Colistini sulfas Colistimethatum natricum | Colistini sulfas CRL Colistimethatum natricum CRL | voda R | pH 7,0 | Escherichia coli NCIB 8666 CIP 2.83 ATCC 9637 CCM 2024 | C – pH 7,0 | 35 až 37 |
| Dihydrostrep- tomycini sulfas | Dihydrostrepto-mycini sulfas CRL | voda R | pH 8,0 | Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415 CNCTC Klp 85/69 | C – pH 7,0 | 35 až 37 |
| Erythromycini estolas Erythromycini ethylsuccinas | Erythromycin CRL | methanol R viz články | pH 8,0 | Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415 | D – pH 7,0 | 35 až 37 |
| Erythromycini stearas | CNCTC Klp 85/69 Staphylococcus aureus NCTC 7447 CEP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 | C – pH 7,0 | 35 až 37 | |||
| Framycetini sulfas | Framycetini sulfas CRL | voda R | pH 8,0 | Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 | C – pH 7,0 | 35 až 37 |
| Gentamicini sulfas | Gentamicini sulfas CRL | voda R | pH 7,0 | Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 | C – pH 7,0 | 35 až 37 |
| Gramicidinum | Gramicidinum CRL | methanol R | pH 7,0 K zamezení ztrát způsobených adsorpcí v průběhu ředění může být nutná přísada detergentu, např. poly-sorbátu 80 R (0,1 mg/ml) | Streptococcus faecalis ATCC 10541 CCM 4533 CNCTC Str 6/58 Staphylococcus aureus ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 | C – pH 7,0 | 35 až 37 |
| Kanamycini monosulfas | Kanamycini monosulfas CRL | voda R | pH 8,0 | Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 | C – pH 7,0 | 35 až 37 |
| Kanamycini sulfas acidus | ||||||
| Neomycini sulfas | Neomycini sulfas CRL | voda R | pH 8,0 | Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 | C – pH 7,0 | 35 až 37 |
| Rifamycinum natricum | Rifamycinum natricum CRL | methanol R | pH 7,0 | Escherichia coli NICB 8879 CIP 54.127 ATCC 10536 CCM 3988 CNCTC Ec 326/71 | C – pH 7,0 | 35 až 37 |
| Spiramycinum | Spiramycinum CRL | methanol R | pH 7,0 | Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 | C – pH 7,0 | 35 až 37 |
| Streptomycini sulfas | Streptomycini sulfas CRL | voda R | pH 8,0 | Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415 CNCTC Klp 85/69 | C – pH 7,0 | 35 až 37 |
| Tobramycinum | Tobramycinum CRL | voda R | pH 7,0 | Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 | C – pH 7,0 | 35 až 37 |
| Tylosinum a.u.v. Tylosini tartras a.u.v. | Tylosinum CRL | roztok methanolu R (2,5 % (V/V)) v tlumivém roztoku fosforečnano-vém o pH 7,0 (0,1 mol/l) | směs objemových dílů methanolu R a tlumivého roztoku fosforečnanové-ho o pH 8,0 (0,1 mol/l) (40 + 60) | Staphyloco-ccusaureus NCTC 6571 CIP 53.154 ATCC 9144 CCM 2107 CNCTC Mau 76/69 | C – pH 7,0 | 37 |
| Vancomycini hydrochloridum | Vancomycini hydrochloridům CRL | voda R | pH 8,0 | Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 | C – pH 7,0 | 37 až 39 |
Následující část se uvádí pro informaci a jako návod, netvoří závaznou součást obecné metody.
1. fáze. Ředění porovnávacího přípravku faktoru VII a zkoušeného přípravku se smíchají s vhodným objemem předehřátého zkoumadla koagulačního faktoru nebo s kombinací jeho jednotlivých složek a směs se inkubuje ve zkumavkách z plastů nebo na mikrotitračních deskách při 37 °C. Koncentrace různých složek během tvorby faktoru Xa odpovídá specifikaci uvedené v popisu zkoumadla.
Aktivace faktoru X se nechá probíhat po vhodnou dobu. Obvykle se reakce ukončí předtím, než koncentrace faktoru Xa dosáhne své maximální hladiny, aby se docílila uspokojivá lineární závislost mezi dávkou a odpovědí. Doba aktivace se volí také tak, aby tvorba faktoru Xa byla lineárně závislá na čase. Vhodné doby aktivace obvykle kolísají mezi 2 min a 5 min, ale jsou přípustné odchylky, pokud je dosaženo přijatelné linearity ve vztahu mezi dávkou a odpovědí.
2. fáze. Aktivace se ukončí přidáním předehřátého zkoumadla s obsahem chromogenního substrátu. Provádí se hodnocení stupně štěpení substrátu, které musí být lineární s koncentrací vzniklého faktoru Xa, měřením změny absorbance při vhodné vlnové délce za použití spektrofotometru. Použije se bud’ průběžné sledování absorbance, které umožňuje vypočítat počáteční stupeň štěpení substrátu, nebo se po vhodné době ukončí hydrolýza snížením pH po přidání vhodné látky, jako je kyselina octová (500 g/l C2H4O2) nebo roztok citronanu (1mol/l) na pH 3. Doba hydrolýzy se nastaví tak, aby se dosáhlo lineární závislosti tvorby chromoforu na čase. Vhodné trvání hydrolýzy obvykle kolísá mezi 3 min a 15 min, ale jsou přípustné odchylky, pokud se dosáhne lepší lineární závislosti mezi dávkou a odpovědí.
Zkontroluje se validita stanovení a vypočítá se účinnost zkoušeného přípravku obvyklými statistickými metodami (např. 5.3. Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek).