5 Zkušební metoda

5.1 Zamezení kontaminaci
Riziko kontaminace vyžaduje přísné oddělení prostor podle zpracovávaného materiálu a používané technologie. Faktory, které je třeba uvážit, jsou pohyb personálu, pracovní oděv, pohyb materiálu, větrání a dekontaminační postupy.
Systém se má rozdělit do několika oddělení, jako jsou např.:
- prostor, kde se připravují základní zkoumadla, jako jsou např. primery, tlumivé roztoky, a kde se zachází výhradně s materiály neobsahujícími matrice,
- pre-PCR - prostor, kde se zachází se zkoumadly, vzorky a kontrolami,
- PCR-amplifikace - s amplifikovaným materiálem se zachází v uzavřeném systému,
- detekce post-PCR - jediný prostor, kde se zachází s amplifikovaným materiálem v otevřeném systému.

5.2 Příprava vzorku
Při přípravě vzorku se cílová sekvence extrahuje nebo uvolňuje z testovaného materiálu účinným a reprodukovatelným způsobem tak, aby bylo možné za zvolených reakčních podmínek provést amplifikaci.
Mohou se použít různé způsoby fyzikálně-chemické extrakce anebo obohacovací metody. Aditivá přítomná ve zkoušeném materiálu mohou interferovat s PCR. Pro kontrolu nepřítomnosti inhibitorů pocházejících ze zkoušeného materiálu se použijí postupy uvedené v odstavci 7.3.2.
V případě matric RNK je třeba zabránit působení ribonukleas.

5.3 Amplifíkace
Amplifikace cílové sekvence metodou PCR se provádí opakovanými cykly v optimalizovaných podmínkách (teplotní profil pro denaturaci dvouřetězcové DNK, přihybridizování primerů a jejich prodlužování, inkubační časy při zvolených teplotách, rychlost nabíhání zvolených teplot).
Tyto podmínky závisejí na různých parametrech, jako jsou:
- délka a složení bází primerů a cílových sekvencí;
- typ DNK polymerasy, složení tlumivého roztoku a reakční objemy použité pro amplifikaci;
- typ použitého termocykleru a koeficient teplotní vodivosti mezi přístrojem, reakční zkumavkou a reagující tekutinou.

5.4 Detekce
Amplikon vytvořený PCR se může identifikovat velikostí, sekvencí, chemickou modifikací nebo kombinací těchto parametrů. Charakterizace na základě velikosti se může dosáhnout gelovou elektroforézou (použije se vrstva agarosového nebo polyakrylamidového gelu nebo kapilární elektroforéza), nebo chromatografií na koloně (např. HPLC). Charakterizace na základě složení sekvencí se může provést specifickou hybridizací vzorků majících komplementární sekvence k cílové sekvenci nebo štěpením amplifikovaného materiálu restrikčním enzymem ve specifických místech pro cílovou sekvenci.
Charakteristika chemickou modifikací se může provést např. inkorporací fluoroforu do amplikonu a následnou detekcí fluorescence po excitaci.
Detekce amplikonů se může provést použitím značených vzorků umožňujících následnou radioizotopovou nebo imunoenzymatickou detekci.