A. Na polycytémických myších
Účinnost přípravku se stanoví v daných podmínkách hodnocením jeho působení na stimulaci příjmu 59Fe červených krvinek myší, které byly vystaveny sníženému atmosférickému tlaku a staly se polycytémickými.
Následující plán, užívající podtlakovou komoru, se ukázal být vhodným.
Polycytémie se vyvolá u samic myší stejného kmene a hmotnosti 16 g až 18 g. Samice myší se umístí do podtlakové komory o tlaku 0,6 atm. Po 3 dnech při 0,6 atm se tlak sníží na 0,4 atm až 0,5 atm, při kterém se zvířata nechají dalších 11 dní. (Částečné vakuum je denně přerušeno na maximálně 1 h okolo 11.00 h k zajištění úklidu klecí a potravy pro zvířata.) Po skončení tohoto specifického období se myši vrátí do normálních atmosférických podmínek. Namátkově se rozdělí do klecí po šesti zvířatech a označí se.
Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnan-albuminovém o pH 7,2 (1) na koncentraci 0,2 m.j./ml.
Zkoušený roztok (b). Smíchají se stejné objemové díly zkoušeného roztoku (a) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).
Zkoušený roztok (c). Smíchají se stejné objemové díly zkoušeného roztoku (b) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).
Porovnávací roztok (a). Erytropoetin BRP se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnan-albuminovém o pH 7,2 (1) na koncentraci 0,2 m.j./ml.
Porovnávací roztok (b). Smíchají se stejné objemové díly porovnávacího roztoku (a) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).
Porovnávací roztok (c) Smíchají se stejné objemové díly porovnávacího roztoku (b) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).
Radioaktivně značený roztok chloridu železitého (koncentrovaný) 59Fe. Použije se vyráběný 59Fe-chlorid železitý (o specifické aktivitě 100 MBq až 1000 MBq na miligram Fe).
Radioaktivně značený roztok chloridu železitého 59Fe. Radioaktivně značený koncentrovaný roztok chloridu železitého se zředí tlumivým roztokem citronanovým o pH 7,8 na aktivitu 3,7 x 104Bq/ml.
Koncentrace zkoušených roztoků a porovnávacích roztoků se mohou změnit podle odezvy použitých zvířat.
Tři dny po návratu zvířat do atmosférického tlaku se každému zvířeti podkožně vstříkne 0,2 ml jednoho roztoku. Ze šesti zvířat v každé kleci se každému zvířeti podá jeden ze šesti různých roztoků (3 zkoušené roztoky a 3 porovnávací roztoky) a pořadí injekcí by mělo být pro každou klec náhodně určeno. Nejméně se doporučuje n = osm (osm klecí).
Dva dny po injekci zkoušeného nebo porovnávacího roztoku se každému zvířeti intraperitonálně vstříkne 0,2 ml radioaktivně značeného roztoku chloridu železitého 59Fe. Pořadí injekcí je stejné jako při podání erytropoetinu a doba mezi podáním erytropoetinu a radioaktivně značeného roztoku chloridu železitého je pro každé zvíře stejná.
Za dalších 48 h se každé zvíře uspí injekcí vhodného anestetika, zaznamená se tělesná hmotnost a z rozvětvení aorty se odeberou vzorky krve (0,65 ml) do hematokritových kapilár. Po určení objemu sražených buněk se změří radioaktivita každého vzorku.
Pro každou myš se vypočítá odezva (% 59Fe v celkovém krevním oběhu) podle vztahu:
v němž značí:
As - radioaktivitu vzorku,
At - celkovou podanou aktivitu,
7,5 - celkový objem krve v procentech tělesné hmotnosti,
M - tělesnou hmotnost v gramech,
Vs - objem vzorku.
Účinnost se vypočítá obvyklými statistickými metodami vhodnými pro model rovnoběžnosti. Z výpočtu se vyloučí zvíře, jehož objem sražených buněk je méně než 54 % nebo tělesná hmotnost je více než 24 g.