B. Provede se izoelektrická fokusace.
Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se odsolí vhodným postupem, např. se zředí vodou R tak, aby se získala koncentrace 1 mg/ml. Vhodný objem zředěného roztoku se přenese do systému membránové filtrace pro odsolení bílkovin a vzorek se odsolí podle návodu výrobce. Odsolený vzorek se zředí na původní objem vodou R.
Porovnávací roztok (a). Erytropoetin BRP se rozpustí ve vodě R tak, aby získaná koncentrace byla 1 mg/ml. Provede se odsolení způsobem uvedeným pro zkoušený roztok.
Porovnávací roztok (b). Připraví se roztok pro kalibraci izoelektrického bodu o rozmezí pH 2,5 až 6,5 podle návodu výrobce.
Izoelektrická fokusace se provede na tenké vrstvě polyakrylamidového gelu o tloušťce vrstvy 0,5 mm obsahujícího amfolyty pokrývající pH v rozmezí 3 až 5, které se připraví následujícím způsobem. V lahvi s postranním tubusem se smíchá 9g močoviny R, 6,0 ml akrylamidu-bisakrylamidu (36,5:1) 30% RS, 1,05 ml amfolytu (o pH3 až 5), 0,45 ml amfolytu (o pH 3 až 10) a 13,5 ml vody R. Po odplynění se přidá 15 μI tetramethylethylendiaminu R a 0,3 ml čerstvě připraveného roztoku peroxodisíranu diamonného R (100 g/l).
Gel se nalije do vhodného gelového rámečku o velikosti 15 cm x 15 cm x 0,05 cm, vloží se vhodný hřeben na vytváření jamek pro vzorky a nechá se polymerovat.
Jako anodický roztok se použije anolyt pro izoelektrickou fokusaci o pH 3 až 5 R a jako katodický roztok se použije katolyt pro izoelektrickou fokusaci o pH 3 až 5 R. Prefokusace probíhá 1 h při konstantním výkonu 10 W s nastaveným nejvyšším napětím 2000 V a proudem 100 mA.
Na vrstvu gelu se nanese odděleně po 15 μl každého roztoku. Fokusace pokračuje za stejných podmínek dalších 30 min. Gel se vyjme z fokusační komory a umístí se do 200 ml roztoku obsahujícího kyselinu sulfosalicylovou R (35 g/l) a kyselinu trichloroctovou R (100 g/l) v odbarvovacím roztoku RS. Za mírného pohybu se odbarvuje 30 min při pokojové teplotě. Roztok se odstraní a přidá se opět 200 ml odbarvovacího roztoku RS. Za pohybu se odbarvuje 1 h a pak se gel vysuší a přidá se 200 ml barvicího roztoku modři kyselé RS, nechá se stát 30 min a pak se odbarvuje pasivní difúzí v odbarvovacím roztoku RS, dokud nejsou dobře zřetelné zóny na čirém pozadí.
Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozdělení zón na elektroforeogramú; porovnávacího roztoku (b) odpovídá požadavkům výrobce na kalibraci izoelektrického bodu a elektroforeogram porovnávacího roztoku (a) odpovídá referenčnímu elektroforeogramú Ph. Eur. izoforem erytropoetinu. Je-li to nutné, nastavování a trvání napětí se může měnit tak, aby došlo k optimálnímu rozdělení izoforem. Identifikují se zóny odpovídající izoformám 2 až 7.
Rozsah pH pásů na elektroforeogramu zkoušeného roztoku odpovídá elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a). Hlavní zóny odpovídají izoformám 4, 5 a 6. Slabší zóny odpovídající izoformám 2, 3 a 7 mohou být též přítomny. Jiné zóny mohou být přítomny ve stopovém množství.