B. Na normocytémických myších
Zkouška je založena na měření stimulace tvorby retikulocytů u normocytémických myší. Zkouška se může provést následujícím postupem:
Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se zředí tlumivým roztokem fosforečnan-albuminovým o pH 7,2 (1) na koncentraci 80 m.j./ml.
Zkoušený roztok (b). Smíchají se stejné objemové díly zkoušeného roztoku (a) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).
Zkoušený roztok (c). Smíchají se stejné objemové díly zkoušeného roztoku (b) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).
Porovnávací roztok (a). Erytropoetin BRP se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnan-albuminovém o pH 7,2 (1) na koncentraci 80 m.j./ml.
Porovnávací roztok (b). Smíchají se stejné objemové díly porovnávacího roztoku (a) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).
Porovnávací roztok (c). Smíchají se stejné objemové díly porovnávacího roztoku (b) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).
Přesné koncentrace zkoušených roztoků a porovnávacích roztoků se mohou změnit podle odezvy použitých zvířat.
Na začátku zkoušení se náhodně rozdělí myši vhodného věku a kmene (jsou vhodné 8 týdnů staré myši B6D2F1) do šesti klecí. Doporučuje se nejméně n = 8 (počet myší v kleci). Každému zvířeti se podkožně vstříkne 0,5 ml příslušného roztoku (1 roztok na klec) a zvíře se umístí v nové kleci. Myši se střídají tak, aby každá klec obsahovala šest myší, z nichž každé byl podán jiný roztok (tj. jeden ze tří zkoušených nebo tří porovnávacích roztoků).
Za 4 dny po injekci se odeberou vzorky krve zvířat a stanoví se počet retikulocytů vhodným způsobem. Může se použít následující metoda:
Objem krve, postup ředění a fluorescenční látka mohou být změněny k dosažení maximální a stabilní fluorescence.
Barvicí roztok (koncentrovaný). Použije se roztok thiazolové oranže vhodné pro stanovení retikulocytů. Připraví se dvojnásobná koncentrace, než je třeba pro analýzu.
Provádí se následující ředění. Plná krev se 500krát zředí tlumivým roztokem použitým k přípravě barvicího roztoku. Tento roztok se koncentrovaným barvicím roztokem zředí na dvojnásobný objem. Po 3 min až 10 min barvení se stanoví mikrofluorimetricky počet retikulocytů v průtokovém cytometru. Procento retikulocytů se určí použitím biparametrického histogramu: počet buněk a červená fluorescence F1 (620 nm).
Účinnost se vypočítá obvyklými statistickými metodami pro model rovnoběžnosti.