B. Provede se peptidové mapování.
Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušené látky v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS tak, aby obsahoval 2,0 mg/ml lidského insulinu a 500 μl tohoto roztoku se převede do čisté zkumavky. Přidají se 2,0 ml tlumivého roztoku HEPES o pH 7,5 a 400 μl roztoku proteasy kmene V8 zlatého stafylokoka R (1 mg/ml). Zkumavka se uzavře a inkubuje se 6 h při 25 °C. Reakce se zastaví přidáním 2,9 ml tlumivého roztoku síranového o pH 2,0.
Porovnávací roztok. Připraví se současně stejným způsobem jako zkoušený roztok za použití lidského insulinu CRL místo zkoušené látky.
Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,1 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatograjU R (3 μm),
- mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min:
- mobilní fáze A - smíchá se 100 ml acetonitrilu pro chromatografii R, 700 ml vody R a 200 ml tlumivého roztoku síranového o pH 2,0, směs se zfiltruje a odplyní,
- mobilní fáze B - smíchá se 400 ml acetonitrilu pro chromatografii R, 400 ml vody R a 200 ml tlumivého roztoku síranového o pH 2,0, směs se zfiltruje a odplyní,
Eluční podmínky jsou popsány v níže uvedené tabulce (pokud je třeba, upraví se gradient k dělení enzymaticky štěpeného insulinu):
| Čas (min) | Mobilní fáze A % (V/V) | Mobilní fáze B % (V/V) | Poznámka |
|---|---|---|---|
| 0 - 60 | 90 → 30 | 10 → 70 | lineární gradient |
| 60 - 65 | 30 → 0 | 70 → 100 | lineární gradient |
| 65 - 70 | 0 | 100 | izokraticky |
- spektrofotometrického detektoru, 214 nm.
Teplota kolony se udržuje na 40 °C.
Kolona se ustaluje při počátečních podmínkách nejméně 15 min. Provede se slepá zkouška za výše uvedeného gradientu.
Nastříkne se 50 μl zkoušeného roztoku a 50 μl porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogram obou roztoků kvalitativně odpovídá referenčnímu chromatogramu Ph. Eur. enzymaticky štěpeného lidského insulinu. Na chromatogramu porovnávacího roztoku se určí totožnost píku štěpením vzniklých fragmentů I, II a III. Faktor symetrie píků fragmentu II a III je nejvýše 1,5 a rozlišení mezi dvěma píky je nejméně 3,4.
Chromatografický profil zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku.
Poznámka: Retenční čas fragmentu I prasečího insulinu je stejný jako pro lidský insulin. Retenční čas fragmentu II je stejný pro všechny insuliny. Retenční čas fragmentu III hovězího insulinu je stejný jako pro prasečí insulin.