B. Provede se tryptické mapování peptidů za použití kapalinové chromatografie (2.2.29).
Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R tak, aby v 1 ml obsahoval 1 mg alteplasy. Asi 2,5 ml tohoto roztoku se dialyzuje přes membránu, jejíž práh propustnosti pro globuliny odpovídá relativní molekulové hmotnosti 10 000, nejméně 12 h roztokem obsahujícím močovinu R (480 g/l), tris(hydroxymethylamino)methan R (44 g/l) a edetan disodný R (1,5 g/l), jehož pH bylo upraveno na hodnotu 8,6. Změří se objem roztoku, převede se do čisté zkumavky a na mililitr roztoku se přidá 10 μl roztoku dithiothreitolu R (156 g/l). Nechá se stát 4 h, ochladí se v ledové lázni a na mililitr roztoku se přidá 25 μl čerstvě připraveného roztoku kyseliny jodoctové R (190 g/l). Nechá se stát na temném místě 30 min. Pak se na mililitr roztoku přidá 50 μl roztoku dithiothreitolu, aby se ukončila reakce. Opět se dialyzuje po dobu 24 h roztokem hydrogenuhličitanu amonného R (8 g/l). Smíchá se 1 díl trypsinu pro peptidové mapování R na 100 dílů bílkoviny a nechá se 6 h až 8 h stát. Přidá se opět trypsin a nechá se stát celkem 24 h.
Porovnávací roztok. Připraví se stejně jako zkoušený roztok, avšak místo zkoušeného přípravku se použije alteplasa CRL.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- kolony délky 0,1 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm až 10 μm),
- mobilní fáze A, kterou je zfiltrovaný a odplyněný roztok dihydrogenfosforečnanu sodného R (8 g/l), jehož hodnota pH byla upravena kyselinou fosforečnou R na 2,85,
- mobilní fáze B, kterou je acetonitril R 75% (V/V) v mobilní fázi A,
- spektrofotometrického detektoru, 210 nm.
Kolona se ustaluje mobilní fází A při průtokové rychlosti 1 ml/min. Po nástřiku vzorku se zvyšuje podíl mobilní fáze B o 0,44 % za minutu, dokud poměr mobilní fáze A ku mobilní fázi B nebude 60 : 40, a pak se zvyšuje o 1,33 % za minutu, dokud poměr mobilní fáze A ku mobilní fázi B nebude 20 : 80, a pak se nechá promývat touto směsí 10 min. Zaznamená se chromatogram porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi 6. píkem (peptidy 268 až 275) a 7. píkem (peptidy 1 až 7) je nejméně 1,5; b_0,5a a b_0,5b jsou menší než 0,4 min. Nastříkne se asi 100 μl zkoušeného roztoku a zaznamená se chromatogram. Totožnost píků se ověří srovnáním s píky porovnávacího roztoku. Neměly by být zjevné žádné další významné píky ani prodlevy. Významný pík je definován jednou plochou rovnající se nebo přesahující 5 % 19. píku (peptidy 278 až 296); nepřihlíží se k nevýznamným pikům. Chromatogram totožnosti citovaných píků je uveden na konci článku (obr. 1).