C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.
Zkoušený roztok (a). 25 mg se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 5 ml. Tento roztok se rovněž použije k přípravě zkoušeného roztoku (b). 2 ml tohoto roztoku se zředí dichlormethanem R na 10 ml.
Zkoušený roztok (b). 0,4 ml roztoku získaného při přípravě zkoušeného roztoku (a) se převede do skleněné zábrusové zkumavky 100 mm dlouhé a o průměru 20 mm se skleněnou nebo polytetrafluorethylenovou zátkou. Rozpouštědlo se pod proudem dusíku R odpaří za mírného zahřátí. Přidají se 2 ml kyseliny octové ledové R 15% (V/V) a 50 mg bismutičnanu sodného R. Zkumavka se uzavře a suspenze se mechanicky třepe 1 h za ochrany před světlem. Přidají se 2 ml kyseliny octové ledové R 15% (V/V), směs se zfiltruje do 50ml dělicí nálevky a filtr se promyje dvakrát 5 ml vody R. Čirý filtrát se třepe s 10 ml dichlormethanu R. Organická vrstva se promyje 5 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS, dvakrát 5 ml vody R a vysuší se nad síranem sodným bezvodým R.
Porovnávací roztok (a). 25 mg prednisolonu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 5 ml. Tento roztok se rovněž použije k přípravě porovnávacího roztoku (b). 2 ml tohoto roztoku se zředí dichlormethanem R na 10 ml.
Porovnávací roztok (b). 0,4 ml roztoku získaného při přípravě porovnávacího roztoku (a) se převede do skleněné zábrusové zkumavky 100 ml dlouhé a o průměru 20 mm se skleněnou nebo polytetrafluorethylenovou zátkou. Rozpouštědlo se pod proudem dusíku R odpaří za mírného zahřátí. Přidají se 2 ml kyseliny octové ledové R 15% (V/V) a 50 mg bismutičnanu sodného R. Zkumavka se uzavře a suspenze se mechanicky třepe 1 h za ochrany před světlem. Přidají se 2 ml kyseliny octové ledové R 15% (V/V), směs se zfiltruje do 50ml dělicí nálevky a filtr se promyje dvakrát 5 ml vody R. Čirý filtrát se třepe s10ml dichlormethanu R. Organická vrstva se promyje 5 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS, dvakrát 5 ml vody R a vysuší se nad síranem sodným bezvodým R.
Na vrstvu se odděleně nanese 5 μl zkoušeného roztoku (a), 5 μl porovnávacího roztoku (a), 10 μl zkoušeného roztoku (b) a 10 μl porovnávacího roztoku (b). Nanáší se po malých dávkách, aby se získaly malé skvrny. Vyvíjí se mobilní fází, kterou je směs objemových dílů vody R a methanolu R (1,2 + 8) smíchaná se směsí objemových dílů etheru R a dichlormethanu R (15 + 77) po dráze 15 cm. Provede se druhé vyvíjení ve směsi objemových dílů 1-butanolu R nasyceného vodou R, toluenu R a etheru R (5 + 15 + 80) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na každém z chromatogramů zkoušeného roztoku odpovídá polohou a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu příslušných porovnávacích roztoků. Pak se vrstva postříká kyselinou sírovou v lihu RS a 10 min se zahřívá při 120 °C nebo tak dlouho, až se objeví skvrny. Po vychladnutí se vrstva pozoruje v denním světle a v ultrafialovém světle při 365 nm. Hlavní skvrna na každém z chromatogramů zkoušeného roztoku polohou, zbarvením v denním světle, fluorescencí v ultrafialovém světle při 365 nm a velikostí odpovídá hlavní skvrně na chromatogramu příslušného porovnávacího roztoku. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) a porovnávacího roztoku (b) má hodnotu R_F zřetelně vyšší než hlavní skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) a porovnávacího roztoku (a).