C. Provede se elektroforéza na polyakrylamidovém gelu (2.2.31) a imunoblot (2.7.1).
Zkouška se provede na polyakrylamidovém gelu o síle 0,75 mm a ploše asi 16 cm². Rámeček na gel se složí podle návodu výrobce.
Separační gel. V lahvi s postranním tubusem se smíchá 8,0 ml akrylamidu-bisakrylamidu (29 : 1) 30% RS, 5 ml tlumivého roztoku trometamolového o pH 8,8 (1,5 mol/l), 6,6 ml vody R a 0,2 ml roztoku laurylsíranu sodného R (100 g/l). Po odplynění se přidá 8 μl tetramethylethylendiaminu R a 0,2 ml čerstvě připraveného roztoku peroxodisíranu diamonného R (100 g/l).
Separační gel se nanese do sestaveného zařízení a nechá se dostatečný prostor pro zaostřovací gel. Gelový roztok se překryje 2-propanolem R a nechá se zpolymerovat.
Zaostřovací gel V lahvi s postranním tubusem se smíchá 1,0 ml akrylamidu-bisakrylamidu (29 : 1) 30% RS, 0,75 ml tlumivého roztoku trometamolového o pH 6,8 (1 mol/l), 4,1 ml vody R a 0,06 ml roztoku laurylsíranu sodného R (100 g/l). Po odplynění se přidá 6 pl tetramethyle- thylendiaminu R a 0,06 ml čerstvě připraveného roztoku peroxodisíranu diamonného R (100 g/l).
2-propanol R se odstraní ze zpolymerovaného separačního gelu a na separační gel se naleje roztok zaostřovacího gelu. Dobře se uzavře a nechá se polymerovat.
Roztok pro vzorky. Smíchají se stejné objemové díly SDS-PAGE koncentrovaného roztoku pro vzorky RS a vody R.
Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se zředí ve vodě R tak, aby výsledná koncentrace byla 1,0 mg/ml. K jednomu objemovému dílu tohoto roztoku se přidá stejný objemový díl SDS-PAGE koncentrovaného roztoku pro vzorky RS.
Zkoušený roztok (b). K 0,1 ml zkoušeného roztoku (a) se přidá 0,9 ml roztoku pro vzorky. Porovnávací roztok (a). Obsah jedné ampule erytropoetinu BRP se rozpustí v 0,25 ml vody R. Přidá se stejný objemový díl SDS-PAGE koncentrovaného roztoku pro vzorky RS.
Porovnávací roztok (b). K 0,1 ml porovnávacího roztoku (a) se přidá 0,9 ml roztoku pro vzorky.
Porovnávací roztok (c). Použije se roztok standardů molekulových hmotností vhodných pro kalibraci SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy v rozmezí 10 kD do 70 kD.
Porovnávací roztok (d). Použije se roztok předbarvených standardů molekulových hmotností vhodných pro kalibraci SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy v rozmezí 10 kD až 70 kD a vhodných pro přenos elektronů na vhodnou membránu.
Připravený gel se vloží do přístroje a přidá se přiměřený objem SDS-PAGE elektrodového roztoku RS. Zkoušené a porovnávací roztoky uchovávané v dobře uzavřených zkumavkách se na 2 min vloží do vroucí vodní lázně. Po 20 jíl každého roztoku se nanese do jamek zaostřovacího gelu v následujícím pořadí: porovnávací roztok (c), porovnávací roztok (a), zkoušený roztok (a), prázdná jamka, porovnávací roztok (b), zkoušený roztok (b), porovnávací roztok (d).
Elektroforéza probíhá za podmínek doporučených výrobcem zařízení. Na konci separace se vyjme rámeček a gel se rozdělí na dvě části. První část obsahuje porovnávací roztok (c), porovnávací roztok (a) a zkoušený roztok (a); druhá část obsahuje porovnávací roztok (b), zkoušený roztok (b) a porovnávací roztok (d).
První část gelu se umístí do barvicího roztoku modři kyselé RS a pohybuje se jim 1 h. Pak se gel přenese do odbarvovacího roztoku RS a nechá se v něm odbarvovat za pohybu, dokud nejsou zřetelně viditelné zóny bílkoviny na čirém pozadí. Zkoušku lze hodnotit, jestliže bílkoviny standardů molekulových hmotností jsou rozděleny do zřetelně oddělených zón, s přibližně
lineární závislostí vzdálenosti migrace na log₁₀ molekulové hmotnosti. Elektroforeogram zkoušeného roztoku (a) ukazuje jedinou difuzní zónu odpovídající polohou a intenzitou jediné zóně na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a).
Druhá část gelu se vloží na membránu, která slouží k imobilizaci bílkovin, použije se komerčně dostupné zařízení pro elektroblot a postupuje se podle návodu výrobce. Po elektroblotu se membrána inkubuje 1 h až 2 h v neutrálním izotonickém tlumivém roztoku obsahujícím vhodné srážecí činidlo, např. sušené mléko (50 g/l) nebo fetální telecí sérum 10% (V/V), a poté následuje inkubace 1 h až 14 h ve stejném srážecím roztoku s vhodně naředěnou polyklonální nebo monoklonální anti-erytropoetinovou protilátkou. Erytropoetin vázaný na protilátku se deteguje za použití vhodné protilátky značené enzymem nebo radioaktivně vázaným zkoumadlem (např. alkalická fosfatasa konjugovaná s druhou protilátkou). Přesné detaily o srážecích činidlech, koncentracích a inkubačních dobách by se měly optimalizovat za použití základních údajů popsaných v Imunochemických metodách (2.7.1).
Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (d) rozděleny zóny standardů molekulových hmotností do přesných zón, s přibližně lineární závislostí vzdálenosti migrace na log₁₀ molekulové hmotnosti.
Elektroforeogram zkoušeného roztoku (b) tvoří jedinou difuzní zónu odpovídající polohou a intenzitou zóně na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (b).