C. Provede se peptidové mapování.
Zkoušený roztok. Zkoušený roztok se zředí tlumivým roztokem trometamolovým o pH 7,5 (0,05 mol/l) tak, aby obsahoval 2,0 mg somatropinu v mililitru. Asi 1,0 ml takto připraveného roztoku se převede do zkumavky z vhodného materiálu, např. polypropylenu, a přidá se 30 μl čerstvě připraveného roztoku trypsinu pro peptidové mapování R (1 mg/ml) v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (0,05 mol/l). Zkumavka se uzavře a vloží se na 4 h do vodní lázně 37 °C teplé. Potom se zkumavka vyjme z vodní lázně a ihned se probíhající reakce přeruší, např. zmrazením. Je-li okamžitě použit automatický dávkovač, udržuje se teplota na 2 °C až 8 °C.
Poznámka. Stejný vzájemný poměr (mikrogram trypsinu na miligram somatropinu) se použije, jestliže nelze získat koncentrace 2 mg somatropinu v mililitru.
Porovnávací roztok. Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (0,05 mol/l) a zpracuje se současně stejným způsobem jako zkoušený roztok.
Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktylsilanizovaným pro chromatografii R(5 μm až 10 μm),
- mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min:
- mobilní fáze A - 1 ml kyseliny trifluoroctové R se zředí vodou R na 1000 ml,
- mobilní fáze B - ke 100 ml vody R se přidá 1 ml kyseliny trifluoroctové R a zředí se acetonitrilem pro chromatografii R na 1000 ml,
- následujícího gradientu (je-li třeba, gradient nebo teplota kolony se nastaví tak, aby se dosáhlo požadovaného rozdělení produktů enzymatického štěpení):
| Čas (min) | Mobilní fáze A % (V/V) | Mobilní fáze B % (V/V) |
|---|---|---|
| 0 - 20 | 100 → 80 | 0 → 20 |
| 20 - 40 | 80 → 75 | 20 → 25 |
| 40 - 65 | 75 → 50 | 25 → 50 |
| 65 - 70 | 50 → 20 | 50 → 80 |
| 70- 71 | 20 → 100 | 80 → 0 |
| 71 - 85 | 100 | 0 |
- spektrofotometrického detektoru, 214 nm.
Teplota kolony se udržuje na 30 °C.
Kolona se nejméně 15 min ustaluje mobilní fází A. Provede se slepá zkouška za použití výše uvedeného gradientu.
Nastříkne se 100 μl zkoušeného roztoku a 100 jal porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogramy obou roztoků kvalitativně odpovídají referenčnímu chromatogramu Ph. Eur. enzymaticky štěpeného somatropinu. Chromatografický profil zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku.