- údaje o biologických účincích aktivní látky a jejích metabolitů.
- rizik z nežádoucích účinků na životní prostředí z doplňkové látky jako takové nebo produktů odvozených z doplňkové látky přímo, nebo vyloučených zvířaty.
Je třeba vzít v úvahu známé inkompatibility, nebo interakce mezi doplňkovou látkou a veterinárními léčivy, anebo složkami diety určené pro daný druh.
Tyto zkoušky se budou obvykle požadovat jako celek pro každou doplňkovou látku, pokud není uvedena zvláštní výjimka nebo změna.
Pro návrh na rozšíření povoleného užití pro druh, který je z fyziologického a metabolického hlediska blízký druhu, pro který již bylo užití doplňkové látky povoleno, se obvykle souhlasí s méně obsáhlou žádostí. Takový soubor redukovaných údajů musí ukázat bezpečnost pro nový druh a absenci výrazných rozdílů v základním metabolismu a reziduí v poživatelných tkáních. Navržená MLR a ochranná lhůta pro daný druh musí být odůvodněny.
Pro posouzení rizik pro spotřebitele a následné určení MLR a ochranné lhůty, je třeba dodat tyto informace:
- chemickou strukturu aktivní látky,
- metabolismus u navrhovaných cílových druhů,
- skladbu reziduí u těchto cílových druhů,
- zkoušku o odbourávání reziduí z tkání,
Dále se požaduje znalost složení a fyzikálně chemické a biologické vlastnosti hlavních vyloučených produktů pocházejících z doplňkové látky pro stanovení rozsahu zkoušek nezbytných k posouzení rizik nežádoucích účinků na životní prostředí nebo jejich přetrvávání v životním prostředí (viz odstavec 4.5.).
Znalost biologické využitelnosti reziduí (vázaných a volných) může být také užitečná, zejména pokud dochází k tvorbě mnoha metabolitů a žádný marker reziduí není doložen (viz 4.1.3.3.)
4. Zkoušky týkající se bezpečnosti užití doplňkové látky
Zkoušky uvedené v tomto oddílu jsou určeny k vyhodnocení
- bezpečnosti užití doplňkové látky pro cílové druhy,
- jakéhokoliv rizika souvisejícího se selekcí, nebo přenosem rezistence vůči antibiotikům a se zvyšující se persistencí a množením enteropatogenů,
- rizik pro spotřebitele, která by mohla být způsobena konzumací potravin obsahujících rezidua doplňkové látky nebo jejich metabolitů,
- rizik při vdechnutí, jiného kontaktu sliznic, očí nebo kůže u osob zabývajících se manipulací s doplňkovou látkou v původním stavu nebo zapracované do premixů nebo krmiv,

4.1. Zkoušky na cílových druzích zvířat

Tyto zkoušky musí být prováděny s aktivní látkou za použití mezinárodně uznávaných standardních pokusných metod, jak jsou popsány v pokynech OECD pro metodologické ukazatele a v souladu se zásadami správné laboratorní praxe. Mohou být nezbytné i doplňující zkoušky o zvláštních metabolitech, produkovaných u cílových druhů, pokud se tyto nevytvořily v testu laboratorních druhů ve významném rozsahu. Stejně tak, pokud jde o údaje u člověka, se kterými se musí počítat, je třeba rozhodnout, které doplňující zkoušky se provedou.
4.2. Zkoušky na laboratorních zvířatech

4.3. Vyhodnocení bezpečnosti pro člověka

4.4. Posouzení bezpečnosti pro pracovníky
Získaná zkušenost ve výrobní jednotce často představuje důležitý zdroj informací pro posouzení rizik pro pracovníky, která vyplývají z toho, že pracovníci jsou vystaveni účinkům doplňkové látky ze vzduchu a dotykem. Látky, jimž je zapotřebí věnovat mimořádnou pozornost, jsou doplňkové látky, krmiva zpracovaná s doplňkovými látkami, nebo výkaly zvířat ve formě suchého prachu nebo ze kterých může suchý prach vzniknout, a doplňkové látky pro krmiva, které mohou mít alergický potenciál.
Pracovníci mohou být vystaveni působení doplňkové látky hlavně při vdechnutí nebo dotyku při výrobě, manipulaci nebo užití doplňkové látky, například pracovníci v zemědělství jsou potenciálně vystavení účinkům při manipulaci nebo míchání doplňkové látky. Musí být dodány doplňující informace o způsobu zacházení s látkami. Tyto informace musí obsahovat posouzení možných rizik pro pracovníky.

Zohlednění dopadu doplňkových látek v krmivech na životní prostředí je důležité z toho důvodu, že podávání těchto doplňkových látek obvykle trvá dlouhou dobu (nebo celý život), mohou jím být dotčeny velké skupiny zvířat, mnohé doplňkové látky se málo vstřebávají a proto jsou z velké míry vylučovány v nezměněném stavu. V určitých případech však může být nutnost posouzení dopadu na životní prostředí omezena. Není namístě stanovovat přísná pravidla v těchto obecných pokynech. Aby se usnadnilo určování dopadu doplňkových látek na životní prostředí, musí se přijmout postupné kroky (viz „strom rozhodování“), kdy je možné v první fázi jasně identifikovat doplňkové látky, které nevyžadují doplňující testy. U ostatních doplňkových látek se požaduje druhá fáze zkoušek (fáze II A), aby se získaly doplňující informace, na jejichž základě může být rozhodnuto, že bude nutné provést další zkoušky (fáze II B).
4.5. Posouzení rizika pro životní prostředí

4.1.1. Testy tolerance na cílových druzích/ kategoriích zvířat
Účelem je určit limit bezpečnosti (tj. hranici mezi maximální navrhovanou dávkou v krmivech a minimální dávkou způsobující nežádoucí účinky). Limit bezpečnosti jednoho faktoru nejméně z deseti se však považuje za dostatečný, aby se již nežádaly doplňující testy. Takový test tolerance musí být proveden u cílových druhů /kategorií zvířat, přednostně po celé produkční období, i když normálně je přijatelný test trvající jeden měsíc. To vyžaduje minimálně posouzení klinických příznaků a jiných parametrů pro stanovení účinků na zdraví cílových zvířat. Musí být zařazena negativní kontrolní skupina (bez antibiotik, růstových stimulátorů nebo jiných léčebných látek). Mohou být také požadovány dodatečné parametry podle toxikologického profilu. Jakýkoliv nežádoucí účinek odhalený během pokusů na stanovení účinnosti se musí uvést také v tomto oddílu.
Pokud je produkt určen k použití na zvířatech, která by mohla být použita k chovu, musí být studie prováděny takovým způsobem, aby se zjistilo případné zhoršení rozmnožovací funkce samce nebo samice nebo škodlivé účinky na potomstvo, způsobené podáváním zkoušené doplňkové látky.

4.1.2. Mikrobiologická bezpečnost doplňkové látky

4.1.3. Zkoušky metabolismu a reziduí

Akutní orální toxicita musí být provedena nejméně na dvou druzích savců. Jeden laboratorní druh může být v případě potřeby nahrazen cílovým druhem. Nebude nutné označovat přesně LD50; přibližné určení minimální smrtelné dávky obvykle stačí. Aby se snížil počet testovaných zvířat a jejich utrpení, nesmí maximální dávkování překročit 2 000 mg/kg živé hmotnosti a doporučuje se použití náhradních metod (limitní test, metoda fixní dávky, metoda třídy akutní toxicity).
4.2.1. Akutní toxicita
Nebezpečí pro pracovníky musí být posuzováno v sérii zkoušek, v nichž se produkt (aktivní látka a nosič ve formě, v níž bude uvedena do oběhu) použije. Zkoušky dráždivosti pokožky se musí také provést a pokud jsou jejich výsledky pozitivní, je třeba posoudit dráždivost sliznic (například očí). Také se musí posoudit alergické účinky - kožní senzibilizace. Zkoušky akutní toxicity při vdechnutí se musí provádět, jestliže produkt může tvořit prach nebo lze vdechovat jeho výpary.

4.2.2. Zkoušky genotoxicity, včetně mutagenity
Za účelem identifikace aktivních látek a případně jejich metabolitů a produktů degradace, které mají mutagenní a genotoxické vlastnosti, musí být provedena výběrová kombinace nejméně tří různých testů na genotoxicitu. Testovaný soubor musí obvykle obsahovat testy v prokaryotickém i eukaryotickém systému, včetně systémů testů in vitro a in vivo na savcích. V případě potřeby se testy musí provádět bez i s metabolickou aktivací u savců.
Je třeba uvést důvody, které vedly k výběru testů vzhledem k jejich spolehlivosti pro posouzení genotoxických účinků na různá genetická zakončení na úrovni genu, chromozomu a genomu. Mohou se uvádět doplňující testy podle získaných výsledků a na základě celého toxikologického profilu látky a užití, k němuž je určena. Pokusy se musí provádět v souladu se schválenými a v současnosti validovanými postupy. Pokud je pokus zaměřen na kostní dřeň, je případě negativního výsledku nutný důkaz o tom, že buňky byly vystaveny působení testované látky.

Doba testů musí být minimálně 90 dní. U doplňkových látek určených k použití u živočišných druhů, z nichž se vyrábějí potraviny, musí se zkoušky provádět na dvou živočišných druzích, z čehož jeden nesmí patřit k řádu hlodavců, ale může být cílovým druhem. U doplňkových látek určených pro použití u zvířat, která nejsou určena k lidské spotřebě, stačí zkoušky na cílovém druhu: aktivní látka musí být podávána orálně minimálně ve třech úrovních jako doplněk podávání kontrolní skupině, aby se získala odpověď na dávku.
Maximální dávka musí za normálních okolností odhalit přítomnost škodlivých účinků. Nejnižší úroveň dávkování nemusí vykázat žádnou známku toxicity.
4.2.3. Zkoušky subchronické orální toxicity (90 dní)

- dávají stále negativní výsledky ve vhodné sérii testů na genotoxicitu,
Zkoušky karcerogenity nemusí být nezbytné, pokud aktivní látka a její metabolity:
4.2.4. Zkoušky chronické orální toxicity (včetně zkoušek karcinogenity).
- nejsou strukturálně propojeny se známými kancerogeny a
- nevyvolávají žádný účinek ukazující na případnou (pre)neoplazii při zkouškách chronické toxicity.

4.2.5. Zkoušky reprodukční toxicity včetně teratogenity

Musí být provedeny zkoušky absorpce, ukládání (rozložení) v tělních tekutinách a tkáních a ve vylučovacích cestách. Zkouška metabolismu zahrnující metabolickou bilanci a identifikaci hlavních metabolitů v moči a výkalech se musí provést na zvířatech obou pohlaví a stejných druhů, jaké byly použity v toxikologických zkouškách. Jedna dávka značené molekuly (bod 4.1.3) se musí podat v ustáleném stavu rovnováhy, jehož bylo dosaženo s neznačenou sloučeninou v dávce podobné nejvyšší úrovni navržené pro použití u cílového druhu.
4.2.6. Zkoušky metabolismu a ukládání

4.2.7. Biologická využitelnost reziduí
Při posuzování rizika pro spotřebitele, spojeného s určitými rezidui obsaženými v živočišných produktech, zejména vázanými rezidui, je třeba brát v úvahu dodatečný faktor bezpečnosti založený na určení jejich biologické využitelnosti za použití vhodných laboratorních zvířat a uznaných metod.

4.2.8. Jiné specifické toxikologické a farmakologické zkoušky
Musí se provést další zkoušky poskytující doplňující informace použitelné pro posouzení bezpečnosti aktivní látky a jejích reziduí, pokud pro to existuje jakýkoliv závažný důvod.

KBPÚ, která se má použít pro výpočet přijatelné denní dávky (ADI) však musí být podle okolností vybrána na základě toxikologických nebo farmakologických účinků. U některých doplňkových látek, například antibakteriálních látek, může být vhodnější určovat ADI na základě účinků na lidskou střevní mikroflóru. Neexistují-li mezinárodní přijaté a validované metody pro popis střevní flóry, pak mohou být vhodnější účinky na vybrané a citlivé bakteriální kmeny lidského střeva.
Všechny výše uvedené výsledky a veškeré důležité publikované údaje (včetně jakékoliv vhodné informace o účincích aktivní látky na člověka) a případně informace o úzce souvisejících chemických strukturách se musí brát v úvahu pro určování koncentrace bez pozorovaného účinku (NOEL-KBPÚ), vyjádřené v mg/kg tělesné hmotnosti na den. Musí být vybrána nejnižší KBPÚ.
4.2.9. Určení koncentrace bez pozorovaného účinku (NOEL-KBPÚ)

Faktor bezpečnosti užitý pro stanovení ADI jednotlivé doplňkové látky musí být vybrán s ohledem na následující:
4.3.1. Návrh přijatelné denní dávky (ADI) pro doplňkovou látku
V případě potřeby by se měla navrhnout přijatelná denní dávka ADI.
ADI (vyjádřená v mg doplňkové látky nebo materiálu vztahujícímu se k doplňkové látce na osobu a den) se odvodí tak, že se vydělí koncentrace bez pozorovatelného účinku (KBPÚ mg/kg tělesné hmotnosti) vhodným faktorem bezpečnosti a vynásobí průměrnou hmotností lidského těla, tj. 60 kg. Tato KBPÚ, vyjádřená v mg na kg tělesné hmotnosti na den může být vybrána s použitím toxikologických nebo farmakologických výsledků. V některých případech může být ADI, stanovená na doplňkových látkách s mikrobiologickými vlastnostmi, vhodnější. Výběr bude záležet na tom, která vlastnost je nejdůležitější z hlediska zdravotního rizika pro spotřebitele.
- na povahu biologického účinku užitého pro určení KBPÚ,
- na důležitost tohoto účinku pro člověka a reverzibilitu účinku,
- na rozsah a kvalitu údajů pro určení KBPÚ,
- na jakoukoliv informaci o účinku nebo účincích složek reziduí.
Obvykle se použije pro výpočet ADI faktor bezpečnosti nejméně 100 (to znamená faktor 10 pro umožnění potenciální mezidruhové variace a další faktor 10 pro umožnění možných rozdílů v reakcí u různých lidí. Pokud jsou pro aktivní látku k dispozici údaje pro lidi, může se přijmout nižší faktor bezpečnosti.

Pro stanovení MLR (vyjádřených v g/kg reziduálního markeru na kg použivatelné syrové tkáně nebo produktu) na základě ADI, je třeba použít následující hodnoty denní spotřeby lidské stravy:
- nulová biologická využitelnost reziduí a nulový škodlivý účinek na lidská střeva, včetně jejich mikroflóry,
- ADI „nespecifikována“ z důvodu nízké toxicity při pokusech na zvířatech,

	Savci	Ptáci	Ryby
Svaly	300 g	300 g	300 g*
Játra	100 g	100 g
Ledviny	50 g	10g
Tuk	50 g**	90 g***
+ mléko	1500 g
+ vejce		100 g
* Svaly a kůže v přirozených poměrech
** U prasat 50 g tuku a kůže v přirozených poměrech
*** Tuk a kůže v přirozených poměrech

Pro výpočet MLR se předpokládá, že příjem poživatelných tkání, mléka a vajec představuje jediný zdroj, jemuž je člověk potenciálně vystaven. Pokud tomu tak není, musí být vzaty v úvahu jiné zdroje.
- úplné odbourání na živiny nebo na neškodné látky u cílových druhů,
4.3.2. Návrh maximálních limitů reziduí (MLR) pro doplňkovou látku
Jestliže by nějaká látka vytvářela reziduum v tkáních a produktech, musí být MLR navrženy takovým způsobem, aby celkové množství rezidua významného z toxikologického (nebo mikrobiologického) hlediska, přijímaného⁵) každý den, bylo nižší než ADI (viz tabulka nahoře).
- případ, kdy je látka zároveň povolena jako potravinářské aditivum; MLR není obvykle nutný, je-li reziduální marker v zásadě výchozí (mateční) látkou a nepředstavuje-li pouze nevýznamnou frakci ADI potravinářského aditiva.
Jednotlivé MLR v různých tkáních musí brát v úvahu kinetiku vylučování reziduí v tkáních živočišného druhu zamýšleného pro užití. Je požadována analytická metoda vykazující limit kvantifikace nižší než MLR (viz oddíl II bod 2.5.3.).
Řada takových substancí se používala jako doplňkové látky v krmivech i pro jiné aplikace. V těchto případech by měly být vypočítané MLR totožné. Mohou zde být také příklady, kdy se na základě přísných vědeckých úvah vypočítávají různé MLR pro každé užití jestliže způsob, množství, četnost dávkování a doba trvání podávání jsou dostatečně odlišné od těch, které jsou obvykle používány pro doplňkovou látku v krmivech, a že jsou zde důkazy ukazující, že kinetika, nebo metabolismus může vyústit v odlišné profily reziduí. Pro tyto případy se předem stanovilo, že se použijí nejpřísnější MLR.
MLR smí být stanoven až po zvážení a zahrnutí všech dalších možných zdrojů rezduí, kterým je spotřebitel vystaven.
- případ, kdy je užití zcela omezeno na krmiva pro domácí zvířata,
Ke stanovení MLR musí být definována chemická povaha materiálu příbuzného léčivé substanci, který je určen k užití pro upřesnění hladin reziduí ve tkáních. Tato látka se nazývá reziduální marker. Tato složka rezidua nemusí být nutně důležitým reziduem z toxikologického hlediska, avšak musí být vybrána jakožto vhodný ukazatel představující všechna významná rezidua. Poměr reziduálního markeru a veškerých radioaktivních reziduí ve vztahu k ADI (tj.poměr reziduálního markeru k veškerým radioaktivním rezidua, reziduální marker k veškerým biologicky aktivním reziduím) musí být stanoveny ve všech časových bodech během zkoušek o odbourávání. Zejména je nutné tento poměr znát u časového bodu, který byl vybrán pro určení MLR. Analytická metoda vhodná pro tento reziduální marker musí být také k disposici, aby bylo zaručeno dodržování MLR.
U některých doplňkových látek mohou být rezidua přítomna pod hodnotami MLR v mléce, vejcích nebo mase, mohou však narušit kvalitu potraviny při jejím zvláštním zpracování, například užití mléka pro výrobu sýra. U těchto doplňkových látek se může jako doplněk stanovení hodnot MLR uvést, že se počítá s „maximálním reziduem slučitelným se zpracováním (potravin)“.
MLR nebude požadován za určitých okolností, jakými jsou:

Ochranná lhůta bude stanovena na základě MLR. Ochranná lhůta zahrnuje dobu následující po ukončení podávání navrhované formy doplňkové látky, která je nezbytná k tomu, aby hladiny rezidua klesly pod MLR (výše spolehlivosti 95%).
4.3.3. Návrh ochranné lhůty pro doplňkovou látku
Pro stanovení ochranné lhůty je možné označit dílčí poživatelnou tkáň, často nazývanou jako cílová tkáň, která zastupuje všechny ostatní.

4.4.1. Posouzení toxikologického rizika pro bezpečnost pracovníků

4.4.2. Posouzení exposice
Musí být předloženy informace o tom, zda používání doplňkové látky je schopno vyvolat vznik exposice všemi cestami – vdechnutím, dotykem nebo požitím. Tyto informace musí zahrnovat kvantitativní vyhodnocení, které by se mělo týkat typické koncentrace ve vzduchu, kontaminace kůže nebo požití. Pokud kvantitativní údaje nejsou k dispozici, musí být dodán dostatek informací, který umožní adekvátní posouzení exposice.

Při použití informací z hodnocení výsledků toxikologie a exposice musí být vypracován závěr o rizicích pro zdraví uživatelů (systémová toxicita, toxicita, dráždivost nebo citlivost), pokud jsou uplatňována opatření ke kontrole expozice přiměřená těmto podmínkám. Pokud je riziko nepřijatelné, musí být přijata bezpečnostní opatření ke kontrole exposice nebo jejího vyloučení. Přednostními řešeními je přepracování nebo modifikace výrobních postupů užití, nebo disposic doplňkové látky. Používání osobních ochranných prostředků musí být posledním krokem k ochraně před jakýmkoliv přetrvávajícím rizikem poté, kdy už byla zavedena kontrolní opatření.
4.4.3. Opatření ke kontrole exposice

Fáze II posuzování dopadu se bude obvykle požadovat, pokud žadatel není schopen dokázat, že navrhovaná doplňková látka spadá do některé z těchto vyjmutých skupin, nebo pokud je doplňková látka přímo uvolněna do prostředí (například v akvakultuře).
Nejhorší PKŽP pro vodu může být stanovena buďto přímým vhozením sypkého krmiva nebo výkalů obsahujících doplňkovou látku a její metabolity do vodních nádrží nebo z průsaku látek obsažených ve výkalech nebo v půdě do spodní vody. Je-li PKŽP z hlediska kontaminace vodních nádrží nebo spodní vody spolehlivě určena jako nižší než 0,1 μg na litr, pak posuzování dopadu doplňkové látky na vodní prostředí podle fáze II. A není nutné.
FÁZE II

K fázi II se nemusí přistupovat, pokud se splní jedno ze dvou následujících kriterií:
Účelem posuzování ve fázi I. je určit, zda doplňková látka nebo její metabolity může nebo nemůže mít významný dopad na životní prostředí, a to na základě údajů stanovených již pro jiné účely.
RIZIKO DOPLŇKOVÝCH LÁTEK V KRMIVECH PRO ŽIVOTNÍ PROSTŘEDÍ
4.5.1. Posuzování – fáze I.
Nejhorší PKŽP pro půdu by měla být stanovena z hnoje, který byl zakládán v době maximální exkrece hlavních složek rezidua (doplňkové látky, nebo jejích hlavních metabolitů), a byl rozmetán po půdě. PKŽP musí být vyhodnocena pro každou hlavní složku rezidua v hnoji a pro každý příslušný oddíl. U pozemního oddílu hnoje se nepožaduje žádné další posuzování, pokud PKŽP nepřekračuje 100 µg/kg pro sumu hlavních složek rezidua v hnoji, nebo pokud jsou tyto hlavní složky v hnoji rychle rozloženy (čas rozpadu DT 50<30 dní) (v případě, že jsou tyto údaje k disposici) na přírodní složky nebo na koncentrace nižší než 100µg/kg, nebo jestliže je PKŽP v půdě (v hloubce 5 cm) nižší než µ/kg.
Strom rozhodování FÁZE I.

Fáze II obsahuje dvě části: fázi II A a fázi II B.
4.5.2. Posuzování - fáze II
Musí být posouzena možnost bioakumulace doplňkové látky, nebo jejích hlavních metabolitů a její vliv na předpokládanou míru bezpečnosti. Bioakumulace se nepovažuje za potenciálně významnou, pokud je například K_ow (rozdělovací koeficient) < 3. Příslušné zkoušky ve fázi II B budou obecně nutné, pokud není možné tuto míru bezpečnosti stanovit.

4.1.2.1. Všechny zkoušky musí být prováděny s nejvyšší navrhovanou dávkou.

4.1.2.2. Vykazuje-li aktivní látka antimikrobiální aktivitu při koncentraci, ve které je obsažena v krmivu, musí být určena minimální inhibiční koncentrace - MIK (minimum inhibitory concentration - MIC) vůči vhodným patogenním i nepatogenním, endogenním i exogenním bakteriím v souladu se standardizovanými postupy.

- způsobit křížovou rezistenci na odpovídající antibiotika,
- selektovat rezistentní bakteriální kmeny za provozních podmínek užití u cílových druhů, a pokud tomu tak je, provést studie genetických mechanismů pro přenos rezistentních genů.
4.1.2.3. Testy určující schopnost doplňkové látky

4.1.2.4. Testy určující účinnost doplňkové látky na
- pomnožování nebo vylučování odpovídajících zoonotických mikroorganismů, například Salmonella spp., Campylobacter spp.
- určitý počet oportunních patogenů přítomných v zažívacím traktu (například enterobakterie, enterokoky a klostridie),

4.1.2.5. V případech, že aktivní látka vykazuje antimikrobiální aktivitu, musí být provedeny provozní zkoušky monitorování rezistence bakterií na doplňkovou látku.

- identifikace reziduí a stanovení jejich kinetiky v poživatelných tkáních a produktech (mléko, vejce),
- identifikace vyloučených látek, jako první požadavek pro posouzení jejich dopadu na životní prostředí.
- stanovení metabolických cest aktivní látky, jako základu pro její toxikologické vyhodnocení,
4.1.3.1. Účelem zkoušek je
V určitých případech, například u doplňkových látek získaných fermentací se může ukázat, že je nutné tyto zkoušky rozšířit na jiné, během fermentace přidané nebo odvozené látky. Zjištění průkazné toxicity vzhledem k toxicitě aktivní složky nebo aktivních složek doplňkové látky by tuto okolnost vysvětlila.

Zkoušky uvedené v bodech 4.1.3.1 a 4.1.3.2. musí obsahovat i metody s použitím izotopů nebo jiné odpovídající metody.
Požadují se tyto studie:
Návrh a experimentální schema zkoušek musí vzít v úvahu specifika cílové populace z hlediska anatomie, fyziologie (věk, druh, pohlaví), zootechnické kategorie i životního prostředí. Je-li třeba, musí být přihlédnuto k vlivu na střevní mikrofloru a na mikrofloru, předžaludků, enterohepatický cyklus a činnost slepého střeva. Testované dávkování musí být dávkování, s jakým se počítá pro užití a případně, je-li to odůvodněno, násobek této dávky. Aktivní látka (včetně značené látky) musí být zapracována do krmiva, kromě případu, kdy je odůvodněno, že se tak nestane.
- rozložení značeného materiálu v tkáních a produktech po podání jediné dávky zvířatům, která již jsou ve vyrovnaném stavu, jehož bylo dosaženo neznačenou doplňkovou látkou.
4.1.3.2. Farmakokinetika
- identifikace majoritních metabolitů (>10%) v exkrementech, kromě případu, kdy se zdá, že minoritní metabolit (<10%) by mohl být toxikologicky významný,
- metabolická bilance a kinetika v plazmě/krvi po podání jediné dávky, aby se mohla posoudit rychlost a rozsah absorpce, distribuce a vylučování (moč, výkaly, žluč, vydechovaný vzduch, mléko nebo vejce),

- ochranná lhůta pro doplňkovou láku nesmí být kratší než doba nutná pro to, aby koncentrace značeného rezidua stanovená v cílové tkáni klesla pod hodnotu MLR (95% hranice spolehlivosti). Body měření, časově určené, vybrané vhodným způsobem ve vazbě na fázi vylučování aktivní látky a jejich metabolitů, a minimálně čtyři zvířata na každý bod podle druhů (velikost, genetická variabilita) musí být považovány za požadované minimum.⁴)
4.1.3.3. Zkoušky reziduí
- identifikace takových reziduí (původní sloučenina, metabolity, produkty rozpadu, vázaná rezidua,²) která představují více než 10% všech reziduí (kromě toho, kdy by mohl být minoritní metabolit toxikologicky významný) v poživatelných tkáních a produktech (mléko, vejce) za metabolické rovnováhy, tj. po podání násobků dávek značené látky; poměr značeného rezidua ke všem reziduím,
- vylučovací zkouška značeného rezidua z cílových tkání (včetně mléka a v daném případě vajec) po vysazení doplňkové látky, které následuje po jeho opakovaném podávání, v souladu s navrhovanými podmínkami užití a které stačí k docílení stabilního stavu, aby bylo možno stanovit ochrannou lhůtu na základě stanoveného maximálního limitu reziduí MLR,
- kinetická studie reziduí v tkáních (včetně mléka a v daném případě vajec) během období jejich vylučování po dosažení stabilního stavu a za použití nejvyšší navrhované dávky profilující do metabolizmu, identifikace cílové tkáně³) a značeného rezidua,

4.2.5.1. Dvougenerační zkouška reprodukční toxicity
- zkoušky na reprodukční funkci musí být prováděny v rozsahu nejméně dvou filiálních generací (F1, F2) a mohou být kombinovány se zkouškou teratogenity. Zkoušená látka musí být podávána samcům a samicím ve vhodnou dobu před pářením. V podávání se musí pokračovat až do odstavu zvířat generace F2.
- Všechny relevantní parametry týkající se oplození, březosti, porodu, mateřského chování, kojení, růstu a vývoje potomstva generace F1 od početí do dospělosti a vývoj potomstva generace F2 až do odstavu se musí pečlivě sledovat a zaznamenat.

4.2.5.2. Zkoušky teratogenity
Zkoušky teranogenity zahrnují embryotoxicitu a foetotoxicitu. Musí se provádět nejméně na dvou druzích.

Musí být doloženo, že hladiny prachu ve vzduchu nepředstavují riziko pro zdraví pracovníků. Proto je v případě potřeby nezbytné doložit: inhalační testy na laboratorních zvířatech, publikované epidemiologické údaje, nebo vlastní údaje žadatele o jeho výrobním zařízení, nebo testy dráždivosti a testy na citlivost dýchacího ústrojí.
4.4.1.1. Účinky na dýchací ústrojí

4.4.1.2. Účinky na oči a pokožku
Musí být předloženy důkazy o tom, že nejsou známy případy dráždivosti, nebo senzibilizace u lidí. Tyto důkazy musí být doplněny výsledky validovaných testů na zvířatech týkajících se dráždivosti pokožky a očí a citlivosti způsobené možným použitím příslušné doplňkové látky.

4.4.1.3. Systémová toxicita
Pro posouzení ostatních aspektů bezpečnosti pracovníků, musí být užity údaje, které vznikly doplněním požadavků na bezpečnost (včetně testů toxicity opakovaných dávek, mutagenicity, kancerogenicity a reprodukčních testů). Při tom je nutno připomenout, že kontaminace pokožky, nebo vdechnutí doplňkové látky jsou nejčastější cesty exposice, jíž jsou pracovníci vystaveni.

- doplňkové látky určené pro domácí zvířata (s výjimkou koní):
a) chemická povaha a biologický vliv doplňkové látky i její užití ukazují, že dopad bude zanedbatelný: to znamená, když doplňková látka, nebo její hlavní metabolit (y) (více než 20% všech reziduí ve výkalech) jsou:
- fyziologické/přírodní látky (například vitamíny nebo minerální látka), které nezmění koncentraci v životním prostředí, dokud zde není pro to nějaký zřejmý závažný důvod (například měď),

b) nejhorší předpokládaná koncentrace v životním prostředí (PKŽP) je natolik nízká, aby byla brána v úvahu.

Doporučuje se následující postup pro určení rizika:
Účelem posuzování ve fázi II A je identifikovat riziko pro životní prostředí tím, že:
4.5.2.1. FÁZE II A
- se tyto výsledky užijí pro určení hodnoty (hodnot) předpokládané (-ných) koncentrace (-cí) bez účinku (PKBÚ).
- se určí poměr mezi exposicí, hladinami doplňkové látky, nebo hlavními metabolity a krátkodobými nežádoucími účinky na zástupné živočišné nebo rostlinné druhy srovnatelné v dotyčném prostředí,
- se zpřesní výpočet předpokládané koncentrace nebo předpokládaných koncentrací v životním prostředí – PKŽP,

Posouzení dopadu na suchozemské prostředí může zahrnovat:
Vhodné dodatečné testy na ekotoxicitu jsou popsány v řadě publikací, zejména v pokynech OECD. Může se stát, že bude nutné brát v úvahu tři kategorie druhů v prostředí, zvířata, rostliny a mikroorganismy. Požaduje se pečlivý výběr těchto testů, aby bylo zajištěno, že jsou vhodné pro situaci, v níž může být doplňková látka, nebo její hlavní metabolity uvolněna a rozptýlena do prostředí.
U doplňkových látek, u nichž po posouzení ve fázi II A zůstávají pochyby o vlivu na životní prostředí, je nutné provést podrobnější zkoušky o jejich účincích na biologické druhy v daném(-ých) prostředí, kde zkoušky fáze II A naznačovaly možné problémy: V tomto případě se požadují další testy, aby se určily chronické a specifičtější účinky na vhodných živočišných, rostlinných a mikrobiálních druzích. Je možné, že při posuzování ve fázi II A byla PKŽP nadhodnocena. Aby se tato skutečnost prokázala může být nezbytné provést měření koncentrací prostředí a persistence doplňkové látky, nebo jejich hlavních metabolitů v provozních podmínkách.
- pokud není možné stanovit adekvátní bezpečnou hranici mezi PKŽP a PKBÚ, musí být stanovena účinná omezující opatření, aby se zmírnil dopad na životní prostředí.
4.5.2.2. Fáze II B (podrobnější toxikologické zkoušky)
- testování chronické toxicity na nejcitlivějších vodních organismech, uvedených ve fázi II A, to znamená: testy v prvních stádiích života ryb, reprodukční test u dafnií, 72 hodinové testy na řasách a bioakumulační studii,
Posouzení dopadu na vodní prostředí může zahrnovat:
- Poznámka: samostatné posouzení toxicity u savců nemusí být nutné, pokud je uplatněno při testování toxicity u savců pro určení ADI (viz 4.3.1.)
- subletální zkoušku účinků na dešťovky, další zkoušky vlivu na půdní mikroflóru, testy fytotoxicity na škálu rostlinných druhů důležitých z ekonomického hlediska, testy zaměřené na bezobratlé živočichy na pastvinách, včetně hmyzu a volně žijících ptáků.

Nejvyšší hodnota PKŽP získaná z těchto výpočtů pro každé dané prostředí musí být použita pro posuzování rizika v úrovni II A.
a) Pokud výpočet nebyl proveden při fázi I, musí být přesněji vypočítána PKŽP pro každé dané prostředí. Při určování PKŽP se musí brát v úvahu:
- koncentrace doplňkové látky, nebo jejích hlavních metabolitů v hnoji následně po podání doplňkové látky zvířatům v navrhované dávce. Tento výpočet musí brát v úvahu objemy výkalů a míru dávkování,
- jiné faktory, jako například fotolýza, hydrolýza, vypařování, rozklad v půdě nebo v systémech vodního sedimentu, rozředění při orbě atd.
Pokud se předpokládá zvýšené přetrvání v půdě (D₉₀ > jeden rok) při koncentracích vyšších než 10 g/kg půdy při ustáleném stavu, může být nutné posouzení v úrovni fáze II.B
- potenciální rozředění vyloučené doplňkové látky vázané na materiál obvykle ošetřovaný jako hnůj a uložený před jeho rozmetáním do půdy,
- absorpce/desorpce doplňkové látky a jejích metabolitů na půdě, přetrvávání reziduí v půdě DT₅₀ a DT₉₀; sediment v případě akvakultury,

b) Následně musí být určeny hladiny, které mají vážné krátkodobé nežádoucí účinky pro různé trofické hladiny v daném životním prostředí (půda, voda). Tyto testy musí být v souladu s pokynem OECD⁶) nebo s analogickými osvědčenými pokyny. Žádoucí testy pro suchozemské prostředí zahrnují: toxicitu pro dešťovky (létální dávka 50% LD₅₀) fytotoxicitu (účinná koncentrace 50%, ÚK₅₀ ) pro suchozemské rostliny, účinky na půdní mikroorganismy (například: ÚK₅₀ pro účinky na metagenezi a vazbu dusíku).
Pro vodní prostředí: ryby, studie LD₅₀ 96 hodin; Daphnia magna, studie LD₅₀ za 48 hodin; řasy, studie ÚK₅₀ a studie toxicity pro sedimentační organismy.

c) Musí být určena hodnota PKBÚ (předpokládaná koncentrace bez účinku) pro každé dané prostředí. Získá se tak, že se vezme nejnižší zjistitelná hodnota (tj. výsledek u nejcitlivějšího druhu), kdy byl zpozorován nežádoucí účinek při výše uvedených testech na ekotoxicitu, a vydělí se faktorem bezpečnosti minimálně 100, v závislosti na ukazateli a počtu užitých testovaných druhů.

d) Vypočítané hodnoty PKŽP a PKBÚ se musí porovnat. Přijatelný poměr mezi PKŽP a PKBÚ bude záviset na povaze výsledku testu použitého pro určení PKBÚ. Běžně se bude pohybovat v rozmezí mezi 1 a 0,1. Pokud budou získány průkazně nižší poměry, je málo pravděpodobné, že budou nutné další ekotoxické testy, kromě případu, že se předpokládá bioakumulace. Na druhé straně vyšší poměry budou vyžadovat určité testy ve fázi II B.