4. Vitaminy

4.1. Stanovení obsahu cholinu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu cholinu v krmivech a premixech.
Obsah cholinu se stanoví po hydrolýze vzorku hydroxidem barnatým a přečištění hydrolyzátu na ionexu na základě vzniku komplexu s reineckátem amonným v prostředí roztoku fosforečnanu sodného spektrofotometricky po rozpuštění komplexu v acetonu při vlnové délce 525 nm. Alternativně je možno provádět stanovení cholinu metodou ITP.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit 10 % relat.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 20 mg/kg.

4.2. Stanovení obsahu pantothenanu vápenatého
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu pantothenanu vápenatého v premixech.
Obsah pantothenanu vápenatého se stanoví na základě stimulačního účinku na růst testovacího mikroorganismu Saccharomyces carlsbergensis CCM 4288 (ATCC 9080) difúzním plotnovým Metodaem.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez stanovitelnosti
Nestanovena.

4.3. Stanovení vitaminů B1, B2, B6
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu vitaminů B1, B2, B6 v krmných směsích.
Vitaminy B1 (thiamin), B2 (riboflavin) a B6 (pyridoxin) se extrahují ze vzorku krmiva vodou a po hydrolýze kyselinou chloristou se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s využitím iontových párů na reverzní fázi. Detekce vitaminu B2, a B6 se provádí přímo fluorescenční detekcí, zatímco vitamin B1 se před detekcí nejprve oxiduje derivatizačním činidlem v reakční smyčce postkolonové derivatizace.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez stanovitelnosti
Nestanovena.

4.4. Stanovení obsahu vitaminu B2
Účel, rozsah a princip
Používají se dvě metody stanovení obsahu vitaminu B2 v premixech - metoda fluorometrická a metoda difúzně plotnová.
Obsah vitaminu B2 se stanoví fluorometricky v mírně okyseleném prostředí na základě fluorescence při vlnové délce 440 nm nebo difúzně plotnovou metodou na základě stimulačního účinku na růst testovacího mikroorganismu Lactobacillus rhamnosus CCM 1825 (ATCC 7469).
Opakovatelnost
Pro metodu fluorometrickou nestanovena.
Pro metodu difuzní plotnovou:
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí při obsahu vitaminu B2 500 000 mg/kg překročit hodnotu 40 500 mg/kg.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez stanovitelnosti
Nestanovena.

4.5. Stanovení obsahu vitaminu B6
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu vitaminu B6 v premixech.
Vitamin B6 ve všech jeho formách se stanoví na základě stimulačního účinku na růst testovacího mikroorganismu kvasinky Saccharomyces carlsbergensis CCM 4228 (ATCC 9080) difúzním plotnovým způsobem.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez stanovitelnosti
Nestanovena.

4.6. Stanovení obsahu vitaminu A
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu vitaminu A v krmivech a premixech. Vitamin A zahrnuje all-trans retinol a jeho cis izomery, které se touto metodou stanoví. Obsah vitaminu A se vyjadřuje v mezinárodních jednotkách (IU) na kg. Mezinárodní jednotka odpovídá aktivitě 0,3 μg all-trans vitaminu A (alkohol) nebo 0,344 μg all-trans vitamin A (acetát) nebo 0,550 μg all-trans vitaminu A (palmitát).
Vzorek se hydrolyzuje ethanolickým roztokem hydroxidu draselného a vitamin A se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se rozpustí v methanolu a pokud je to nutné, naředí se na vhodnou koncentraci. Obsah vitaminu A se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi (RP-HPLC) s UV nebo fluorescenční detekcí. Chromatografické parametry jsou vybrány tak, aby nedocházelo k separaci all-trans vitaminu A (alkohol) a jeho cis izomerů.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 15 % relat. z hodnoty vyššího výsledku.
Reprodukovatelnost
Je uvedena u metody.
Mez stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 2000 m.j./kg

4.7. Stanovení obsahu vitaminu E
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu vitaminu E v krmivech a premixech. Obsah vitaminu E se vyjadřuje jako mg DL-α-tokoferol acetátu na kg. 1 mg DL-α-tokoferol acetátu odpovídá 0,91 mg DL-α-tokoferolu (vitamin E).
Vzorek se hydrolyzuje ethanolickým roztokem hydroxidu draselného a vitamin E se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se rozpustí v methanolu a pokud je to nutné, naředí se na vhodnou koncentraci. Obsah vitaminu E se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi (RP-HPLC) s UV nebo fluorescenční detekcí.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 15 % relat. z vyššího výsledku.
Reprodukovatelnost
Je uvedena u metody.
Mez stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 2 mg/kg.

4.8. Stanovení obsahu vitaminu D
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu vitaminu D v krmivech.
Vitamin D se stanoví po alkalické hydrolýze vzorku hydroxidem draselným za studena, následné extrakci do hexanu, přečištění na semipreparativní koloně Silica metodou HPLC. Frakce vitaminu D se zachytí, odpaří se k suchu a odparek se rozpustí v methanolu. V extraktu se stanoví obsah vitaminu D vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na analytické koloně s reverzní fází C18 s UV detekcí při 265 nm.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 20 % relat.
Reprodukovatelnost
Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit 30 % relat.
Mez stanovitelnosti
Nestanovena.