k vyhlášce č. 124/2001 Sb.
Partie se uznává, jestliže výsledek jediné analýzy nepřekročí příslušný maximální obsah stanovený v příloze č. 3 vyhlášky č. 451/2000 Sb. při zohlednění nejistoty měření.
Použité zkratky: „T“ = tetra; „Pe“ = penta; „Hx“ = hexa; „Hp“ = hepta; „O“ = okta; „CDD“ = chlorodibenzo-p-dioxin; „CDF“ = chlorodibenzofuran; „CB“ = chlorobifenyl.
| Kongener | Hodnota TEF | Kongener | Hodnota TEF |
|---|---|---|---|
| Dibenzo-p-dioxiny („PCDD“) | PCB „s dioxinovým efektem“: non-ortho | ||
| PCB + mono-ortho PCB | |||
| 2,3,7,8-TCDD | 1 | Non-ortho PCB | |
| 1,2,3,7,8-PeCDD | 1 | ||
| 1,2,3,4,7,8-HxCDD | 0,1 | ||
| 1,2,3,6,7,8-HxCDD | 0,1 | PCB 77 | 0,0001 |
| 1,2,3,7,8,9-HxCDD | 0,1 | PCB 81 | 0,0001 |
| 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD | 0,01 | PCB 126 | 0,1 |
| OCDD | 0,0001 | PCB 169 | 0,01 |
| Dibenzofurany („PCDF“) | Mono-ortho PCB | ||
| 2,3,7,8-TCDF | 0,1 | PCB 105 | 0,0001 |
| 1,2,3,7,8-PeCDF | 0,05 | PCB 114 | 0,0005 |
| 2,3,4,7,8-PeCDF | 0,5 | PCB 118 | 0,0001 |
| 1,2,3,4,7,8-HxCDF | 0,1 | PCB 123 | 0,0001 |
| 1,2,3,6,7,8-HxCDF | 0,1 | PCB 156 | 0,0005 |
| 1,2,3,7,8,9-HxCDF | 0,1 | PCB 157 | 0,0005 |
| 2,3,4,6,7,8-HxCDF | 0,1 | PCB 167 | 0,00001 |
| 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF | 0,01 | PCB 189 | 0,0001 |
| 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF | 0,01 | ||
| OCDF | 0,0001 | ||
Tabulka PCB s dioxinovým efektem
Tato pravidla se uplatní pro výsledek analýzy získaný ze vzorku pro úřední kontrolu.
– stanovením rozhodovací meze (CCα) v souladu s rozhodnutím Komise 2002/657/ES (bod 3.1.2.5. přílohy pro látky, pro něž byla stanovena přípustná hodnota).
– započítáním rozšířené nejistoty při použití faktoru pokrytí 2, který odpovídá hladině spolehlivosti alespoň 95 %, nebo
Nejistotu měření lze zohlednit jedním z těchto způsobů:
Partie nesplňuje maximální obsah stanovený v příloze č. 3 vyhlášky č. 451/2000 Sb., jestliže výsledek analýzy potvrzený druhou analýzou a vypočtený jako průměr nejméně dvou nezávislých stanovení při zohlednění nejistoty měření překročí maximální obsah.
2. Soulad partie nebo subpartie se specifikací
Část 1:
Metody odběru vzorků pro odborný dozor a zkoušení obsahu dioxinů (PCDD/PCDF) a určování dioxinům podobných PCB v některých krmivech
Vzorky určené pro úřední kontrolu obsahu dioxinů (PCDD/PCDF), jakož i pro určení obsahu PCB s dioxinovým efektem (Tabulka PCB s dioxinovým efektem) v krmivech se odebírají v souladu s § 1 až 6 této vyhlášky. Musí se použít kvantitativní požadavky týkající se kontroly látek nebo produktů obsažených rovnoměrně v krmivech v souladu s § 1 až 6 této vyhlášky. Takto získané souhrnné vzorky se považují za reprezentativní pro vzorkované partie nebo subpartie, z nichž jsou odebrány. Dodržení maximálních obsahů stanovených v příloze č. 3 vyhlášky č. 451/2000 Sb. se posuzuje na základě obsahů stanovených v laboratorních vzorcích.
1. Účel a oblast působnosti
3. Příprava vzorků
– vzorky musí být skladovány a přepravovány ve skleněných, hliníkových, polypropylénových nebo polyethylenových nádobách. Z nádoby na vzorky musí být odstraněny stopy papírového prachu. Skleněné nádobí musí být vypláchnuto rozpouštědly předem zkontrolovanými z hlediska přítomnosti dioxinů,
– hmotnost vzorku použitá k extrakci musí být dostatečná vzhledem k citlivosti.
– musí být provedena slepá zkouška, která spočívá v provedení celého analytického postupu s vynecháním vzorku,
Pro přípravu vzorků k laboratornímu zkoušení jsou použitelné postupy uvedené v příloze č. 7 této vyhlášky. Kromě toho musí být splněny tyto požadavky:
– laboratoře musí prokázat účinnost metody v rozsahu koncentrace, která je předmětem zájmu, například polovina, jedno a dvojnásobek koncentrace, která je předmětem zájmu, s přijatelným variačním koeficientem výsledků opakované analýzy. Podrobnosti kritérií přijatelnosti viz bod 5;
– úspěšná účast v mezilaboratorních studiích, které hodnotí způsobilost laboratoře, je nejlepším způsobem, jak prokázat schopnost provádět určitá stanovení. Avšak úspěšná účast v mezilaboratorních studiích, například pro půdní vzorky nebo vzorky odpadních vod, nezbytně neprokazuje též schopnost v oblasti vzorků potravin nebo krmiv, kde jde o nižší úrovně znečištění. Proto je povinná trvalá účast v mezilaboratorních studiích stanovení dioxinů a dioxinům podobných PCB v příslušných matricích krmiv/potravin;
– laboratoře musí být akreditovány uznávaným subjektem působícím v souladu s ISO Guide 58, aby bylo zajištěno, že uplatňují zabezpečování jakosti při analýzách. Laboratoře by měly být akreditovány podle normy ISO/IEC 17025:1999.
– jako opatření v rámci vnitřní kontroly jakosti se provádějí pravidelné slepé zkoušky, stanovení se standardním přídavkem nebo stanovení kontrolních vzorků (nejlépe certifikovaného referenčního materiálu, je-li k dispozici);
– mezní hodnota stanovitelnosti pro ověřovací metodu musí být v rozsahu asi jedné pětiny úrovně, která je předmětem zájmu, aby byla jistota, že v rozsahu úrovně, která je předmětem zájmu, se dosahuje přijatelných variačních koeficientů;
4. Požadavky kladené na laboratoře
5. Požadavky kladené na analytické metody zkoušení dioxinů a dioxinům podobných PCB
| Vyhledávací metody | Ověřovací metody | |
|---|---|---|
| Falešně negativní koncentrace | < 1 % | |
| Správnost | -20 až +20 % | |
| Variační koeficient | < 30 % | < 15 % |
Vyhledávací metody mohou zahrnovat metody biologických zkoušek a metody GC/MS; ověřovací metody jsou metody plynové chromatografie s vysokým rozlišením/ hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením (HRGC/HRMS). Celková hodnota TEQ musí vyhovovat těmto kritériím
– vysoká citlivost a nízké mezní hodnoty detekce. Pro PCDD a PCDF musí být detekovatelná množství v řádu pikogramů TEQ (10-12 g), kvůli mimořádné toxicitě některých z těchto sloučenin. Je známo, že PCB se vyskytují ve vyšších koncentracích než PCDD a PCDF. Pro většinu kongenerů PCB již postačuje citlivost v řádu nanogramů (10-9 g). Avšak pro měření jedovatějších dioxinům podobných kongenerů PCB (zejména non-ortho substituovaných forem) musí být dosaženo stejné citlivosti jako pro PCDD a PCDF;
– vysoká přesnost (správnost a shodnost). Stanovení musí poskytnovat platný a spolehlivý odhad skutečné koncentrace ve vzorku. Je nezbytná vysoká přesnost (přesnost měření: velká shoda výsledku měření a skutečné nebo přisuzované hodnoty měření), aby se předešlo zamítnutí analýzy vzorku na základě špatné spolehlivosti odhadu TEQ. Přesnost se vyjadřuje jako správnost (rozdíl mezi střední naměřenou hodnotou analytu v certifikovaném referenčním materiálu a jeho certifikovanou hodnotou, vyjádřený jako procento této hodnoty) a shodnost (shodnost se obvykle počítá jako standardní odchylka zahrnující opakovatelnost a reprodukovatelnost a označuje míru shody mezi výsledky získanými několikanásobným použitím experimentálního postupu za předepsaných podmínek).
– vysoká selektivita. Je nutné rozlišovat PCDD, PCDF a dioxinům podobné PCB od velkého množství jiných, společně extrahovaných a eventuálně rušivých sloučenin přítomných v koncentracích až o několik řádů vyšších než koncentrace látek, které jsou předmětem zájmu. Pro plynovou chromatografii s hmotnostní spektrometrií (GC/MS) je nezbytné rozlišení mezi různými kongenery, tj. mezi toxickými (např. sedmnáct 2,3,7,8-substituovaných PCDD a PCDF a dioxinům podobných PCB) a ostatními kongenery. Biologické zkoušky sloučenin musí být schopny selektivně určit hodnoty TEQ jako součet PCDD, PCDF a dioxinům podobných PCB;
Základní požadavky pro uznání analytických metod:
– Stanovení se provádí podle metody EPA 1613 revize B: tetra- až okta-chlorované dioxiny a furany pomocí izotopického zřeďování HRGC/HRMS nebo jinou metodou se shodnými pracovními charakteristikami (performance criteria).
– u krmiv kontaminovaných dioxiny v rozsahu maximální úrovně nebo nad ní by rozdíl mezi horní a dolní mezní úrovní neměl překročit 20 %. U krmiv s úrovní kontaminace výrazně pod maximální úrovní se může rozdíl pohybovat v rozmezí 25 a 40 %.
– při validaci metody musí být hned na počátku analytické metody, například před extrakcí, provedeno přidání vnitřních standardů 2,3,7,8-chlór substituovaných PCDD/F značených pomocí 13C (a vnitřních standardů dioxinům podobných PCB značených pomocí 13C, pokud musí být určeny dioxinům podobné PCB). Alespoň jeden kongener musí být přidán pro každou z tetra nebo okta-chlorovaných homologických skupin PCDD/F (a alespoň jeden kongener pro každou z homologických skupin dioxinům podobných PCB, pokud musí být určeny dioxinům podobné PCB) (nebo alespoň jeden kongener pro každou skupinu vybraných iontů při použití hmotnostní spektrometrie v režimu registrace vybraných iontů, použitou pro sledování PCDD/F a dioxinům podobných PCB). Jednoznačně se dává přednost, zejména v případě ověřovacích metod, použití všech 17 vnitřních standardů 2,3,7,8-substituovaných PCDD/F značených pomocí 13C a všech 12 vnitřních standardů dioxinům podobných PCB značených pomocí 13C (pokud musí být určeny dioxinům podobné PCB).
6. Zvláštní požadavky, které musí splňovat metody GC/MS, aby vyhovovaly pro účely vyhledávání nebo ověřování
– Pro krmiva rostlinného původu a krmiva živočišného původu obsahující méně než 10 % tuku je přidání vnitřních standardů před extrakcí povinné. Pro krmiva živočišného původu obsahující více než 10 % tuku se vnitřní standardy přidávají buď před, nebo po extrakci tuku. Vhodná validace účinnosti extrakce se provádí v závislosti na tom, kdy je vnitřní standard přidáván a na tom, zda jsou výsledky uváděny v produktu nebo v tuku.
– Před analýzou GC/MS musí být přidán jeden nebo dva standardy pro stanovení výtěžnosti.
– Kontrola výtěžnosti je nezbytná. U ověřovacích metod se výtěžnost jednotlivých vnitřních standardů pohybuje v rozsahu 60 až 120 %. Nižší nebo vyšší hodnota výtěžnosti jednotlivých kongenerů zejména některých hepta- a okta-chlorovaných dibenzodioxinů a dibenzofuranů, je přípustná pod podmínkou, že jejich příspěvek k hodnotě TEQ nepřesáhne 10 % celkové hodnoty TEQ (jen na základě PCDD/F). Hodnota výtěžnosti u vyhledávacích metod se pohybuje mezi 30 a 140 %.
Pro ty kongenery, k nimž není přidán žádný analog značený pomocí 13C, se určí relativní koeficienty odezvy při použití vhodných kalibračních roztoků.
– Oddělení dioxinů od rušivých chlorovaných sloučenin, jako jsou PCB a chlorované difenylethery, se provádí vhodnými chromatografickými technikami (nejlépe na florisilové, aluminové a/nebo uhlíkové koloně).
– Oddělení isomerů pomocí plynové chromatografie musí být dostatečné (< 25 % mezi píky 1,2,3,4,7,8-HxCDF a 1,2,3,6,7,8-HxCDF).
7. Vyhledávací analytické metody
8. Oznamování výsledků
Pokud to používaný analytický postup umožňuje, analytické výsledky uvádí množství jednotlivých kongenerů PCDD/F a PCB jako dolní, horní a střední odhady, aby oznamované výsledky obsahovaly maximum informací. Dále se uvádí také obsah lipidů ve vzorku a metoda použitá pro extrakci lipidů.
Výtěžnost vnitřních standardů se uvádí, pokud jsou výsledky mimo povolený rozsah maximálních hodnot uvedených v bodu 6 a v ostatních případech na vyžádání.
Vyhledávací metody mohou být použity k různým přístupům: čistě vyhledávací přístup a nebo kvantitativní přístup.
7.1 Úvod
Vyhledávací přístup
Odezva vzorků se porovnává s odezvou srovnávacího vzorku na úrovni, která je předmětem zájmu. Vzorky s odezvou nižší než srovnávací vzorek se považují za negativní, vzorky s vyšší odezvou se považují za pozitivní. Požadavky:
– do každé zkušební série se zařazují alespoň jeden slepý a jeden srovnávací vzorek, které se extrahují a zkouší současně za shodných podmínek. Odezva srovnávacího vzorku musí být zřetelně vyšší ve srovnání se slepým vzorkem,
– zařazují se další srovnávací vzorky s poloviční a dvojnásobnou koncentrací, která je předmětem zájmu, aby se prokázala řádná účinnost zkoušky pro kontrolu koncentrace, která je předmětem zájmu,
– při zkoušení jiných matric se musí prokázat vhodnost referenčního vzorku(ů), nejlépe zařazením vzorků, u nichž bylo pomocí HRGC/HRMS zjištěno, že obsahují množství TEQ přibližně odpovídající referenčnímu vzorku nebo jinému slepému vzorku obohacenému na tuto úroveň,
– protože při biologických zkouškách sloučenin nemohou být použity žádné vnitřní standardy, jsou pro získání informací o standardní odchylce v rámci jedné zkušební série velmi důležité testy opakovatelnosti. Variační koeficient musí být nižší než 30 %,
– pro biologické zkoušky jsou definovány cílové (stanovované) sloučeniny, možné rušivé vlivy a maximální přípustné slepé hodnoty.
Kvantitativní přístup
Kvantitativní přístup vyžaduje standardní sérii ředění, dvojnásobné nebo trojnásobné čištění a měření, jakož i slepé stanovení a kontrolu výtěžnosti. Výsledek se vyjádřuje jako TEQ, čímž se předpokládá, že sloučeniny odpovědné za signál odpovídají principu TEQ. Toto může být provedeno pomocí TCDD (nebo standardní dioxin/furanové směsi) za účelem vytvoření kalibrační křivky pro výpočet hodnoty TEQ v extraktu a tedy i vzorku. Tato hodnota se následně koriguje podle hodnoty TEQ vypočtené pro slepý vzorek (aby se zohlednily nečistoty z použitých rozpouštědel a chemikálií) a výtěžnost (vypočtená z hodnoty TEQ ve vzorku pro kontrolu jakosti v blízkosti mezní koncentrace, která je předmětem zájmu). Je nezbytné poznamenat, že část zřejmé ztráty výtěžnosti může být způsobena matricovými jevy a/nebo rozdíly mezi hodnotami TEF v biologických zkouškách sloučenin a úředními hodnotami TEF stanovenými WHO.
– jsou nezbytné informace o počtu falešně pozitivních a falešně negativních výsledků velkého souboru vzorků pod a nad maximální úrovní nebo účinnou úrovní ve srovnání s obsahem TEQ určeným ověřovací analytickou metodou. Skutečný podíl falešně negativních výsledků musí být nižší než 1 %. Podíl falešných pozitivních výsledků musí být natolik nízký, aby se použití vyhledávacího nástroje stalo výhodným;
– pro vyhledávání se používají analytické metody GC/MS a biologické metody zkoušení. Pro metody GC/MS se uplatňují požadavky stanovené v bodu 6. Pro buněčné biologické zkoušky sloučenin platí zvláštní požadavky stanovené v bodu 7.3 a pro biologické zkoušky sloučenin prováděné pomocí setů platí zvláštní požadavky stanovené v bodu 7.4;
– pozitivní výsledky musí být vždy potvrzeny ověřovací analytickou metodou (HRGC/HRMS). Kromě toho se pomocí HRGC/HRMS potvrzují vzorky z širokého rozmezí hodnot TEQ (přibližně 2 až 10 % negativních vzorků) a předkládají se informace o souladu výsledků biologické zkoušky a HRGC/HRMS.
7.2. Požadavky kladené na analytické metody používané pro vyhledávání
– mezní hodnota detekce se stanovuje jako trojnásobek směrodatné odchylky slepého pokusu s rozpouštědlem nebo z odezvy pozadí. Dalším přístupem je použití odezvy, která je nad pozadím (indukční koeficient rovnající se pětinásobku slepého pokusu s rozpouštědlem) vypočteným z kalibrační křivky dne. Mez stanovitelnosti se stanovuje jako pětinásobek standardní odchylky odezvy slepého pokusu s rozpouštědlem nebo pozadí nebo pomocí odezvy, která je jasně nad pozadím (indukční koeficient rovnající se desetinásobku odezvy slepého rozpouštědla) vypočteným z kalibrační křivky dne.
– pro každý srovnávací materiál se zaznamenávají a kontrolují grafy kontroly jakosti, aby byl zajištěn soulad výsledku se směrnicemi;
– variační koeficient nesmí být vyšší než 15 % při trojnásobném stanovení pro každé ředění vzorku a pro tři nezávislé pokusy by neměl přesáhnout 30 %;
– aby bylo výsledku biologické zkoušky sloučenin dosaženo během konstantní doby, používá se srovnávací koncentrace TCDD (asi trojnásobek meze detekce) uvedená na listu kontroly jakosti. Jinou možností je relativní odezva srovnávacího vzorku vztažená ke kalibrační křivce TCDD, protože odezva buněk může záviset na mnoha faktorech;
– při biologickém zkoušení vyžaduje každá zkouška řadu srovnávacích koncentrací TCDD nebo dioxin/furanových směsí (úplná křivka dávka/odezva s R2 > 0,95). Avšak pro účely vyhledávání se používá rozšířená nízkoúrovňová křivka pro analyzování vzorků s nízkým obsahem;
– zejména v případě kvantitativního vyhodnocování musí být výsledek ředění vzorků uvnitř lineárního části úseku křivky odezvy. Vzorky nad lineární částí křivky odezvy musí být znovu zředěny a přezkoušeny. Proto se doporučuje zkoušet alespoň tři nebo více různě ředěných vzorků najednou;
7.3. Zvláštní požadavky kladené na biologické zkoušky sloučenin
Poznámka: Dosud nebyly předloženy žádné důkazy o tom, že komerčně dostupné biologické zkoušky sloučenin prováděné pomocí souprav jsou dostatečně citlivé a spolehlivé na to, aby mohly být používány k vyhledávacímu zjišťování přítomnosti dioxinů v požadovaných koncentracích ve vzorcích potravin a krmiv.
7.4. Zvláštní požadavky kladené na biologické zkoušky sloučenin prováděné pomocí souprav (kitů)
– musí být dodržovány pokyny výrobce pro přípravu vzorků,
– nepoužívají materiály a součásti navržené pro použití s jinými soupravami,
– nepoužívají se zkušební soupravy po uplynutí doby použitelnosti,
– pro zkoušky v laboratořích se doporučuje požívat srovnávací standardy, aby byla jistota, že citlivost standardu je v přijatelném rozsahu.
– mezní hodnota detekce pro imunologickou zkoušku se určuje jako součet střední hodnoty a trojnásobku standardní odchylky, vycházejících z deseti opakovaných analýz slepého vzorku, jenž se dělí směrnicí přímky, získané lineární regresí;
– zkušební soupravy se uchovávají v předepsaném rozsahu skladovacích teplot a používají se při předepsané provozní teplotě,
Příprava vzorků a požadavky na metody analytického zkoušení používané při provádění odborného dozoru a zkoušení obsahu dioxinů (pcdd/pcdf) a stanovení dioxinům podobných pcb v některých krmivech
Část 2:
Tyto požadavky na metody analytického zkoušení se používají pro stanovení dioxinů (polychlorovaných dibenzo-p-dioxinů (PCDD) a polychlorovaných dibenzofuranů (PCDF)) a dioxinům podobných polychlorovaných bifenylů (PCB) v krmných surovinách a krmivech.
Sledování přítomnosti dioxinů v krmivech se provádí pomocí strategie zahrnující vyhledávací metodu pro výběr vzorků s obsahem dioxinů a dioxinům podobných PCB o méně než 30 až 40 % nižším nebo vyšším než je množství, které je předmětem zájmu. Koncentrace dioxinů ve vzorcích s významným obsahem se stanoví/potvrdí ověřovací metodou.
Ověřovací metody jsou metody, které poskytují úplné nebo doplňkové informace umožňující jednoznačnou identifikaci a kvantifikaci dioxinů a dioxinům podobných PCB na uvažované úrovni, která je předmětem zájmu.
Vyhledávací metody jsou metody, které se používají ke zjišťování přítomnosti dioxinů a dioxinům podobných PCB v množství, které je předmětem zájmu. Tyto metody jsou schopné rychle zpracovat velký objem vzorků a používají se k prověření velkého množství vzorků z hlediska možných pozitivních výsledků. Jsou speciálně navrženy tak, aby vyloučily falešně negativní výsledky.
1. Cíl a oblast použití
Koncepce „dolní hranice“ vyžaduje, aby se do celkové hodnoty TEQ započítala za každý nekvantifikovaný kongener nulová hodnota.
Protože vzorky z životního prostředí a biologické vzorky (včetně vzorků krmných surovin/krmiv) obvykle obsahují složité směsi různých dioxinových kongenerů, byla pro usnadnění hodnocení jejich nebezpečnosti vyvinuta koncepce koeficientů toxické ekvivalence (TEF). Tyto TEF byly stanoveny, aby vyjádřily koncentraci směsí 2,3,7,8-substituovaných PCDD a PCDF, a později také u některých non-ortho a mono-ortho-chlór substituovaných PCB, které vykazují aktivitu podobnou dioxinům, v toxických ekvivalentech (TEQ) 2,3,7,8-TCDD (viz. Tabulka Světové zdravotnické organizace)
2. Obecně
Koncentrace jednotlivých látek v daném vzorku se násobí jejich příslušným TEF a tyto násobky se následně sčítají, aby se dospělo k celkové koncentraci dioxinům podobných sloučenin, vyjádřených v TEQ.
Koncepce „horní hranice“ vyžaduje, aby se do celkové hodnoty TEQ započítaly mezní hodnoty kvantifikace každého nekvantifikovaného kongeneru.
Koncepce „střední hodnoty“ vyžaduje, aby se do celkové hodnoty TEQ započítala polovina mezní hodnoty kvantifikace pro každý nekvantifikovaný kongener.
Souvislosti
Část 3:
Pouze pro účely této vyhlášky je schválenou specifickou mezí kvantifikace jednotlivého kongeneru koncentrace analytu v extraktu vzorku, jenž vytváří instrumentální odezvu na dva různé ionty, která má být monitorována v poměru signál – šum 3 : 1 pro méně citlivé signály a při splnění základních požadavků, jako je např. retenční čas, poměr izotopu podle postupu určení popsaného v metodě EPA 1613 revize B.