ČÁST II
Diagnostické postupy k potvrzení VHS a IHN při podezření na výskyt nákazy
Pro diagnózu IHN a VHS je nezbytné provést jeden nebo několik z následujících postupů:
- A. konvenční izolace viru s následnou sérologickou identifikací viru,
- B. izolace viru se simultánní sérologickou identifikací viru,
- C. další diagnostické metody (IFAT, ELISA).
Potvrzení prvního výskytu VHS a/nebo IHN v hospodářstvích ve schválených oblastech nesmí být založeno výhradně na metodě C. Musí být použita též metoda A nebo B.
K tkáňovému materiálu určenému pro virologické vyšetření může být v některých případech nutné připojit doplňkový materiál pro bakteriologické, parazitologické, histologické nebo jiné vyšetření, aby mohla být provedena diferenciální diagnóza.

A. Konvenční izolace viru s následnou sérologickou identifikací viru

I.1 Odběr vzorků
K vyšetření je nutno vybrat minimálně deset ryb s typickými příznaky onemocnění IHN, popř. VHS.

I.2 Příprava a způsob balení vzorků z ryb
Viz část I odd. I. odst. 3

II. Příprava vzorků pro virologické vyšetření
Viz část I odd. II.

I.3 Odběr doplňkového diagnostického materiálu
Viz část I odd. I. odst. 4.

III. Virologické vyšetření
Viz část I odd. III.

IV. Identifikace viru
Viz část I odd. IV.

B. Izolace viru se simultánní sérologickou identifikací viru

I.1 Odběr vzorků
Viz část II kap. A. odd. I. odst. 1.

II.1 Homogenizace orgánů
Viz část I odd. II.odst. 2.

III.1 Buněčné kultury a média
Viz část I odd. III. odst. 1.

I.2 Příprava a způsob balení vzorků z ryb
Viz část I odd. I. odst. 3.

II.2 Odstřeďováníní homogenátu
Homogenát se odstřeďuje v odstředivce chlazené na 2 až 5°C při 2000 až 4000x g po dobu 15 minut. Supernatant se odebírá a ošetřuje čtyři hodiny při 15°C antibiotiky (např. gentamycinem v dávce 1 mg/ml) nebo filtruje na membráně s nízkou schopností vázat proteiny a velikostí pórů 0,45 μm.

III.2 Inokulace buněčných kultur
Z každé směsi viru se sérem (připravené podle části II kap. B. odd. II. odst. 3) jsou inokulovány minimálně dvě buněčné kultury od každé buněčné linie dávkami 50 μl.

I.3 Odběr doplňkového diagnostického materiálu
Viz část I odd. I. odst. 4.

II.3 Ošetření supernatantu diagnostickými antiséry
Antibiotiky ošetřená či membránou filtrovaná suspenze orgánů je zředěna médiem buněčné kultury v poměru 1:10 a 1:1000 a inkubována 60 minut při 15°C se stejnými podíly reagencií, jaké jsou vyjmenovány v části I odd. IV. odst. 2.

III.3 Inkubace buněčných kultur
Viz část I odd. III. odst. 1.

III.4 Mikroskopické vyšetření
Inokulované buněčné kultury se denně prohlížejí při zvětšení 40× až 150×, aby byl zjištěn výskyt cytopatického efektu (CPE). Jestliže jedno z použitých antisér zabrání vzniku CPE, může být virus považován za prokázaný.
Jestliže ani jedno z použitých antisér nezabrání vzniku CPE, je nutno uplatnit identifikační metody podle části I odd. IV.

III.5 Subkultivace
Jestliže po sedmi až deseti dnech nevznikne žádný CPE, musí být provedena subkultivace z kultur inokulovaných supernatantem s přídavkem média (viz část II kap. B. odd. II. odst. 3) podle části I odd. III. odst. 5.

C. Jiné diagnostické postupy
Supernatant připravený podle postupu uvedeného v části I odd. II. odst. 2 může být vyšetřen metodou IFAT podle části I odd. IV. odst. 3 popřípadě metodou ELISA podle části I odd. IV. odst. 4. Tyto rychlé vyšetřovací metody musí být doplněny virologickým vyšetřením podle bodu A nebo B do 48 hodin po odběru vzorku, jestliže
Tkáňový materiál může být vyšetřen dalšími diagnostickými metodami (např. RT-PCR, IF v kryokatových řezech materiálu nebo imunohistochemickým vyšetřením materiálu fixovaného formalínem). Tyto postupy musí být vždy doplněny inokulací nefixovaného tkáňového materiálu do buněčných kultur.

a) je výsledek vyšetření negativní,
nebo

b) je výsledek vyšetření pozitivní u materiálu, představujícího první případ vypuknutí IHN nebo VHS ve schválené oblasti.