B. Izolace viru se simultánní sérologickou identifikací viru

I.1 Odběr vzorků
Viz část II kap. A. odd. I. odst. 1.

II.1 Homogenizace orgánů
Viz část I odd. II.odst. 2.

III.1 Buněčné kultury a média
Viz část I odd. III. odst. 1.

I.2 Příprava a způsob balení vzorků z ryb
Viz část I odd. I. odst. 3.

II.2 Odstřeďováníní homogenátu
Homogenát se odstřeďuje v odstředivce chlazené na 2 až 5°C při 2000 až 4000x g po dobu 15 minut. Supernatant se odebírá a ošetřuje čtyři hodiny při 15°C antibiotiky (např. gentamycinem v dávce 1 mg/ml) nebo filtruje na membráně s nízkou schopností vázat proteiny a velikostí pórů 0,45 μm.

III.2 Inokulace buněčných kultur
Z každé směsi viru se sérem (připravené podle části II kap. B. odd. II. odst. 3) jsou inokulovány minimálně dvě buněčné kultury od každé buněčné linie dávkami 50 μl.

I.3 Odběr doplňkového diagnostického materiálu
Viz část I odd. I. odst. 4.

II.3 Ošetření supernatantu diagnostickými antiséry
Antibiotiky ošetřená či membránou filtrovaná suspenze orgánů je zředěna médiem buněčné kultury v poměru 1:10 a 1:1000 a inkubována 60 minut při 15°C se stejnými podíly reagencií, jaké jsou vyjmenovány v části I odd. IV. odst. 2.

III.3 Inkubace buněčných kultur
Viz část I odd. III. odst. 1.

III.4 Mikroskopické vyšetření
Inokulované buněčné kultury se denně prohlížejí při zvětšení 40× až 150×, aby byl zjištěn výskyt cytopatického efektu (CPE). Jestliže jedno z použitých antisér zabrání vzniku CPE, může být virus považován za prokázaný.
Jestliže ani jedno z použitých antisér nezabrání vzniku CPE, je nutno uplatnit identifikační metody podle části I odd. IV.

III.5 Subkultivace
Jestliže po sedmi až deseti dnech nevznikne žádný CPE, musí být provedena subkultivace z kultur inokulovaných supernatantem s přídavkem média (viz část II kap. B. odd. II. odst. 3) podle části I odd. III. odst. 5.