VII. METODY PRO STANOVENÍ ROZDĚLOVACÍHO KOEFICIENTU – metody uvedené v bodu A.8 přílohy směrnice 92/69/EHS
DODATEK 1
Metody výpočtu nebo odhadu
ÚVOD
Obecný úvod do výpočtových metod, data a příklady jsou uvedeny v příručce Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a).
Vypočtené hodnoty P_o/v lze použít
— k rozhodnutí, která z experimentálních metod je vhodná (rozsah u třepací lahve: log P_o/v: –2 až 4, rozsah u HPLC: log P_o/v: 0 až 6),
— k volbě vhodných zkušebních podmínek (např. referenčních látek pro postupy HPLC, poměr objemů n-oktanol/voda pro metodu třepací lahve),
— jako vnitřní laboratorní kontrolu možných experimentálních chyb,
— k získání odhadu P_o/v v případech, kdy zkušební metody nelze z technických důvodů použít.
METODA ODHADU
Předběžný odhad rozdělovacího koeficientu
Hodnotu rozdělovacího koeficientu je možné odhadnout s použitím rozpustnosti zkušební látky v čistých rozpouštědlech:
Pro tento případ platí:
$P_{odhad}=\frac{\text{nasycení}{c}_{oktan-1-ol}}{\text{nasycení}{c}_{voda}}$
VÝPOČTOVÉ METODY
Podstata výpočtových metod
Všechny výpočtové metody jsou založeny na formálním dělení molekul do vhodných podstruktur, pro něž jsou známy spolehlivé hodnoty přírůstků log P_o/v. Hodnota log P_o/v celé molekuly se poté vypočte jako součet hodnot pro příslušné fragmenty plus součet korekčních členů pro intramolekulární interakce.
Existují seznamy konstant fragmentů a korekčních členů (b, c, d, e). Některé se pravidelně aktualizují (b).
Kritéria jakosti
Spolehlivost výpočtové metody obecně klesá s rostoucí složitostí zkoumané sloučeniny. V případě jednoduchých molekul s nízkou molekulovou hmotností a jednou nebo dvěma funkčními skupinami lze očekávat, že odchylky hodnot log P_o/v získaných různými fragmentačními metodami od naměřené hodnoty budou v rozmezí od 0,1 do 0,3. U složitějších molekul může být rozpětí chyby větší. Závisí to na spolehlivosti a dostupnosti konstant pro fragmenty a rovněž na schopnosti zjistit intramolekulární interakce (např. vodíkové vazby) a na správném používání korekčních členů (což není obtížné při použití počítačového programu CLOGP-3) (b). V případě disociujících látek je důležité správně zohlednit náboj nebo stupeň disociace.
Postupy výpočtu
Hanschova π-metoda
Původní konstanta hydrofobnosti substituentu π zavedená Fujitou et al. (f) je definována jako
${\pi }_X=\log P_{O/V}PhX-\log P_{O/V}PhH$
kde P_o/v (PhX) je rozdělovací koeficient aromatického derivátu a P_o/v (PhH) rozdělovací koeficient výchozí sloučeniny
${(např.\pi }_{Cl}=\log P_{O/V}{C}_6{H}_{5}Cl-\log P_{O/V}{C}_6{H}_6=\mathrm{2,84}-\mathrm{2,13}=\mathrm{0,71}).$
Ze své definice je π-metoda použitelná především u aromatických substituentů. Hodnoty π byly pro velký počet substituentů uspořádány do tabulek (b, c, d). Používají se k výpočtu log P_o/v aromatických molekul nebo substruktur.
Rekkerova metoda
Podle Rekkera (g) se hodnota log P_o/v vypočte takto:
$\log P_{O/V}=\sum _i{a}_i{f}_i+\sum _j\text{interakční člen}$
kde f_i představuje konstanty různých molekulárních fragmentů a a_i četnost jejich výskytu ve vyšetřované molekule. Korekční členy je možné vyjádřit jako souhrnný násobek jediné konstanty C_m (tzv. „magické konstanty“). Konstanty pro molekulární fragmenty f_i a C_m byly stanoveny ze seznamu 1 054 experimentálních hodnot P_o/v (pro 825 sloučenin) pomocí vícenásobné regresní analýzy (c, h). Interakční členy se určí podle stanovených pravidel popsaných v literatuře (e, h, i).
Hanschova-Leova metoda
Podle Hansche a Lea (c) se hodnota log P_o/v vypočte z výrazu:
$\log P_{O/V}=\sum _i{a}_i{f}_i+\sum _j{b}_j{F}_j$
kde f_i představuje konstanty různých molekulárních fragmentů, F_j korekční členy a a_i, b_j odpovídající četnosti výskytů. Na základě experimentálních hodnot P_o/v byl pokusně sestaven seznam hodnot pro atomové a skupinové fragmenty a seznam korekčních členů F_j (tzv. „faktorů“). Korekční členy byly setříděny do několika různých tříd (a, c). Zohlednění všech pravidel a korekčních členů je poměrně složité a časově náročné. Byly vyvinuty sady softwaru (b).
Kombinovaná metoda
Výpočet log P_o/v složitých molekul lze značně zdokonalit, jestliže se molekula rozdělí do větších podstruktur, pro něž existují spolehlivé hodnoty pocházející buď z tabulek (b, c), nebo z vlastních měření. Tyto fragmenty (např. heterocykly, antrachinon, azobenzen) lze poté kombinovat s Hanschovými π-hodnotami nebo s Rekkerovými nebo Leovými konstantami pro fragmenty.
Poznámky
i) Výpočetní metody lze použít pro částečně nebo úplně disociované sloučeniny pouze tehdy, lze-li vzít v úvahu nezbytné korekční faktory.
ii) Pokud lze předpokládat přítomnost intramolekulárních vodíkových vazeb, je nutné přičíst odpovídající korekční členy (přibližně 0,6 až 1,0 logaritmu P_o/v) (a). O přítomnosti těchto vazeb lze usuzovat z prostorových modelů nebo ze spektroskopických dat molekuly.
iii) Může-li existovat několik tautomerních forem, měla by být jako základ pro výpočet použita nejpravděpodobnější forma.
iv) Pečlivě by měly být sledovány přepracované seznamy konstant fragmentů.
Protokol o zkoušce
Při použití výpočtové metody nebo metody odhadu by měl protokol o zkoušce pokud možno obsahovat následující údaje:
— popis látky (směs, nečistoty atd.),
— známky přítomnosti intramolekulárních vodíkových vazeb, disociace, nábojů a dalších neobvyklých efektů (např. tautomerie),
— popis výpočtové metody,
— označení nebo uvedení databáze,
— zvláštnosti při volbě fragmentů,
— vyčerpávající dokumentaci výpočtů.
LITERATURA
DODATEK 2
Doporučené referenční látky pro metodu HPLC

Číslo	Referenční látka	log Po/v	pKa
1	butan-2-on	0,3
2	4-acetylpyridin	0,5
3	anilin	0,9
4	acetanilid	1,0
5	benzylalkohol	1,1
6	4-methoxyfenol	1,3	pKa = 10,26
7	kyselina fenoxyoctová	1,4	pKa = 3,12
8	fenol	1,5	pKa = 9,92
9	2,4-dinitrofenol	1,5	pKa = 3,96
10	benzonitril	1,6
11	fenylacetonitril	1,6
12	4-methylbenzylalkohol	1,6
13	acetofenon	1,7
14	2-nitrofenol	1,8	pKa = 7,17
15	kyselina 3-nitrobenzoová	1,8	pKa = 3,47
16	4-chloranilin	1,8	pKa = 4,15
17	nitrobenzen	1,9
18	3-fenylpropan-2-ol	1,9
19	kyselina benzoová	1,9	pKa = 4,19
20	p-kresol	1,9	pKa= 10,17
21	kyselina skořicová	2,1	pKa = 3,89 cis 4,44 trans
22	anisol	2,1
23	methyl-benzoát	2,1
24	benzen	2,1
25	kyselina 3-methylbenzoová	2,4	pKa = 4,27
26	4-chlorfenol	2,4	pKa = 9,1
27	trichlorethylen	2,4
28	atrazin	2,6
29	ethyl-benzoát	2,6
30	2,6-dichlorbenzonitril	2,6
31	kyselina 3-chlorbenzoová	2,7	pKa = 3,82
32	toluen	2,7
33	naftalen-1-ol	2,7	pKa = 9,34
34	2,3-dichloranilin	2,8
35	chlorbenzen	2,8
36	allylfenylether	2,9
37	brombenzen	3,0
38	ethylbenzen	3,2
39	benzofenon	3,2
40	4-fenylfenol	3,2	pKa = 9,54
41	thymol	3,3
42	1,4-dichlorbenzen	3,4
43	difenylamin	3,4	pKa = 0,79
44	naftalen	3,6
45	fenyl-benzoát	3,6
46	isopropylbenzen	3,7
47	2,4,6-trichlorfenol	3,7	pKa = 6
48	bifenyl	4,0
49	benzyl-benzoát	4,0
50	2,4-dinitro-6-sek-butylfenol	4,1
51	1,2,4-trichlorbenzen	4,2
52	kyselina dodekanová	4,2
53	difenylether	4,2
54	n-butylbenzen	4,5
55	fenanthren	4,5
56	fluoranthen	4,7
57	dibenzyl	4,8
58	2,6-difenylpyridin	4,9
59	trifenylamin	5,7
60	DDT	6,2
Jiné referenční látky s nízkou hodnotou log Po/v
1	kyselina nikotinová	-0,07

(a) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). Handbook of Chemical Property Estimation Methods. McGraw-Hill, New York, 1983.

(b) Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3). Pomona College. Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA.

(c) C. Hansch, A. J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Wiley, New York, 1979.

(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins. Chem. Rev. 1971, 71, 525

(e) R. F. Rekker, H. M. de Kort. Eur. S. Med. Chem. – Chim. Ther. 1979, 14, 479.

(f) T. Fujita, J. Iwasa, C. Hansch. J. Amer. Chem. Soc., 1964, 86, 5175.

(g) R. F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library. Elsevier, New York, 1977, 1.

(h) C. V. Eadsforth, P. Moser. Chemosphere, 1983, 12, 1459.

(i) R. A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, 225.

VII.1. METODA
Popsaná metoda „třepací lahve“ je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1).

VII.1.1 ÚVOD
Před provedením této zkoušky je vhodné mít k dispozici předběžné informace o strukturním vzorci látky, disociační konstantě, rozpustnosti ve vodě, hydrolýze, rozpustnosti v n-oktanolu (oktan-1-olu) a o povrchovém napětí.
U disociujících látek by měla být měření prováděna pouze s nedisociovanou formou (volná kyselina nebo volná báze), získanou při použití vhodného pufru o pH nejméně o 1 nižším (volná kyselina) nebo vyšším (volná báze) než pK.
Tato zkušební metoda zahrnuje dva samostatné postupy: metodu třepací lahve a vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC). První metodu lze použít, leží-li hodnota log P_o/v (definice viz níže) v rozmezí -2 až 4, a druhou metodu, leží-li hodnota log P_o/v v rozmezí 0 až 6. Před provedením kteréhokoli z experimentálních postupů by měl být nejdříve získán předběžný odhad rozdělovacího koeficientu.
Metoda třepací lahve je použitelná pouze pro v podstatě čisté látky, které jsou rozpustné ve vodě a n-oktanolu. Nelze ji použít pro povrchově aktivní látky (pro které by měly být uvedeny hodnota získaná výpočtem nebo odhad založený na příslušných rozpustnostech v n-oktanolu a vodě).
Metoda HPLC není použitelná pro silné kyseliny a zásady, komplexní sloučeniny kovů, povrchově aktivní látky a látky, které reagují s eluentem. Pro tyto látky by měly být uvedeny hodnota získaná výpočtem nebo odhad založený na individuálních rozpustnostech v n-oktanolu a vodě.
Metoda HPLC je méně citlivá na přítomnost nečistot ve zkušební látce než metoda třepací lahve. Někdy však mohou nečistoty ztížit interpretaci výsledků, protože přiřazení píků se stává nejistým. U směsí, které dávají nerozlišitelný pás, by měly být uvedeny spodní a horní mez hodnoty log P.

VII.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Rozdělovací koeficient (P) je definován jako poměr rovnovážných koncentrací (c_i) rozpuštěné látky ve dvoufázovém systému tvořeném dvěma prakticky nemísitelnými rozpouštědly. V případě n-oktanolu a vody platí:
$P_{0/V}=\frac{c_{oktan-1-ol}}{c_{voda}}$
Rozdělovací koeficient (P) je tedy podílem dvou koncentrací a udává se obvykle ve formě svého dekadického logaritmu (log P).

VII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Metoda třepací lahve
Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provádění metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.
Metoda HPLC
Za účelem korelace hodnot naměřených pro danou sloučeninu metodou HPLC s její hodnotou P je nutné sestrojit kalibrační graf závislosti log P na chromatografických datech tvořený nejméně šesti referenčními body. Vhodné referenční látky zvolí uživatel. Pokud je to možné, měla by mít alespoň jedna referenční látka P_o/v vyšší než zkušební látka a jiná referenční látka P_o/v nižší než zkušební látka. U hodnot log P nižších než 4 může být kalibrace založena na údajích získaných metodou třepací lahve. U hodnot log P vyšších než 4 může být kalibrace založena na ověřených hodnotách z literatury, pokud jsou v souladu s vypočtenými hodnotami. Za účelem dosažení vyšší přesnosti je vhodnější volit látky, které mají podobnou strukturu jako zkušební látka.
Rozsáhlé seznamy hodnot P_o/v pro mnoho skupin chemických látek jsou dostupné v literatuře (2, 3). Nejsou-li k dispozici údaje o rozdělovacích koeficientech látek s podobnou strukturou, lze použít obecnější kalibraci s jinými referenčními látkami.
Seznam doporučených referenčních látek a jejich hodnot P_o/v je uveden v doplňku 2.

VII.1.4 PODSTATA METOD

VII.1.4.1 Metoda třepací lahve
Pro stanovení rozdělovacího koeficientu musí být dosaženo rovnováhy mezi všemi vzájemně působícími složkami systému a musí být stanoveny koncentrace látek rozpuštěných v obou fázích. Ze studia literatury vztahující se k této otázce vyplývá, že k řešení tohoto problému lze použít několik různých postupů, např. důkladné promíchání obou fází a jejich následné oddělení za účelem stanovení rovnovážných koncentraci vyšetřované látky.

VII.1.4.2 Metoda HPLC
HPLC se provádí na analytických kolonách plněných komerčně dostupnou pevnou fází obsahující dlouhé uhlovodíkové řetězce (např. C₈, C₁₈) chemicky vázané na oxid křemičitý. Chemické látky nastříknuté do této kolony se v ní pohybují různou rychlostí v důsledku různých stupňů rozdělení mezi mobilní fázi a uhlovodíkovou stacionární fázi. Směsi chemikálií se eluují v pořadí své hydrofobnosti, přičemž se látky rozpustné ve vodě eluují jako první a látky rozpustné v olejích jako poslední, úměrně svému rozdělovacímu koeficientu uhlovodíky-voda. To umožňuje určit vztah mezi retenčním časem v této koloně (s reversními fázemi) a rozdělovacím koeficientem n-oktan/voda. Rozdělovací koeficient se odvodí z kapacitního faktoru k, daného výrazem:
$k=\frac{t_R-t_o}{t_o}$
v němž t_R = retenční čas zkušební látky, t_o = průměrná doba, kterou molekula rozpouštědla potřebuje k průchodu kolonou (mrtvá doba).
Kvantitativní analytické metody nejsou zapotřebí, nezbytné je pouze stanovení elučních dob.

VII.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

VII.1.5.1 Opakovatelnost
Metoda třepací lahve
S cílem zaručit správnost hodnoty rozdělovacího koeficientu se provedou opakovaná stanovení při třech různých zkušebních podmínkách, přičemž lze měnit jak množství dané látky, tak poměr objemů obou rozpouštědel. Dekadické logaritmy stanovených hodnot rozdělovacího koeficientu by měly ležet v rozmezí ±0,3.
Metoda HPLC
S cílem zvýšit důvěryhodnost měření musí být provedena opakovaná stanovení. Hodnoty log P získané z jednotlivých měření by měly ležet v rozmezí ±0,1.

VII.1.5.2 Citlivost
Metoda třepací lahve
Měřicí rozsah metody je určen mezí detekce analytické metody. Ta by měla umožnit stanovení hodnot log P_o/v v oblasti od -2 do 4 (pokud to podmínky dovolí, lze tuto oblast rozšířit až do hodnoty log P_o/v rovné 5), není-li koncentrace rozpuštěné látky v žádné z fází vyšší než 0,01 mol·l^–1.
Metoda HPLC
Metoda HPLC umožňuje stanovení rozdělovacích koeficientů v rozsahu log P_o/v od 0 do 6.
Obvykle je možné určit rozdělovací koeficient dané látky s přesností ±1 řádu vzhledem k hodnotě získané metodou třepací lahve. Typické korelace lze nalézt v literatuře (4, 5, 6, 7, 8). Vyšší přesnosti lze obvykle dosáhnout, je-li korelační závislost založena na referenčních látkách podobné struktury (9).

VII.1.5.3 Specifičnost
Metoda třepací lahve
Nernstův rozdělovací zákon platí pro zředěné roztoky jen při konstantní teplotě a konstantním tlaku a pH. Platí pouze pro čistou látku rozdělenou mezi dvě čistá rozpouštědla. Je-li současně v jedné nebo obou fázích přítomno více rozpuštěných látek, může tím být výsledek ovlivněn.
Disociace nebo asociace rozpuštěných molekul vede k odchylkám od Nernstova rozdělovacího zákona. Tyto odchylky se projevují tím, že se rozdělovací koeficient stává závislým na koncentraci roztoku.
V důsledku existujících mnohonásobných rozdělovacích rovnováh by tato metoda neměla být použita bez korekcí na disociovatelné sloučeniny. Pro tyto sloučeniny by mělo být zváženo použití pufračních roztoků namísto vody; pH pufračního roztoku by se mělo lišit od pK_a látky nejméně o 1, přičemž se zohlední význam tohoto pH s ohledem na životní prostředí.

VII.1.6 POPIS METODY

VII.1.6.1 Předběžný odhad rozdělovacího koeficientu
Hodnotu rozdělovacího koeficientu lze nejlépe odhadnout na základě výpočtu (viz doplněk 1) nebo popřípadě z poměru rozpustností zkušební látky v čistých rozpouštědlech (10).

VII.1.6.2 Metoda třepací lahve

VII.1.6.2.1 Příprava
n-Oktanol: Stanovení rozdělovacího koeficientu by mělo být provedeno s n-oktanolem (oktan-1-olem) čistoty p.a.
Voda: měla by být použita destilovaná voda nebo redestilovaná voda ve skleněné nebo křemenné aparatuře. V případě potřeby by měly být u disociovatelných látek použity místo vody pufrační roztoky.
Poznámka:
Neměla by být použita voda pocházející přímo z měniče iontů.

VII.1.6.2.1.1 Předběžné nasycení rozpouštědel
Před stanovením rozdělovacího koeficientu se fáze rozpouštědlového systému vzájemně nasytí třepáním při teplotě experimentu. K dosažení tohoto cíle je vhodné 24 h třepat na mechanické třepačce ve dvou velkých zásobních lahvích vysoce čistý n-oktanol nebo vysoce čistou vodu, obojí s dostatečným množstvím druhého rozpouštědla, a poté nechat rozpouštědla stát tak dlouho, dokud se obě fáze neoddělí a dokud není dosaženo nasycení.

VII.1.6.2.1.2 Příprava zkoušky
Celkový objem dvoufázového systému by měl téměř naplňovat zkušební nádobu. Tím se zamezí ztrátám látek v důsledku odpařování. Poměry objemů a množství látek, které mají být použity, jsou dány
— předběžným odhadem rozdělovacího koeficientu (viz výše),
— minimálním množstvím zkušební látky nezbytným pro postup analýzy, a
— omezením maximální koncentrace v každé fázi na 0,01 mol·l^–1.
Provedou se tři zkoušky. Při první se použije vypočtený poměr objemů n-oktanolu a vody; při druhé se tento poměr dělí dvěma a při třetí se tento poměr násobí dvěma (např. 1 : 1, 1 : 2, 2 : 1).

VII.1.6.2.1.3 Zkušební látka
Připraví se zásobní roztok v n-oktanolu předem nasyceném vodou. Koncentrace tohoto zásobního roztoku by měla být před jeho použitím ke stanovení rozdělovacího koeficientu přesně stanovena. Tento roztok by měl být uchováván za podmínek, které zajistí jeho stálost.

VII.1.6.2.2 Zkušební podmínky
Zkušební teplota by měla být konstantní (±1 °C) a měla by ležet v rozmezí 20 a 25°C.

VII.1.6.2.3 Postup měření

VII.1.6.2.3.1 Ustavení rovnováhy rozdělení
Pro každou ze zkušebních podmínek by měly být připraveny dvě zkušební nádoby obsahující potřebná přesně odměřená množství obou rozpouštědel spolu s nezbytným množstvím zásobního roztoku.
Fáze n-oktanolu je nutné odměřit objemově. Zkušební nádoby by měly být umístěny do vhodné třepačky, nebo by měly být třepány ručně. Při použití centrifugační kyvety spočívá doporučený postup v tom, že se kyveta rychle otáčí kolem své příčné osy o 180°, takže případný zachycený vzduch stoupá vzhůru oběma fázemi. Ze zkušenosti vyplývá, že k ustavení rovnovážného rozdělení obvykle stačí 50 takových otočení. Pro jistotu se doporučuje 100 otočení během pěti minut.

VII.1.6.2.3.2 Oddělení fází
V případě potřeby lze oddělení fází provést odstředěním směsi. Odstředění by mělo být provedeno laboratorní odstředivkou udržovanou při laboratorní teplotě, nebo, je-li použita odstředivka bez regulace teploty, by měly být centrifugační kyvety za účelem ustavení rovnováhy udržovány alespoň jednu hodinu před analýzou při zkušební teplotě.

VII.1.6.2.4 Analýza
Za účelem stanovení rozdělovacího koeficientu je nutné stanovit koncentrace zkušební látky v obou fázích. To lze provést odebráním alikvotního podílu každé z obou fází z každé kyvety a pro každou zkušební podmínku a jejich analýzou zvoleným postupem. Celkové množství látky přítomné v obou fázích by mělo být vypočteno a porovnáno s původně dodaným množstvím látky.
Odběr vzorku z vodné fáze je nutné provést postupem minimalizujícím riziko znečištění stopami n-oktanolu: k odběru vzorků vodné fáze lze použít skleněnou injekční stříkačku s vyměnitelnou jehlou. Stříkačka se nejprve částečně naplní vzduchem. Vzduch se při průchodu jehly vrstvou n-oktanolu opatrně vypudí. Do stříkačky se natáhne dostatečný objem vodné fáze. Stříkačka se z roztoku rychle vytáhne a jehla se sejme. Obsah stříkačky lze poté použít jako vzorek vodné fáze. Koncentrace v obou od sebe oddělených fázích by měla být stanovena nejlépe metodou, která je specifická pro danou látku. Příklady možných vhodných analytických metod jsou
— fotometrické metody,
— plynová chromatografie,
— vysokoúčinná kapalinová chromatografie.

VII.1.6.3 Metoda HPLC

VII.1.6.3.1 Příprava
Aparatura
Nezbytným vybavením je kapalinový chromatograf vybavený bezpulzním čerpadlem a vhodným detekčním zařízením. Doporučuje se používat nástřikový ventil se vstřikovacími smyčkami. Přítomnost polárních skupin ve stacionární fázi může závažně zhoršit účinnost kolony HPLC. Stacionární fáze by proto měla mít minimální podíl polárních skupin (11). Lze použít komerční mikročásticové náplně s reversními fázemi nebo hotové kolony s náplní. Mezi nástřikem a analytickou kolonou může být umístěna ochranná předkolona.
Mobilní fáze
K přípravě elučního rozpouštědla se použije methanol čistoty pro HPLC a voda čistoty pro HPLC, které se před použitím odplyní. Měla by být provedena isokratická eluce. Doporučuje se použít směsi methanol/voda s minimálním obsahem vody 25 %. Obvykle vyhovuje pro eluci sloučenin o log P = 6 během jedné hodiny při průtokové rychlosti 1 ml·min^-1 směs methanol / voda 3 : 1 (obj.). U sloučenin s vysokou hodnotou log P může být nutné zkrátit eluční dobu (stejně tak u referenčních látek) snížením polarity mobilní fáze nebo délky kolony.
Látky s velmi nízkou rozpustností v n-oktanolu mají tendenci při použití metody HPLC vykazovat abnormálně nízké hodnoty log P_o/v; píky těchto sloučenin někdy doprovázejí čelo rozpouštědla. Je to pravděpodobně způsobeno tím, že proces rozdělení je příliš pomalý, než aby bylo dosaženo rovnováhy za dobu, po kterou obvykle trvá dělení metodou HPLC. Pro dosažení spolehlivé hodnoty může být v takovém případě účinné snížení průtokové rychlosti nebo snížení poměru methanol/voda.
Zkušební i referenční látka by měly být rozpustné v mobilní fázi v dostatečných koncentracích umožňujících jejich detekci. Pouze ve výjimečných případech mohou být u směsi methanol/voda použita aditiva, neboť aditiva mění vlastnosti kolony. V případě chromatogramů získaných při použití aditiv, musí být použita samostatná kolona téhož typu. Nevyhovuje-li směs methanol-voda, lze použít směsi jiných organických rozpouštědel s vodou, např. ethanol-voda nebo acetonitril-voda.
Pro disociovatelné látky je kritické pH eluentu. Mělo by ležet v pracovní oblasti pH kolony, která je obvykle 2 až 8. Doporučuje se použití pufračních roztoků. Je nezbytné dbát na to, aby nedošlo ke srážení solí a narušení kolony, ke kterému dochází u některých směsí organické fáze s pufračním roztokem. Měření pomocí HPLC se stacionárními fázemi na bázi oxidu křemičitého při pH vyšším než 8 se nedoporučuje, neboť použití alkalické mobilní fáze může způsobit rychlé narušení činnosti kolony.
Rozpouštěné látky
Referenční látky by měly mít nejvyšší dostupnou čistotu. Sloučeniny, které se mají používat pro zkoušení nebo kalibraci, se pokud možno rozpustí v mobilní fázi.
Zkušební podmínky
Teplota by během měření neměla kolísat o více než ±2 K.

VII.1.6.3.2 Měření
Výpočet mrtvé doby t₀
Mrtvou dobu t₀ je možné stanovit buď pomocí homologické řady (např. n-alkylmethylketonů) nebo nezadržovaných organických sloučenin (např. thiomočoviny nebo formamidu). Pro výpočet mrtvé doby t₀ s použitím homologické řady se nastříkne sada alespoň sedmi členů homologické řady a stanoví se příslušné retenční časy. Neupravené retenční časy t_r(n_c+1)se vynesou jako funkce t_r(n_c) a stanoví se absolutní člen a a směrnice b regresní rovnice:
$t_{r(n_c+1)}=a+b{t}_{r\left(n_c\right)}$
(n_c = počet atomů uhlíku). Mrtvá doba t₀ je dána vztahem:
$t_0=a/1-b$
Kalibrační křivka
Následujícím krokem je sestrojení korelační závislosti hodnot log k na log P pro příslušné referenční látky. V praxi se současně nastříkne soubor 5 až 10 standardních referenčních látek, jejichž log P leží v očekávané oblasti, a stanoví se retenční časy, nejlépe zapisovacím integrátorem napojeným na detekční systém. Vypočtou se příslušné logaritmy kapacitních faktorů, log k, a vynesou se jako funkce hodnot log P stanovených metodou třepací lahve. Kalibrace se provádí v pravidelných intervalech nejméně jednou denně, aby bylo možné zohlednit případné změny činnosti kolony.
Stanovení kapacitního faktoru zkušební látky
Zkušební látka se nastříkne v co nejmenším množství mobilní fáze. Stanoví se retenční čas (dvakrát), umožňující výpočet kapacitního faktoru k. Z korelační křivky referenčních látek je možné interpolací získat rozdělovací koeficient zkušební látky. U velmi nízkých a velmi vysokých rozdělovacích koeficientů je nutná extrapolace. V těchto případech je nutno věnovat zvláštní pozornost intervalům spolehlivosti regresní křivky.

VII.2 DATA
Metoda třepací lahve
Spolehlivost stanovených hodnot P je možné prověřit srovnáním středních hodnot z opakovaných stanovení s celkovou střední hodnotou.

VII.3 ZPRÁVY
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
— přesnou specifikaci látky (identitu a nečistoty),
— nejsou-li metody použitelné (např. u povrchově aktivní látky), měla by být uvedena vypočtená hodnota nebo odhad založený na individuálních rozpustnostech látky v n-oktanolu a vodě,
— všechny informace a poznámky, které mají význam pro interpretaci výsledků, zvláště s ohledem na nečistoty a fyzikální stav látky.
Pro metodu třepací lahve:
— výsledek předběžného odhadu, pokud existuje,
— teplotu stanovení,
— údaje o analytických postupech použitých ke stanovení koncentrací,
— dobu a rychlost odstřeďování, pokud se použilo,
— koncentrace naměřené při každém stanovení v obou fázích (tzn. uvede se celkem 12 koncentrací),
— hmotnost zkušební látky, objem každé fáze použité v každé zkušební nádobě a vypočtené celkové množství zkušební látky, obsažené v jednotlivých fázích po dosažení rovnováhy,
— vypočtené hodnoty rozdělovacího koeficientu (P) a střední hodnotu je nutné uvést pro každý soubor zkušebních podmínek, stejně tak střední hodnotu ze všech stanovení. Pokud existují náznaky závislosti rozdělovacího koeficientu na koncentraci, mělo by to být uvedeno ve zprávě,
— měla by být uvedena směrodatná odchylka jednotlivých hodnot P od střední hodnoty,
— měl by být také uveden dekadický logaritmus střední hodnoty P ze všech stanovení,
— vypočtená teoretická hodnota P_o/v, byla-li stanovena nebo je-li naměřená hodnota > 10⁴,
— pH použité vody a vodné fáze během experimentu,
— pokud byly použity pufry, zdůvodnění jejich použití místo vody, jejich složení, koncentrace a pH, pH vodné fáze před a po experimentu.
Pro metodu HPLC:
— výsledek předběžného odhadu, pokud existuje,
— zkušební látka a referenční látky, jejich čistota,
— teplotní rozmezí při stanoveních,
— pH, při kterém se prováděla stanovení,
— podrobnosti o analytické a ochranné koloně, o mobilní fázi a o způsobu detekce,
— retenční data a hodnoty log P z literatury pro referenční látky použité ke kalibraci,
— podrobnosti o proložené regresní přímce (log k versus log P),
— průměrná retenční data a interpolovaná hodnota log P pro zkušební sloučeninu,
— popis zařízení a pracovních podmínek,
— eluční křivky,
— množství zkušební látky a referenčních látek zavedených do kolony,
— mrtvý čas a způsob jeho měření.

VII.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107. Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) C. Hansch, A. J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Wiley, New York, 1979.

(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A. J. Leo, dir.): Dostupné: Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.

(4) L. Renberg, G. Sundstrӧm, K. Sundh-Nygärd. Chemosphere, 1980, 80, 683.

(5) H. Ellgehausen, C. D' Hondt, R. Fuerer. Pestic. Sci., 1981, 12, 219 (1981).

(6) B. McDuffie. Chemosphere, 1981, vol 10, 73.

(7) W. E. Hammers et al., J. Chromatogr. 1982, 247, 1.

(8) J. E. Haky, A. M. Young. J. Liq. Chromat., 1984, 7. 675.

(9) S. Fujisawa, E. Masuhara. J. Biomed. Mat. Res., 1981, 15, 787.

(10) O. Jubermann. Verteilen und Extrahieren. V: Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumspraxis (ed. E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339.

(11) R. F. Rekker, H. M. de Kort. Euro. J. Med. Chem. 1979, vol 14, 479.

(12) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins. Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, 71, 525.

(13) R. F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant. Elsevier, Amsterdam, 1977.

(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method.

(15) C. V. Eadsforth, P. Moser. Chemosphere, 1983, 12, 1459.

(16) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins. Chem. Rev., 1971, 71, 525.

(17) C. Hansch, A. Leo, S. H. Unger, K. H. Kim, D. Nikaitani, E. J. Lien, J. Med Chem. 1973, 16, 1207.

(18) W. B. Neely, D. R. Branson, G. E. Blau. Environ. Sci. Technol. 1974, 8, 1113.

(19) D. S. Brown, E. W. Flagg. J. Environ. Qual. 1981, 10, 382.

(20) J. K. Seydel, K. J. Schaper. Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen. Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979.

(21) R. Franke. Theoretical Drug Design Methods. Elsevier, Amsterdam 1984.

(22) Y. C. Martin. Quantitative Drug Design. Marcel Dekker, New York, Basel 1978.

(23) N. S. Nirrlees, S. J. Noulton, C. T. Murphy, P. J. Taylor. J. Med. Chem. 1976, 19, 615.