I. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ TOXICITY PRO RYBY – metoda C.1 podle přílohy směrnice Komise 92/69/EHS ze dne 31. července 1992, kterou se po sedmnácté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování správních a právních púředpúsů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (dále jen „směrnice 92/69/EHS“)
DODATEK 1
Upravená voda
Příklad vhodné ředicí vody
Všechny chemikálie musí být čistoty p.a.
Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 μS·cm–1.
Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.
Zásobní roztoky:
| CaCl2·2H2O (chlorid vápenatý dihydrát) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr. | 11,76 g |
| MgSO4·7H2O (síran hořečnatý heptahydrát) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr. | 4,93 g |
| NaHCO3 (hydrogenuhličitan sodný) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr. | 2,59 g |
| KCl (chlorid draselný) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr. | 0,23 g |
Upravená ředicí voda
Smísí se po 25 ml všech čtyř zásobních roztoků a doplní vodou na 1 litr.
Provzdušňuje se, dokud koncentrace rozpuštěného kyslíku neodpovídá koncentraci nasycení vzdušným kyslíkem.
pH musí být 7,8 ± 0,2.
Podle potřeby se pH upraví pomocí NaOH (hydroxid sodný) nebo HCl (kyselina chlorovodíková).
Tato ředicí voda se nechá 12 h stát a nesmí být dále provzdušňována.
Koncentrace úhrnu iontů Ca a Mg v tomto roztoku je 2,5 mmol·l–1. Poměr množství iontů Ca : Mg je 4 : 1 a poměr množství iontů Na : K je 10 : 1. Celková koncentrace alkalických kovů v tomto roztoku je 0,8 mmol·l–1.
Jakákoli odchylka v přípravě vody k ředění nesmí změnit složení ani vlastnosti vody.
DODATEK 2
Druhy ryb doporučené pro zkoušení
| Doporučený druh | Doporučený rozsah teplot při zkoušce (°C) | Doporučená celková délka ryb (cm) |
|---|---|---|
| Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton - Buchanan), danio pruhované | 20 až 24 | 3,0 ± 0,5 |
| Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque), střevle | 20 až 24 | 5,0 ± 2,0 |
| Cyprinus carpio (Teleostei Cyprinidae) (Linneanus 1758), kapr obecný | 20 až 24 | 6,0 ± 2,0 |
| Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Tomminck a Schlegel 1850), halančík japonský | 20 až 24 | 3,0 ± 1,0 |
| Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters 1859), živorodka duhová | 20 až 24 | 3,0 ± 1,0 |
| Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque, Linneanus 1758), slunečnice modrá | 20 až 24 | 5,0 ± 2,0 |
| Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum 1988), pstruh duhový | 12 až 17 | 6,0 ± 2,0 |
| Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae) (Linneanus 1758), jelec jesen | 20 až 24 | 6,0 ± 2,0 |
Opatřování ryb
Ryby uvedené v seznamu se snadno chovají nebo jsou dobře dostupné po celý rok. Lze je množit a chovat buď v rybích farmách, nebo v laboratoři za kontrolovaných zdravotních a parazitologických podmínek tak, aby ryby byly zdravé a byly známého původu. Tyto ryby jsou dostupné v mnoha částech světa.
DODATEK 3
Příklad křivky závislosti úmrtnosti, vyjádřené v procentech, na koncentraci
Příklad stanovení LC50 na pravděpodobnostním logaritmickém papíru
I. 1. METODA
I.1.1 ÚVOD
Účelem této zkoušky je stanovit akutní letální toxicitu látek pro sladkovodní ryby. Pro usnadnění výběru nejvhodnější zkušební metody (statické, semistatické nebo průtokové) s cílem zajistit dostatečně konstantní koncentrace zkušební látky po celou dobu experimentu je žádoucí mít pokud možno k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě, disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.
Další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, povaha a podíl významných nečistot v procentech, přítomnost a množství přísad a rozdělovací koeficient n-oktanol/voda) je třeba vzít v úvahu při plánování zkoušky i při interpretaci výsledků.
I.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Akutní toxicitou se rozumí zřetelný nepříznivý účinek, který je v krátké době (řádově ve dnech) v organismu vyvolán expozicí látce. V této zkoušce se akutní toxicita vyjadřuje prostřednictvím střední letální koncentrace (LC50), tj. takové koncentrace látky ve vodě, která během nepřetržité expozice po určitou dobu způsobí úhyn 50 % jedinců ve zkušební skupině ryb.
Všechny koncentrace zkušební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l-1). Mohou se také vyjádřit v hmotnostních podílech (mg·kg-1).
I.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Zkoušky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, že se reakce zkušebních druhů za laboratorních zkušebních podmínek podstatně nezměnila.
Referenční látky nejsou pro tuto zkoušku stanoveny.
I.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1, s cílem prokázat, že LC50 je vyšší než tato koncentrace.
Ryby se vystaví účinku různým koncentracím zkušební látky přidané do vody po dobu 96 h. Úhyn se zaznamenává nejméně každých 24 h a je-li to možné, vypočtou se při každém pozorování koncentrace, které způsobí úhyn 50 % ryb (LC50).
I.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI
Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na úplný zkušební postup.
Mortalita v kontrolních skupinách nesmí být na konci zkoušky větší než 10 % (nebo jednu rybu, pokud se použije méně než deset ryb).
Koncentrace rozpuštěného kyslíku musí být po celou dobu zkoušky vyšší než 60 % hodnoty nasycení vzduchem.
Koncentrace zkušební látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 80 % původních hodnot koncentrací.
U látek, které se ve zkušebním médiu lehce rozpouštějí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míře netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze počáteční koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, že byly koncentrace po celou zkoušku udrženy a že kritéria jakosti byla dodržena.
U látek, které
i) jsou ve zkušebním médiu špatně rozpustné, nebo
ii) mohou vytvářet stabilní emulze nebo disperse, nebo
iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní,
musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení, avšak před nasazením testovacích ryb.
Ve všech uvedených případech musí být během zkoušky provedena další měření s cílem potvrdit skutečné expoziční koncentrace nebo dodržení kritérií jakosti.
pH by se nemá změnit o více než 1.
I.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
Mohou být použity tři postupy:
Statická zkouška:
Zkouška, při níž zkušební roztok neprotéká. (Roztoky se během celé zkoušky nemění.)
Semistatická metoda:
Zkouška, při níž zkušební roztok neprotéká, ale je pravidelně po delších časových úsecích (např. po 24 h) zcela vyměňován.
Průtoková metoda:
Zkouška toxicity, při níž se voda ve zkušebních nádržích neustále obměňuje, přičemž se zkušební látka přivádí s vodou, kterou se zkušební médium obnovuje.
I.1.6.1 Činidla
I.1.6.1.1 Roztoky zkušebních látek
Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2.
Zvolené zkušební koncentrace se připraví ředěním zásobního roztoku. Jsou-li zkoušeny vysoké koncentrace látky, lze látku rozpustit přímo v ředicí vodě.
Látky se obvykle zkouší až do meze jejich rozpustnosti. U některých látek (např. u látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokou hodnotou Po/v, nebo u látek, které ve vodě vytvářejí spíše stabilní disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajištěno, že je dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody atd.).
Pro přípravu zásobních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo pro usnadnění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouštědla či emulgátory nebo dispergátory. Použijí-li se takové pomocné látky, měly by všechny zkušební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích by měly být exponovány další kontrolní ryby. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla překročit 100 mg na l zkušebního média.
Zkouška se provede bez úpravy pH. Existují-li známky toho, že dochází k výrazné změně pH, doporučuje se zkoušku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém případě se upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ředění, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Při úpravě pH se dává přednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkušební látky v zásobním roztoku v podstatné míře změněna. Dojde-li úpravou ve zkušebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skutečnosti se zaznamenají.
I.1.6.1.2 Voda pro chov ryb a ředění
Může být použita pitná voda (nekontaminovaná potenciálně škodlivými koncentracemi chloru, těžkých kovů nebo jiných látek), kvalitní přírodní voda nebo upravená voda (viz doplněk 1). Upřednostňuje se voda o celkové tvrdosti od 10 do 250 mg·l-1 (vztaženo na CaCO3) a pH od 6,0 do 8,5.
I.1.6.2 Přístroje
Veškeré přístroje musí být vyrobeny z chemicky inertního materiálu:
— systém pro automatické ředění (pro průtokovou metodu),
— přístroj pro měření koncentrace kyslíku,
— vybavení pro stanovení tvrdosti vody,
— vhodný přístroj pro měření teploty,
— pH-metr.
I.1.6.3 Testovací ryby
Ryby by měly být zdravé a bez zjevných malformací.
Použitý druh by měl být zvolen podle praktických kritérií, jako je jejich dostupnost po celý rok, snadný chov, vhodnost pro zkoušení, relativní citlivost k chemickým látkám a jakékoli další významné ekonomické a biologické faktory. Při výběru druhu ryb by měla být také zohledněna potřeba srovnatelnosti získaných dat a mezinárodní harmonizace (1).
Seznam doporučených druhů ryb pro provedení této zkoušky je uveden v doplňku 2; dává se přednost druhům danio pruhované a pstruh duhový.
I.1.6.3.1 Chov
Ryby by měly pocházet pokud možno z jednoho chovu a měly by být stejné délky a stejného stáří. Ryby musí být chovány nejméně 12 dní v následujících podmínkách:
Obsádka:
Vhodná vzhledem k metodě (metoda s recirkulací nebo průtoková metoda) a druhu ryb.
Voda:
Viz 1.6.1.2.
Osvětlení:
Osvětlení 12 až 16 h denně.
Koncentrace rozpuštěného kyslíku:
Nejméně 80 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem.
Krmení:
Třikrát týdně nebo jednou za den; vysazení krmení 24 h před začátkem zkoušky.
I.1.6.3.2 Mortalita
Po 48hodinové aklimatizaci se zaznamená mortalita a použijí se následující kritéria:
— mortalita vyšší než 10 % populace za 7 dní: celá obsádka ryb se vyřadí,
— mortalita 5 až 10 % populace: v chovu se pokračuje dalších 7 dní. Nedojde-li k dalším případům úhynu, obsádka se použije, v opačném případě musí být vyřazena,
— mortalita menší než 5 % populace: obsádka je pro zkoušku použitelná.
I.1.6.4 Aklimatizace
Všechny ryby musí být nejméně na 7 dnů před použitím ve zkoušce nasazeny do vody stejné kvality a stejné teploty, jaká se použije při zkoušce.
I.1.6.5 Zkušební postup
Před vlastní zkouškou může být provedena předběžná zkouška s cílem získat informace o rozsahu koncentrací, které mají být použity v hlavní zkoušce.
Kromě sérií zkoušek se provede kontrolní zkouška bez zkušební látky a podle potřeby kontrolní zkouška s pomocnou látkou.
V závislosti na fyzikálních a chemických vlastnostech zkušební látky se zvolí statická, semistatická nebo průtoková zkouška, aby byla splněna kritéria jakosti.
Ryby se exponují zkušební látce za níže uvedených podmínek:
— délka expozice: 96 h;
— počet ryb: nejméně 7 na každou koncentraci;
— nádrže: vhodný objem vzhledem k doporučené obsádce;
— obsádka: pro statickou a semistatickou zkoušku se doporučuje 1,0 g na litr; v průtokovém systému je přijatelná vyšší obsádka;
— zkušební koncentrace: nejméně pět koncentrací, které jsou odstupňovány faktorem nepřevyšujícím 2,2 a které pokrývají rozsah mortality od 0 % do 100 %;
— voda: viz 1.6.1.2;
— osvětlení: osvětlení 12 až 16 h denně;
— teplota: podle druhu ryb (doplněk 2), avšak v rámci dané zkoušky kolísající v toleranci ±1 °C;
— koncentrace rozpuštěného kyslíku: ne nižší než 60 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem při dané teplotě;
— krmení: žádné.
Ryby se kontrolují po prvních 2 až 4 h a dále nejméně každých 24 h. Ryby se považují za mrtvé, jestliže při dotyku ocasní ploutve nedochází k žádné reakci a nejsou-li patrné žádné dýchací pohyby. Mrtvé ryby se odstraní, jakmile jsou zpozorovány, a úhyn se zaznamená.
Zaznamenají se všechny zjevné abnormality (např. ztráta rovnováhy, změny v plavání, chování, v dýchací funkci, v pigmentaci atd.).
Měření pH, obsahu rozpuštěného kyslíku a teploty se provádí denně.
Limitní zkouška
S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1 s cílem prokázat, že LC50 je vyšší než tato koncentrace.
Je-li povaha zkušební látky taková, že ve vodě nelze dosáhnout koncentrace 100 mg·l-1, provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).
Limitní zkouška se provede se 7 až 10 rybami a se stejným počtem ryb v kontrole (kontrolách). (Podle teorie binomického rozdělení je při použití 10 ryb a při nulové mortalitě 99,9% pravděpodobnost, že je LC50 větší než 100 mg·l-1. Při 7, 8 nebo 9 rybách znamená nulová mortalita nejméně 99% pravděpodobnost, že je LC50 větší než koncentrace použitá v limitní zkoušce.)
Dojde-li k úhynům, musí se provést celá studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky, zaznamenají se.
I.2 DATA A HODNOCENÍ
Na pravděpodobnostní logaritmický papír se pro každé období, kdy byla prováděna pozorování (24, 48, 72 a 96 h), vynese pro každou expoziční dobu mortalita v procentech proti koncentraci.
Pokud je to možné, odhadnou se standardními postupy pro každou délku expozice hodnoty LC50 a meze spolehlivosti (p = 0,05); tyto hodnoty se zaokrouhlí na jednu, nebo nejvýše na dvě platné číslice (příklad zaokrouhlení na dvě platné číslice: 173,5 se zaokrouhlí na 170, 0,127 na 0,13, 1,21 na 1,2).
V případech, kdy je sklon křivky závislosti mortality v procentech na koncentraci látky příliš strmý, aby umožnil výpočet hodnoty LC50, postačuje grafický odhad této hodnoty.
Jestliže dvě po sobě jdoucí koncentrace lišící se faktorem 2,2 vyvolají mortalitu 0 a 100 %, jsou dostatečnou informací o tom, že se LC50 nachází mezi těmito hodnotami.
Zjistí-li se, že není možné udržet stabilitu nebo homogenitu zkušební látky, uvede se to ve zprávě a výsledky se interpretují s opatrností.
I.3 ZPRÁVY
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
— údaje o testovacích rybách (vědecký název, kmen, dodavatel, veškerá předchozí ošetření, velikost a počet ryb použitých při každé zkušební koncentraci);
— zdroj ředicí vody a hlavní chemické charakteristiky (pH, tvrdost, teplota);
— u látek s malou rozpustností ve vodě údaj o metodě přípravy zásobních a zkušebních roztoků;
— koncentrace všech pomocných látek;
— přehled použitých koncentrací a veškeré dostupné informace o stabilitě zkušební látky ve zkušebním roztoku při použitých koncentracích;
— jestliže byly provedeny chemické analýzy, údaje o použitých metodách a získané výsledky;
— výsledek limitní zkoušky, pokud byla provedena;
— důvody pro volbu použitého zkušebního postupu a podrobnosti o něm (např. statický, semistatický, dávkování, průtoková rychlost, zda byla voda provzdušňována obsádka ryb atd.);
— popis zkušebního zařízení;
— světelný režim;
— koncentrace rozpuštěného kyslíku, hodnoty pH, teplota zkušebních roztoků každých 24 h;
— důkaz, že byla splněna kritéria jakosti;
— tabulka kumulativních hodnot mortality při každé koncentraci a při kontrolní zkoušce (a popřípadě při kontrolní zkoušce s pomocnou látkou) při každé z doporučených dob pozorování;
— graf křivky závislosti účinku, vyjádřeného v procentech, na koncentraci na konci zkoušky;
— podle možnosti hodnoty LC50 při každé z doporučených dob pozorování (při 95% intervalu spolehlivosti);
— použité statistické metody stanovení hodnot LC50;
— při použití referenční látky a údaj o získaných výsledcích;
— nejvyšší zkušební koncentrace, která nevyvolala za dobu zkoušky úhyn ryb;
— nejnižší zkušební koncentrace, která vyvolala za dobu zkoušky 100 % mortalitu.
I.4 LITERATURA
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.
(2) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio - Static and Flow Through methods – NFT 90-303, June 1985.
(3) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri – Static and Flow–Through methods – NFT 90-305, June 1985.
(4) ISO 7346/1, /2, /3 – Water Quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton –Buchanan – Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.
(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden – Part II 1974.
(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (15).
(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.
(8) NEN 6506 – Water – Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980.
(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.
(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978.
(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979.
(12) Standard methods for the examination of water and wastewater, 14th ed., APHA-AWWA-WPCF, 1975.
(13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979.
(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P., Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.
(15) Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. A simplified method for evaluating dose effects experiments. J. Pharm, Exp. Therap., 1949, 96, 99.
(16) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.
(17) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, 3, 793-821.
(18) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, 4, 3-32.
(19) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (F. I. Mayer, J. L. Hamelink (eds.)). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84.
(20) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J., Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.