I. 1. METODA
I.1.1 ÚVOD
Účelem této zkoušky je stanovit akutní letální toxicitu látek pro sladkovodní ryby. Pro usnadnění výběru nejvhodnější zkušební metody (statické, semistatické nebo průtokové) s cílem zajistit dostatečně konstantní koncentrace zkušební látky po celou dobu experimentu je žádoucí mít pokud možno k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě, disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.
Další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, povaha a podíl významných nečistot v procentech, přítomnost a množství přísad a rozdělovací koeficient n-oktanol/voda) je třeba vzít v úvahu při plánování zkoušky i při interpretaci výsledků.
I.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Akutní toxicitou se rozumí zřetelný nepříznivý účinek, který je v krátké době (řádově ve dnech) v organismu vyvolán expozicí látce. V této zkoušce se akutní toxicita vyjadřuje prostřednictvím střední letální koncentrace (LC50), tj. takové koncentrace látky ve vodě, která během nepřetržité expozice po určitou dobu způsobí úhyn 50 % jedinců ve zkušební skupině ryb.
Všechny koncentrace zkušební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l-1). Mohou se také vyjádřit v hmotnostních podílech (mg·kg-1).
I.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Zkoušky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, že se reakce zkušebních druhů za laboratorních zkušebních podmínek podstatně nezměnila.
Referenční látky nejsou pro tuto zkoušku stanoveny.
I.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1, s cílem prokázat, že LC50 je vyšší než tato koncentrace.
Ryby se vystaví účinku různým koncentracím zkušební látky přidané do vody po dobu 96 h. Úhyn se zaznamenává nejméně každých 24 h a je-li to možné, vypočtou se při každém pozorování koncentrace, které způsobí úhyn 50 % ryb (LC50).
I.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI
Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na úplný zkušební postup.
Mortalita v kontrolních skupinách nesmí být na konci zkoušky větší než 10 % (nebo jednu rybu, pokud se použije méně než deset ryb).
Koncentrace rozpuštěného kyslíku musí být po celou dobu zkoušky vyšší než 60 % hodnoty nasycení vzduchem.
Koncentrace zkušební látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 80 % původních hodnot koncentrací.
U látek, které se ve zkušebním médiu lehce rozpouštějí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míře netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze počáteční koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, že byly koncentrace po celou zkoušku udrženy a že kritéria jakosti byla dodržena.
U látek, které
i) jsou ve zkušebním médiu špatně rozpustné, nebo
ii) mohou vytvářet stabilní emulze nebo disperse, nebo
iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní,
musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení, avšak před nasazením testovacích ryb.
Ve všech uvedených případech musí být během zkoušky provedena další měření s cílem potvrdit skutečné expoziční koncentrace nebo dodržení kritérií jakosti.
pH by se nemá změnit o více než 1.
I.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
Mohou být použity tři postupy:
Statická zkouška:
Zkouška, při níž zkušební roztok neprotéká. (Roztoky se během celé zkoušky nemění.)
Semistatická metoda:
Zkouška, při níž zkušební roztok neprotéká, ale je pravidelně po delších časových úsecích (např. po 24 h) zcela vyměňován.
Průtoková metoda:
Zkouška toxicity, při níž se voda ve zkušebních nádržích neustále obměňuje, přičemž se zkušební látka přivádí s vodou, kterou se zkušební médium obnovuje.
I.1.6.1 Činidla
I.1.6.1.1 Roztoky zkušebních látek
Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2.
Zvolené zkušební koncentrace se připraví ředěním zásobního roztoku. Jsou-li zkoušeny vysoké koncentrace látky, lze látku rozpustit přímo v ředicí vodě.
Látky se obvykle zkouší až do meze jejich rozpustnosti. U některých látek (např. u látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokou hodnotou Po/v, nebo u látek, které ve vodě vytvářejí spíše stabilní disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajištěno, že je dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody atd.).
Pro přípravu zásobních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo pro usnadnění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouštědla či emulgátory nebo dispergátory. Použijí-li se takové pomocné látky, měly by všechny zkušební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích by měly být exponovány další kontrolní ryby. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla překročit 100 mg na l zkušebního média.
Zkouška se provede bez úpravy pH. Existují-li známky toho, že dochází k výrazné změně pH, doporučuje se zkoušku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém případě se upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ředění, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Při úpravě pH se dává přednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkušební látky v zásobním roztoku v podstatné míře změněna. Dojde-li úpravou ve zkušebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skutečnosti se zaznamenají.
I.1.6.1.2 Voda pro chov ryb a ředění
Může být použita pitná voda (nekontaminovaná potenciálně škodlivými koncentracemi chloru, těžkých kovů nebo jiných látek), kvalitní přírodní voda nebo upravená voda (viz doplněk 1). Upřednostňuje se voda o celkové tvrdosti od 10 do 250 mg·l-1 (vztaženo na CaCO3) a pH od 6,0 do 8,5.
I.1.6.2 Přístroje
Veškeré přístroje musí být vyrobeny z chemicky inertního materiálu:
— systém pro automatické ředění (pro průtokovou metodu),
— přístroj pro měření koncentrace kyslíku,
— vybavení pro stanovení tvrdosti vody,
— vhodný přístroj pro měření teploty,
— pH-metr.
I.1.6.3 Testovací ryby
Ryby by měly být zdravé a bez zjevných malformací.
Použitý druh by měl být zvolen podle praktických kritérií, jako je jejich dostupnost po celý rok, snadný chov, vhodnost pro zkoušení, relativní citlivost k chemickým látkám a jakékoli další významné ekonomické a biologické faktory. Při výběru druhu ryb by měla být také zohledněna potřeba srovnatelnosti získaných dat a mezinárodní harmonizace (1).
Seznam doporučených druhů ryb pro provedení této zkoušky je uveden v doplňku 2; dává se přednost druhům danio pruhované a pstruh duhový.
I.1.6.3.1 Chov
Ryby by měly pocházet pokud možno z jednoho chovu a měly by být stejné délky a stejného stáří. Ryby musí být chovány nejméně 12 dní v následujících podmínkách:
Obsádka:
Vhodná vzhledem k metodě (metoda s recirkulací nebo průtoková metoda) a druhu ryb.
Voda:
Viz 1.6.1.2.
Osvětlení:
Osvětlení 12 až 16 h denně.
Koncentrace rozpuštěného kyslíku:
Nejméně 80 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem.
Krmení:
Třikrát týdně nebo jednou za den; vysazení krmení 24 h před začátkem zkoušky.
I.1.6.3.2 Mortalita
Po 48hodinové aklimatizaci se zaznamená mortalita a použijí se následující kritéria:
— mortalita vyšší než 10 % populace za 7 dní: celá obsádka ryb se vyřadí,
— mortalita 5 až 10 % populace: v chovu se pokračuje dalších 7 dní. Nedojde-li k dalším případům úhynu, obsádka se použije, v opačném případě musí být vyřazena,
— mortalita menší než 5 % populace: obsádka je pro zkoušku použitelná.
I.1.6.4 Aklimatizace
Všechny ryby musí být nejméně na 7 dnů před použitím ve zkoušce nasazeny do vody stejné kvality a stejné teploty, jaká se použije při zkoušce.
I.1.6.5 Zkušební postup
Před vlastní zkouškou může být provedena předběžná zkouška s cílem získat informace o rozsahu koncentrací, které mají být použity v hlavní zkoušce.
Kromě sérií zkoušek se provede kontrolní zkouška bez zkušební látky a podle potřeby kontrolní zkouška s pomocnou látkou.
V závislosti na fyzikálních a chemických vlastnostech zkušební látky se zvolí statická, semistatická nebo průtoková zkouška, aby byla splněna kritéria jakosti.
Ryby se exponují zkušební látce za níže uvedených podmínek:
— délka expozice: 96 h;
— počet ryb: nejméně 7 na každou koncentraci;
— nádrže: vhodný objem vzhledem k doporučené obsádce;
— obsádka: pro statickou a semistatickou zkoušku se doporučuje 1,0 g na litr; v průtokovém systému je přijatelná vyšší obsádka;
— zkušební koncentrace: nejméně pět koncentrací, které jsou odstupňovány faktorem nepřevyšujícím 2,2 a které pokrývají rozsah mortality od 0 % do 100 %;
— voda: viz 1.6.1.2;
— osvětlení: osvětlení 12 až 16 h denně;
— teplota: podle druhu ryb (doplněk 2), avšak v rámci dané zkoušky kolísající v toleranci ±1 °C;
— koncentrace rozpuštěného kyslíku: ne nižší než 60 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem při dané teplotě;
— krmení: žádné.
Ryby se kontrolují po prvních 2 až 4 h a dále nejméně každých 24 h. Ryby se považují za mrtvé, jestliže při dotyku ocasní ploutve nedochází k žádné reakci a nejsou-li patrné žádné dýchací pohyby. Mrtvé ryby se odstraní, jakmile jsou zpozorovány, a úhyn se zaznamená.
Zaznamenají se všechny zjevné abnormality (např. ztráta rovnováhy, změny v plavání, chování, v dýchací funkci, v pigmentaci atd.).
Měření pH, obsahu rozpuštěného kyslíku a teploty se provádí denně.
Limitní zkouška
S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1 s cílem prokázat, že LC50 je vyšší než tato koncentrace.
Je-li povaha zkušební látky taková, že ve vodě nelze dosáhnout koncentrace 100 mg·l-1, provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).
Limitní zkouška se provede se 7 až 10 rybami a se stejným počtem ryb v kontrole (kontrolách). (Podle teorie binomického rozdělení je při použití 10 ryb a při nulové mortalitě 99,9% pravděpodobnost, že je LC50 větší než 100 mg·l-1. Při 7, 8 nebo 9 rybách znamená nulová mortalita nejméně 99% pravděpodobnost, že je LC50 větší než koncentrace použitá v limitní zkoušce.)
Dojde-li k úhynům, musí se provést celá studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky, zaznamenají se.