XIV.1.7 USPOŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY
„Uspořádáním zkoušky“ se rozumí výběr počtu zkušebních koncentrací a jejich odstupňování, počet nádrží pro každou koncentraci a počet ryb v nádrži. Uspořádání by mělo být v ideálním případě zvoleno s ohledem na:
Požadováno je stanovení statistické významnosti, s jakou má být daná velikost změny (např. změny rychlosti růstu) rozeznána, nebo přesnost, s jakou má být odhadnuta hodnota ECx (např. x = 10, 20 nebo 30, pokud možno ne méně než 10). Bez toho nelze stanovit přesný rozsah studie.
Je důležité vzít na vědomí, že uspořádání, které je optimální při použití jedné metody statistické analýzy (nejlépe využívá prostředky), není nezbytně optimální pro jinou metodu. Doporučené uspořádání pro odhad LOEC/NOEC tedy nebývá stejné jako uspořádání pro analýzu regresí.
V mnoha případech se regresní analýze dává přednost před analýzou variance, a to z důvodů diskutovaných Stephanem a Rogersem (9). Není-li však nalezen vhodný regresní model (r2 < 0,9), měl by být stanoven poměr NOEC/LOEC.

a) cíl studie;

b) metodu statistické analýzy, která bude použita;

c) dostupnost a cenu prostředků pro experiment.

XIV.1.7.1 Uspořádání pro analýzu regresí
Pro uspořádání zkoušky, která má být analyzována regresí, jsou důležité tyto zřetele:

a) koncentrace použité ve zkoušce musí v každém případě pokrývat koncentraci vyvolávající účinek (např. EC10,20,30) a rozsah koncentrací, při nichž dochází ke sledovanému účinku. Přesnost, s jakou mohou být odhadnuty koncentrace vyvolávajících účinek, bude nejlepší, bude-li koncentrace vyvolávající účinek ležet uprostřed rozsahu zkušebních koncentrací. Při výběru vhodných zkušebních koncentrací mohou být užitečné předběžné orientační zkoušky.

b) aby mohl být vytvořen uspokojivý statistický model, měla by zkouška zahrnovat alespoň jednu kontrolní nádrž a pět dalších nádrží o různých koncentracích. Podle vhodnosti by při použití solubilizačního činidla měla být vedle zkušebních skupin nasazena jedna kontrolní skupina vystavená koncentraci solubilizačního činidla použité při nejvyšší zkušební koncentraci (viz body 1.8.3 a 1.8.4);

c) může být použita vhodná geometrická nebo logaritmická řada koncentrací (10) (viz dodatek 3). Upřednostňuje se logaritmické stupňování koncentrací;

d) je-li k dispozici více než šest nádrží, měly by být další nádrže použity buď pro duplicitní stanovení, nebo by měly být použity pro koncentrace rozložené v rozsahu koncentrací tak, aby se zmenšily rozestupy mezi koncentracemi. Obě použití lze doporučit stejnou měrou.

XIV.1.7.2 Uspořádání pro odhad NOEC/LOEC analýzou variance (ANOVA)
Pro každou koncentraci by měly být nejlépe k dispozici nádrže pro duplicitní stanovení, statistická analýza by měla být provedena pro každou jednotlivou nádrž (11). Bez duplicitních nádrží není možné zohlednit jinou variabilitu mezi nádržemi, než jaká je důsledkem rozdílů mezi jednotlivými rybami. Zkušenosti ale ukazují (12), že variabilita mezi nádržemi byla velmi malá ve srovnání s variabilitou v rámci nádrže (tj. mezi rybami). Relativně přijatelnou alternativou je tedy provedení statistické analýzy pro jednotlivé ryby.
Zpravidla se použije alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 3,2.
Provádí-li se zkouška s duplicitními nádržemi, měl by být počet duplicitních kontrolních nádrží, a tedy i počet ryb, dvojnásobkem počtu ryb pro každou zkoušenou koncentraci, který by měl být pro všechny koncentrace stejný (13, 14, 15). Nejsou-li naproti tomu duplicitní nádrže použity, měl by být v kontrolní skupině stejný počet ryb jako ve skupině pro každou zkušební koncentraci.
Je-li ANOVA založena na nádržích namísto jednotlivých rybách (což by znamenalo buď ryby jednotlivě označit nebo použít „pseudospecifickou“ rychlost růstu (viz bod 2.1.2)), je nezbytné počet nádrží dostatečně znásobit, aby bylo možné stanovit odchylku pro nádrže v rámci jednotlivé koncentrace. To znamená, že by měl být počet stupňů volnosti pro chybu v analýze variance alespoň 5 (11). Jsou-li duplicitně použity pouze kontroly, existuje nebezpečí, že bude variabilita chyby vychýlena, neboť může narůstat se střední hodnotou dotyčné rychlosti růstu. Vzhledem k tomu, že rychlost růstu s největší pravděpodobností klesá s rostoucí koncentrací, povede to k nadhodnocení variability.